Summary
We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt serial
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) is een high-grade primaire hersenkanker met een mediane overleving van slechts 14,6 maanden in de mens, ondanks standaard tri-modaliteit behandeling bestaande uit chirurgische resectie, post-operatieve radiotherapie en temozolomide chemotherapie 1. Nieuwe therapeutische benaderingen zijn duidelijk nodig om overleving van de patiënten en de kwaliteit van leven te verbeteren. De ontwikkeling van meer effectieve behandeling strategieën zouden worden geholpen door dierlijke modellen van GBM die ziekte bij de mens recapituleren nog toe seriële beeldvorming om tumorgroei en respons op de behandeling te controleren. In dit artikel beschrijven we onze techniek voor de precieze stereotactische implantatie van bio-afdrukbare GBM kankercellen in de hersenen van muizen naakt resulteert in tumorxenotransplantaten dat de belangrijkste klinische kenmerken van GBM 2 recapituleren. Deze methode levert tumoren die reproduceerbaar zijn en bevinden zich in precieze anatomische locaties terwijl bioluminescentie beeldvorming naar serieel intracraniale xenograft groei en de reactie op behandelingen 3-5. Deze methode wordt ook goed verdragen door de dieren met een lage perioperatieve morbiditeit en mortaliteit.
Protocol
A. Pre-operatieve Tumor Cell Voorbereiding
- Transduceren U251 glioblastoma multiforme cellen met een lentivirale expressievector (pGreenFire, System Biosciences) om stabiel tot expressie de vuurvlieg luciferase-gen.
- Deze cellen werden gekweekt in 10 ml van Modification volledige Dulbecco van medium Eagle's medium (DMEM), dat bestaat uit DMEM aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 1% penicilline-streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren in een T75 weefselkweekfles incuberen bij 5% C0 2 en 37 ° C.
- Voer standaard celkweek, te beginnen met de cellen te wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door trypsinizing.
- Doof de trypsine met volledige DMEM, breng de oplossing in een 50 ml erlenmeyer en bepalen de cellulaire concentratie met de Coulter Counter.
- Centrifugeer de geoogste cellen in volledig DMEM gedurende 3 min bij ongeveer 3000 omwentelingen per minuut.
- Na centrifugeren van zuigenf de media waardoor slechts een pellet van cellen op de bodem van de 50 ml erlenmeyer.
- Snel werken om de cellen uitdrogen, de cellen resuspendeer in een volume van vers compleet DMEM de gewenste concentratie van 50.000 cellen / pl overgebracht in een 2 ml steriele flacon op ijs te bereiken.
- Cellen op het ijs moeten kort worden gevortexed op een lage stand om de ~ 20 min tot celadhesie te voorkomen. Cellen kunnen veilig worden gebruikt voor intracraniale implantaties tot twee uur na plaatsing op ijs.
B. orthotope Xenograft Implantatie
- Weeg naakt athymische NCR muizen (nu / nu) een basislijn, pre-implantatie vast gewicht. We meestal kies muizen 6-10 weken oud met gewichten tussen 17 en 24 gram.
- 1 uur vóór implantatie, pre-medicijnen de muis met 5 mg / kg van het niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel meloxicam via subcutane injectie als behandeling van post-operatieve pijn en ontsteking.
- Anesthetize het dier met een intraperitoneale injectie van een ketamine / xylazine mengsel bij een dosis van 140 mg / kg en 10 mg / kg.
- Controleer of de muis voldoende verdoofd door beoordeling van het dier spontane reactie op een teen pinch. Als het dier reageert op de teen knijpen, vertraging van de procedure tot de verdoving kan in werking of overwegen injecteren extra verdoving (<25% van het oorspronkelijke bedrag).
- Bereid de verdoofde muis voor positionering in de Stoelting Digital Net voor Muis Stereotactische platform (Stoelting Inc) door het inhaken van de muis snijtanden in de bijt bar van de snuit weerhouder en het aanscherpen van de neus klem over de snuit, terwijl ervoor te zorgen dat de muis het hoofd staat een niveau vliegtuig.
