Summary
Nous décrivons une méthode intégrée pour la précision, l'implantation stéréotaxique de cellules humaines de glioblastome multiforme dans le cerveau des souris nude et de série subséquente
Abstract
Le glioblastome multiforme (GBM) est un cancer de haut grade du cerveau primaire avec une survie médiane de seulement 14,6 mois chez les humains, malgré norme tri-modalité de traitement consistant en une résection chirurgicale, la radiothérapie post-opératoire et la chimiothérapie témozolomide 1. De nouvelles approches thérapeutiques sont clairement nécessaires pour améliorer la survie des patients et la qualité de vie. Le développement de stratégies de traitement plus efficaces serait facilitée par des modèles animaux de GBM qui récapitulent les maladies humaines tout en permettant l'imagerie en série pour contrôler la croissance tumorale et la réponse au traitement. Dans cet article, nous décrivons notre technique d'implantation stéréotaxique précise de bio-imageables cellules cancéreuses GBM dans le cerveau des souris nude résultant de xénogreffes tumorales qui récapitulent les principales caractéristiques cliniques de GBM 2. Cette méthode donne des tumeurs qui sont reproductibles et sont situés dans des endroits précis anatomiques tout en permettant l'imagerie in vivo de marqueurs bioluminescents série surveiller intrala croissance des xénogreffes crânienne et de la réponse aux traitements de 3-5. Cette méthode est également bien toléré par les animaux avec une morbidité péri-opératoire faible et la mortalité.
Protocol
A. Préparation pré-opératoire des cellules tumorales
- Transduction des cellules U251 glioblastome multiforme avec un vecteur d'expression lentiviral (pGreenFire, Système Biosciences) pour exprimer de manière stable le gène de la luciférase de luciole.
- Ces cellules ont été cultivées dans 10 ml de modification complète de Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM), qui se compose de DMEM supplémenté avec du sérum de veau foetal à 10%, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% acides aminés non essentiels dans un flacon T75 culture tissulaire incubation à 5% C0 2 et 37 ° C.
- Effectuer culture cellulaire standard, à commencer par lavage des cellules avec du tampon phosphate salin (PBS), suivie par trypsinisation.
- Étancher la trypsine avec du DMEM complet, transférer la solution dans une fiole conique de 50 ml et déterminer la concentration cellulaire en utilisant le compteur Coulter.
- Centrifuger les cellules récoltées dans du DMEM complet pendant 3 min à environ 3000 tours par minute.
- Après centrifugation, aspirer desf le support en laissant seulement un culot de cellules au fond de la fiole conique de 50 ml.
- Travailler rapidement pour empêcher les cellules de se dessécher, remettre en suspension les cellules dans un volume de frais DMEM complet pour obtenir la concentration désirée de 50.000 cellules / ul et le transfert dans un flacon de 2 ml stérile placé sur la glace.
- Cellules sur la glace doivent être brièvement au vortex sur un réglage bas à chaque ~ 20 min pour empêcher l'adhérence cellulaire. Les cellules peuvent être utilisées en toute sécurité pour les implantations intra-crâniennes jusqu'à deux heures après la pose sur la glace.
Implantation B. xénogreffe orthotopique
- Peser nude athymiques NCr souris (nu / nu) afin d'établir une base de référence, pré-implantatoire poids. Nous avons l'habitude de sélectionner des souris 6-10 semaines d'âge avec des poids compris entre 17 et 24 grammes.
- 1 h avant l'implantation, pré-médicamenter la souris avec 5 mg / kg de la non-stéroïdiens anti-inflammatoire du méloxicam par injection sous-cutanée comme traitement de la douleur post-opératoire et de l'inflammation.
- Anesthetize l'animal avec une injection intrapéritonéale d'un mélange kétamine / xylazine à la dose de 140 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement.
- Assurez-vous que la souris est suffisamment anesthésié en évaluant la réponse spontanée de l'animal à un pincement de l'orteil. Si l'animal répond à la pincement de l'orteil, retarder la procédure jusqu'à ce que l'anesthésie ne peut prendre effet ou d'envisager l'injection de l'anesthésie supplémentaire (<25% du montant initial).
- Préparer la souris anesthésiée pour le positionnement dans le numérique Stoelting Juste pour plate-forme stéréotaxique souris (Stoelting Inc) en accrochant les dents de la souris incisives dans la barre morsure du dispositif de contention museau et serrer la pince le nez sur le museau tout en veillant à ce que la tête de la souris se trouve sur une surface plane.
- Transférer le contenu de la souris à la plate-forme stéréotaxique Stoelting, en ajustant la position de l'animal de telle sorte que les extrémités des barres d'oreilles sont à l'extrémité caudale du canal auditif. Une fois crânio-caudale à l'animal de positionnement a été adjusted, fixez la barre de morsure au cadre stéréotaxique. La souris doit être posé sur une plaque chauffante cabinet plastique (Harvard Apparatus) fixé avec du ruban adhésif à la plate-forme Stoelting de fournir régulation de la température contrôlé par rétroaction pendant la chirurgie.
- Réglez la hauteur des barres d'oreilles que nécessaire et ensuite avancer les barres d'oreilles dans la partie caudale du canal de l'oreille, leur assurant de telle sorte que la tête de la souris est dans un plan de niveau et immobilisé sur le toucher du doigt. Surveiller attentivement les signes de détresse respiratoire après la pose des barres d'oreilles. Desserrer et repositionner si l'animal est en détresse.
- Insérez la pointe lubrifiée d'une sonde de température rectale connecté au contrôleur de température TCAT-2DF (Harvard Apparatus) pour surveiller la température de l'animal et de fournir d'asservissement à la plaque chauffante placée sous la souris pour maintenir la température corporelle de l'animal à 36 ° C pendant la procédure.
- Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux à prèvent séchage.
- Appliquer la solution de bétadine au dessus de la tête de la souris pour désinfecter le site d'incision, en prenant soin d'éviter les yeux.
- Effectuer un pincement de l'orteil pour confirmer la souris est inconscient, offrant une petite quantité supplémentaire de kétamine / xylazine (<25% de la dose initiale) si nécessaire.
- Nettoyer le bit 0,45 mm de forage fraise (Stoelting) fixé à la perceuse (Foredom micro-foret) en utilisant un tampon d'alcool, puis la stérilisation du trépan de forage dans un stérilisateur à billes de verre (500 Germinator, CellPoint Scientific) pendant 15 s, que l'immersion dans l'outil de forage les perles stérilisateur.
- L'aide d'un scalpel stérile, faire une incision 0,75 cm longitudinalement dans le centre du cuir chevelu s'étendant du niveau des yeux caudale. Confirmer visualisation du bregma.
- Fixer le support de forage de la plate-forme Stoelting et placer un foret (Foredom micro-foret) avec un bit 0,45 mm de forage fraise (Stoelting) dans le porte-foret, en le fixant en position.
- Placez le foret exactement sur til bregma puis zéro sur les coordonnées x, y, z les coordonnées de l'affichage numérique stéréotaxique. Déplacer la pointe du foret de 2 mm d'une position postérieure et latérale de 1,5 mm au bregma dans l'hémisphère cérébral droit et de forage dans le crâne de l'animal avec le foret Foredom, percer uniquement l'os. Un tampon de coton stérile peut être utilisé pour rétracter légèrement les bords de l'incision afin de faciliter la visualisation de la boîte crânienne.
- Retirer le foret et le porte-foret de la plate-forme stéréotaxique.
- Fixer la seringue Nanomite injecteur pompe (Harvard Apparatus) à la plate-forme stéréotaxique.
- Retirez les piles de la glace et agiter doucement au vortex soit le flacon contenant les cellules tumorales avec des impulsions brèves ou tapotez doucement le flacon pour remettre en suspension les cellules. Dessinez une hausse de 7 pi de la suspension cellulaire à travers un calibre 30 1 "aiguille à biseau long et plat attaché à une seringue de 10 ul (Hamilton seringue). Eviter grosses bulles d'air dans la seringue. Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles d'air dans la période initiale de 6 pi de fluide which sera le volume total injecté dans la souris. Petites bulles d'air dans le dernier 1 ul ne sont pas préoccupantes. Éviter la répétition de tirage-up de la suspension cellulaire si possible pour minimiser les dommages aux cellules.