- Breng de beheerste muis om de stereotactische platform Stoelting, aanpassing van de positie van het dier zodat de uiteinden van het oor balk op het caudale einde van de gehoorgang. Zodra het dier craniaal naar caudale positionering is het bijstellented, zet de beet balk om de stereotactische frame. De muis moet rusten op een stevige kunststof verwarmingsplaat (Harvard Apparatus) vastgezet met tape om de Stoelting platform om feedback gestuurde temperatuurregeling tijdens de operatie te geven.
- Stel de hoogte van het oor bars als nodig is en dan vooruit het oor bars in het caudale deel van de gehoorgang, af te sluiten, zodat de muis het hoofd is in een level vliegtuig en geïmmobiliseerd op vinger. Monitor zorgvuldig op tekenen van ademnood na plaatsing van het oor bars. Draai en re-positie als het dier in nood is.
- Plaats de gesmeerde uiteinde van een rectale temperatuur probe aangesloten op de TCAT-2DF temperatuurregelaar (Harvard Apparatus) het dier de temperatuur volgen en feedback control aan de verwarmingsplaat geplaatst onder de muis om het dier lichaamstemperatuur op 36 ° C gedurende de procedure.
- Breng oogzalf om de ogen te Prevent drogen.
- Toepassing betadine oplossing voor de kruin van de muis op de incisieplaats desinfecteren zorg ervoor dat de ogen.
- Voer een teen kneep bevestigen muis bewusteloos is, levert een kleine hoeveelheid extra ketamine / xylazine (<25% van de aanvangsdosis) indien nodig.
- Reinig de braam 0,45 mm boor (Stoelting) aan de boor (Foredom Microdrill) met een alcohol pad en de boor in een glaskraal sterilisator (Germinator 500, CellPoint Scientific) gedurende 15 sec steriliseren dompelen alleen de boor in de sterilisator kralen.
- Met een steriele scalpel, een lengte 0,75 cm incisie in het midden scalp zich vanaf de ooghoogte caudaal. Bevestig visualisatie van de bregma.
- Bevestig de boor houder de Stoelting platform en plaats een boor (Foredom Microdrill) met een 0,45 mm braam boor (Stoelting) in de boorhouder, vastzetten in positie.
- Plaats de boor precies boven thij bregma en zero-de x, y, z-coördinaten van de digitale stereotactische display. Beweeg de punt van de boor naar een positie 2 mm posterior en 1,5 mm lateraal van de bregma in de rechter hersenhelft en boren in de schedel van het dier met de Foredom boor, doorboren alleen het bot. Een steriel wattenstaafje kan worden gebruikt om zachtjes trekken de randen van de incisie om visualisatie van de schedel te vergemakkelijken.
- Verwijder de boor en de boor houder van de stereotactische platform.
- Bevestig de Nanomite injector spuitpomp (Harvard Apparatus) om de stereotactische platform.
- Verwijder de cellen van ijs en ofwel voorzichtig vortex de flacon met de tumorcellen met korte pulsen of tik zachtjes tegen de flacon om resuspendeer de cellen. Opstellen 7 pi van de celsuspensie door middel van een 30 gauge 1 "lange, platte schuine naald bevestigd aan een 10 ul injectiespuit (Hamilton Spuit). Vermijd grote luchtbellen in de injectiespuit. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de eerste 6 pi van vloeistof which zal het totale volume geïnjecteerd in de muis. Kleine luchtbellen in de resterende 1 ul van geen belang. Vermijd herhaaldelijk draw-ups van de celsuspensie indien mogelijk schade aan de cellen te minimaliseren.
- Plaats de gevulde spuit in de spuit injector. Met een alcohol pad, verwijderen van de celsuspensie vloeistof die aan de punt van de naald om verontreiniging van de incisie met kankercellen die leiden tot tumor groeit in de extracraniële ruimte te voorkomen.
- Stel de injectiepomp tot 6,0 ul leveren met een snelheid van 0,5 ul / min. De 1 pi celsuspensie in de spuit na implantatie zodat de luchtbellen die vaak verzamelt in de spuit niet geïnjecteerd in het dier. Injectie van luchtbellen kan leiden tot fatale luchtembolie.