- Positionner la seringue chargée dans la seringue d'injection. L'aide d'un tampon imbibé d'alcool, enlever tout le liquide de la suspension cellulaire qui apparaît à la pointe de l'aiguille pour éviter toute contamination du site d'incision avec les cellules cancéreuses qui peuvent résulter de tumeur qui se développe dans l'espace extra.
- Réglez la pompe d'injection pour fournir 6,0 ul à un taux de 0,5 ul / min. Le 1 pl de la suspension cellulaire restant dans la seringue après implantation en sorte que les bulles d'air qui collecte fréquemment dans la seringue ne sont pas injecté dans l'animal. L'injection de bulles d'air peut entraîner une embolie gazeuse mortelle.
- Avancer l'aiguille de la seringue dans le trou de trépan maintien de l'aiguille perpendiculairement (90 degrés) sur le crâne. Une fois que l'aiguille a traversé le crâne, supprime la coordinaates sur l'affichage numérique et stéréotaxique pour avancer lentement la pointe de l'aiguille sur une période de 4 min, jusqu'à ce qu'elle atteigne une profondeur de 2,5 mm. L'aiguille traverse le cortex et l'hippocampe des portions postérieure. Les coordonnées x, y, z les coordonnées pour l'implantation stéréotaxique ont été choisis pour générer une tumeur placé latéralement au sein de l'hémisphère cérébral tout en évitant les blessures aux structures cérébrales critiques comme le thalamus et la proximité des ventricules, ce qui réduit la probabilité d'ensemencement du liquide céphalo-rachidien avec des cellules tumorales qui peuvent donner lieu à des tumeurs rachidiennes indésirables. Un emplacement postérieur par rapport au bregma a été choisie pour réduire la probabilité d'une grande tumeur localement avancé ulcérante dans l'orbite. Pause avec l'aiguille à une profondeur de 2 min, puis lancer l'implantation de cellules.
- Lors de l'implantation, sécher le crâne de manière répétée avec une lance éponge microchirurgie pour enlever tout liquide contenant de la tumeur qui a peut-être porté à reflux sur le trou de trépan lorsimplantation. Éviter de perturber l'aiguille avec l'éponge microchirurgicale. La suppression de ce liquide doit réduire le risque de tumeur qui se développe dans l'espace extra.
- Après l'injection est terminée, laisser l'aiguille dans le cerveau pendant environ 2 minutes, puis retirer lentement l'aiguille sur une période de 3-4 min.
- Desserrez les barres d'oreilles et le museau restrainer et enlever la souris de l'appareil stéréotaxique.
- Fermez le trou de trépan dans le crâne avec de la cire d'os stérile déposé par le frottement de la cire d'avant en arrière à travers le trou de trépan de la fin en bois d'un coton-tige stérile applicateur. Poursuivre l'application de cire osseuse jusqu'à ce que le trou est complètement scellé et la cire osseuse sceller le trou de trépan est de niveau avec le crâne adjacent.
- Re-rapprocher les bords de l'incision avec des cotons-tiges stériles et appliquer la colle tissulaire vétérinaire pour sceller la plaie, en prenant soin d'éviter l'exposition de la colle pour les yeux de l'animal.
- Enfin, placez la souris sur un coussin chauffant réglé à 37 °C jusqu'à ce que l'animal se réveille la conscience. Transfert de l'animal à sa cage d'origine une fois que la souris est alerte et réactif.
C. Bioluminescent Imaging (BLI) pour surveiller la croissance tumorale et la réponse au traitement
Suivi de brèves instructions pour l'imagerie bioluminescente.
- Anesthésier les souris préalablement implantées avec des tumeurs dans une chambre avec 2% d'oxygène et l'isoflurane.
- Alors que les souris sont anesthésiées, les injecter sous-cutanée ou intrapéritonéale avec 60 pl de sel de potassium de D-luciférine dilué dans du PBS à une concentration de 50 mg / ml.
- Allumez le flux de l'anesthésie pour les cônes de nez dans le scanner d'imagerie bioluminescente et transférer rapidement les souris au scanner de placer leurs museaux dans les cônes avant.
- Placez séparateurs noirs entre les souris pour limiter le saignement de signal bioluminescent d'une tumeur avec une intensité de signal élevée à une tumeur adjacente avec un signal beaucoup plus faible.