- Voer de naald in de boorgat het handhaven van de naald loodrecht (90 graden) naar de schedel. Zodra de naald heeft afgelegd de schedel, nul de Coordinates de stereotactische digitale display en duw de punt van de naald gedurende 4 min tot aan een diepte van 2,5 mm. De naald door de cortex en delen van de achterste hippocampus. De x, y, z-coördinaten van stereotactische implantatie werden gekozen om een zijkant geplaatste tumor genereren in de hersenhelft terwijl voorkomen van schade aan belangrijke hersenstructuren zoals de thalamus en de nabijheid van de ventrikels waardoor de kans van enten van de cerebrospinale vloeistof met tumorcellen die kan leiden tot ongewenste ruggenmergtumoren. Een achterste locatie ten opzichte van de bregma werd geselecteerd om de waarschijnlijkheid van een grote, lokaal gevorderde tumor zweren in de baan verkleinen. Pauze met de naald op diepte gedurende 2 minuten en vervolgens initiëren implantatie van cellen.
- Tijdens de implantatie, herhaaldelijk droog de schedel met een microchirurgische spons speer aan een tumor-bevattende vloeistof die kunnen hebben gerefluxed van de boorgat tijdens verwijderenimplantatie. Vermijd het verstoren van de naald met de microchirurgische spons. Het verwijderen van deze vloeistof moet de kans op tumor groeit in de extracraniële ruimte.
- Na injectie is voltooid, laat de naald in de hersenen ongeveer 2 minuten en vervolgens langzaam de naald te trekken over een periode van 3-4 minuten.
- Draai het oor bars en snuit weerhouder en verwijder de muis van de stereotactische apparatuur.
- Sluit het boorgat in de schedel met een steriele bot was afgezet door te wrijven was heen en weer over het boorgat van de houten eind van een steriele wattenstaafje. Blijven toepassen bot wax totdat het gat is volledig afgesloten en het bot was het afdichten van de braam in een lijn staat met de aangrenzende schedel.
- Re-benadering de randen van de incisie met steriele wattenstaafjes en veterinaire toepassing weefsellijm de wond sluiten en zorg te lijmen blootstelling aan ogen van het dier te voorkomen.
- Tot slot plaatst u de muis op een verwarming pad ingesteld op 37 °C totdat het dier hersteld bewustzijn. Transfer terug het dier naar de oorspronkelijke kooi zodra de muis is alert en responsief.
C. Bioluminescent Imaging (BLI) om tumorgroei en reactie op de behandeling te controleren
Korte instructies voor bioluminescente beeldvorming.
- Verdoven muizen eerder geïmplanteerd met tumor in een kamer met 2% isofluraan en zuurstof.
- Terwijl de muizen verdoofd, injecteer die ofwel subcutaan of intraperitoneaal met 60 ul van D-luciferine kaliumzout verdund in PBS tot een concentratie van 50 mg / ml.
- Schakel de stroom van de anesthesie bij de neus kegels in de bioluminescente imaging scanner en snel de muizen over te dragen aan de scanner plaatsen van hun snuit in de neus kegels.
- Plaats zwarte dividers tussen de muizen om het bloeden van bioluminescente signaal te beperken van een tumor met een hoge signaal intensiteit naar een aangrenzende tumor met een veel lagere signaal.
- Gebruikhet levende beeld software neem regelmatig seriële posities voor een totale duur van maximaal 30 minuten na de injectie van D-luciferine. Wij geven de voorkeur het instellen van de Blootstellingtijd op "Auto" om de waarschijnlijkheid van een onder-of overbelichte beeld te beperken. Geen enkele blootstellingstijd> 5 min zijn.
- Voer herhalen bioluminescente beeldvorming met passende tussenpozen. Seriële wekelijkse beeldvorming is een redelijke optie voor veel longitudinale experimenten testen respons op de behandeling.
- Na de overname van beelden, gebruikt u de Living Image software programma om tumoren te analyseren door het tekenen van een gebied van belang (ROI) rondom de tumor in elk beeld verworven tijdens de bioluminescente imaging sessie. Breng een tweede, kleiner gebied van belang voor de onderste flank van elke muis in elk beeld als achtergrond van belang zijnde de bioluminescent signaal van de tumor gebaseerd op de mate van achtergrond bioluminescent signaalintensiteit corrigeren. Wij geven de voorkeur het gebruik van de "Radiance" instelling in plaats van "Counts" als de outputwaarden voor bioluminescente signaal.
- Exporteer de ROI resultaten in Excel en bepaal de maximale achtergrond gecorrigeerde bioluminescente signaal voor elke muis.
- Herhaal bioluminescent imaging zoals voor seriële monitoring van tumorgroei. In onze experimenten, voeren we wekelijks BLI. Wij verkiezen bepalen van de maximale BLI signaal voor een bepaalde opnamesessie door middel frequent blootstelling gedurende 5 - 30 min na injectie van D-luciferine.
D. Representatieve resultaten
Deze stereotactische implantatie techniek is geassocieerd met een succesvolle tumor-nemen percentage van 90-100% en met lage perioperatieve mortaliteit die gewoonlijk minder dan 5%. Het risico van onbedoelde bijwerkingen is laag met deze techniek, waaronder complicaties zaaien van het ruggenmerg van tumorcellen geïmplanteerd in de ventrikels of extracraniale tumorgroei van beide zaaien van de incisie met tumorcellen of onvoldoende sluiting van het boorgat eenllowing intracraniale tumor uit te breiden door de opening in de schedel.
Ex vivo analyse van tumorxenotransplantaten aangetoond verwacht gebieden van hypoxie, verhoogde VEGF expressie en necrose. Fluorescentiemicroscopie voor groen fluorescent eiwit (GFP) stabiel tot expressie gebracht door onze GBM cellijn bleek de infiltratieve aard van deze xenografts.
Figuur 1 toont de resultaten van een typische succesvolle stereotactische implantatie van GBM cellen in de hersenen van een muis. Dit is een T2-gewogen hersen MRI-scan van een muis hersenen uitgevoerd met een 9,4 Tesla magneet 21 dagen na implantatie met de techniek hier beschreven. Figuur 1 toont een focus van de tumor in de rechter hersenhelft (contouren in het roze) het meten van 19 mm 3 dat lokaliseert de precieze coördinaten van de implantatieplaats.
Figuur 2 toont de resultaten van bioluminescent beeldvorming met de techn iques hier beschreven voor een groep van 10 muizen met stereotactisch geïmplanteerde tumoren die waren gelijkmatig gestratificeerd op basis van maximale bioluminescente intensiteit van het signaal om ofwel craniale bestraling (4 x 4 Gy dagelijkse fracties) of helemaal geen behandeling krijgen. In dit experiment blijkt dat bioluminescent imaging bestraling proliferatie van de geïmplanteerde tumoren remt, wat geen verhoging van het gedetecteerde bioluminescent signaal, het signaal aanzienlijk verhoogt in mock-bestraalde controle tumoren vanwege wildgroei van de kankercellen.
Figuur 1 (Video). Coronale MRI secties van een muis hersenen met een U251 glioblastoma multiforme tumor met contouren van de tumor volume (in het roze). De scan werd uitgevoerd met behulp van een spin echo T2 gewogen protocol op een 9,4 Tesla scanner. Klik hier om film te bekijken .
re 2 "src =" / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg "/>
Figuur 2. 10 muizen met stereotactisch geïmplanteerde glioblastoma multiforme tumoren werden behandeld met ofwel uitwendige bestraling tot 16 Gy in 4 fracties of geen behandeling. Muizen werden afgebeeld met bioluminescent beeldvorming vóór de behandeling en wekelijks na het begin van de behandeling. De grafiek geeft de relatieve bioluminescentie berekend mediane factor van verandering wanneer veelvoudverandering wordt gedefinieerd als de verhouding van huidige maximale waarde BLI voorbehandelen maximale BLI waarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode van stereotactische implantatie van kankercellen in muizen beschreven in dit document genereert reproduceerbaar tumoren die redelijkerwijs recapituleren de infiltratieve en snelle groei patroon van klinische glioblastoma multiforme 2, 6-8. Deze techniek is bijzonder geschikt voor experimenten stratificatie muizen gelijkmatig verschillende behandelgroepen waar reproduceerbare tumoren van vergelijkbare grootte en biologische eigenschappen en in specifieke anatomische locaties gewenst. Stereotactische implantatie van tumorcellen met behulp van de technieken die we beschrijven moeten gemakkelijker worden bereikt door de meeste translationeel onderzoek laboratoria 7,9-11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor Dr Andrew Hollander, Sara Davis, Lee Shuman, Tim Jenkins en Dr Xiangsheng Xu voor hun deskundige hulp. Wij erkennen de steun van dr. Ann Kennedy. BCB werd ondersteund op de Radiation Biology Training Grant C5T32CA009677. JFD werd ondersteund op de Burroughs Wellcome Career Award voor medische wetenschappers (1006792). JLB werd ondersteund door de supers subsidie (5 R25 CA140116-03). We willen graag Dr Steve Hahn wiens aanmoediging en steun heeft geholpen om ons onderzoek mogelijk te erkennen. We willen ook graag de Universiteit van Pennsylvania Nano-Bio-interface Center (NBIC) en Dr Dennis Discher bedanken voor bemoediging en nuttige opmerkingen. Wij erkennen de beeldvorming van kleine proefdieren Facility (SAIF) aan de Universiteit van Pennsylvania voor het gebruik van hun MRI en optische / Bioluminescentie Core Facilities. Deze technieken werden ontwikkeld in het kader van projecten die werden gesteund door de National Institutes of Health (RC1 CA145075 en K08 NS076548-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic platform for mouse implantation |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| Puralube Vet Ointment (ophthalmic) | Amazon.com | To prevent drying of the mouse's eyes | |
| drill holder for the stereotactic platform | Stoelting | 51681 | |
| Micromotor Electric Drill | Stoelting | 51449 | For drilling through the skull |
| .45 mm carbide drill bit | Stoelting | 514551 | |
| Sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| Glass bead dry sterilizer (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER-5287 | To sterilize metal surgical instruments |
| Mouse rectal probe | Braintree Scientific | RET-3-ISO | Compatible with the temperature controller |
| Temperature Controller (TCAT-2DF) | Harvard Apparatus | 727561 | Temperature controller to maintain animal's temperature during surgery |
| Small heating plate | Harvard Apparatus | 727617 | For use with temperature controller to warm mouse during surgery. The heating plate fits under the mouse on the stereotaxic platform. |
| Disposable Scalpels | BD Bard-Parker | 2015-11 | #10 scalpel |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | For injection of tumor cells |
| 30 gauge needles, 1" long, with flat point | Hamilton | Various | Must be compatible with the 10 μl syringe |
| Nanomite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704507 | Digital motorized syringe injector for stereotaxic device |
| Cellulose sterile surgical spear sponges | Ultracell | 40410 | To dry the surgical field |
| Bone wax | Ethicon | W31 | To seal the burr hole |
| Tissumend II synthetic absorbable tissue adhesive | Veterinary Products Laboratories | 3002931 | To seal the incision |
| Hot water pump with warming pad | Gaymar | TP-650 | Warms mice in post-operative period |
| IVIS Lumina II | Caliper Life Science | Bioluminescent imager | |
| D-Luciferin potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | Luciferin for bioluminescent imaging |
References
- Stupp, R. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro. 3, e00063 (2011).
- Shelton, L. M. A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion. J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).
- Brehar, F. M. The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain. J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Radaelli, E. Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease. Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).
- Baumann, B. C. Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy. , Submitted (2012).
- Baumann, B. C. An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP). Transl. Oncol. , Forthcoming (2012).
- Park, S. S. MicroPET/CT imaging of an orthotopic model of human glioblastoma multiforme and evaluation of pulsed low-dose irradiation. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 80, 885-892 (2011).
- Szentirmai, O. Noninvasive bioluminescence imaging of luciferase expressing intracranial U87 xenografts: correlation with magnetic resonance imaging determined tumor volume and longitudinal use in assessing tumor growth and antiangiogenic treatment effect. Neurosurgery. 58, 365-372 (2006).
- Dinca, E. B. Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy. J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).