- Utilisationle logiciel image vivante, prenez fréquentes expositions de série pour une durée totale maximale de 30 minutes après le moment de l'injection de D-luciférine. Nous privilégions réglage de l'heure d'exposition sur "Auto" pour limiter la probabilité d'une image sous ou surexposée. Aucune exposition unique doit être> 5 min.
- Effectuer répéter l'imagerie bioluminescente à intervalles appropriés. Série d'imagerie par semaine est une option raisonnable pour de nombreuses expériences longitudinales testant la réponse au traitement.
- Après l'acquisition d'images, utilisez le programme Image Vivre logiciel pour analyser les tumeurs en traçant une région d'intérêt (ROI) autour de chaque tumeur dans chaque image acquise lors de la séance d'imagerie bioluminescente. Appliquer une seconde, plus petite région d'intérêt pour le flanc inférieur de chaque souris dans chaque image d'arrière-plan en tant que région d'intérêt afin de corriger le signal de bioluminescence de la tumeur sur la base de la mesure de l'intensité du signal d'arrière-plan bioluminescent. Nous préférons l'aide de la "Radiance" réglage plutôt que «compte» comme la sortieles valeurs de signal bioluminescent.
- Exporter les résultats dans Excel ROI et de déterminer le maximum de fond ajustée signal bioluminescent pour chaque souris.
- Répéter l'imagerie bioluminescente comme indiqué pour la surveillance de série de la croissance tumorale. Dans nos expériences, nous effectuons chaque semaine BLI. Nous préférons la détermination du signal maximal BLI pour une session d'imagerie donnée en prenant des expositions fréquentes au cours de 5 à 30 minutes après l'injection de D-luciférine.
D. Représentant Résultats
Cette technique d'implantation stéréotaxique est associé à une tumeur réussie taux de prise de 90-100% et la mortalité périopératoire faible qui est généralement inférieure à 5%. Le risque d'effets secondaires indésirables est également faible avec cette technique, y compris les complications telles que l'ensemencement de la moelle épinière de cellules tumorales implantées dans les ventricules, ou extracrânienne croissance tumorale soit de l'ensemencement de l'incision avec des cellules tumorales ou la fermeture inadéquate du trou de trépan unllowing tumeur intracrânienne d'étendre à travers l'ouverture dans le crâne.
Analyse ex vivo de xénogreffes tumorales démontré domaines attendus de l'hypoxie, une expression accrue de VEGF, et une nécrose. Microscopie à fluorescence de la protéine fluorescente verte (GFP) exprimé de façon stable par notre lignée cellulaire GBM a révélé la nature infiltrante de ces xénogreffes.
La figure 1 montre les résultats d'une implantation stéréotaxique réussie typique des cellules de glioblastome dans le cerveau d'une souris. Il s'agit d'un scanner du cerveau par IRM pondérée en T2 d'un cerveau de souris réalisée avec un aimant de 9,4 Tesla 21 jours après l'implantation de la technique décrite ici. La figure 1 montre un seul centre de la tumeur dans l'hémisphère droit (contour en rose) mesure 19 mm 3 qui se localise dans les coordonnées précises du site d'implantation.
La figure 2 montre les résultats de l'imagerie bioluminescente utilisant la techn iques décrit ici pour un groupe de 10 souris avec des tumeurs stéréotaxique implantés qui étaient uniformément stratifié selon l'intensité maximale du signal de bioluminescence pour recevoir soit une irradiation crânienne (4 x 4 fractions Gy par jour) ou pas de traitement du tout. Dans cette expérience, l'imagerie bioluminescente montre que la radiothérapie inhibe la prolifération des tumeurs implantées, résultant en aucune augmentation du signal détecté bioluminescent, tandis que le signal augmente sensiblement dans les tumeurs de contrôle maquette irradiés, en raison de la prolifération incontrôlée des cellules cancéreuses.
La figure 1 (vidéo). Coronales coupes IRM d'un cerveau de souris contenant une tumeur U251 glioblastome multiforme avec remodelage du volume tumoral (en rose). L'analyse a été réalisée à l'aide d'un protocole d'écho de spin pondérée en T2 sur un scanner de 9,4 Tesla. Cliquez ici pour voir le film .
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Figure 2. 10 souris avec des tumeurs implantées stéréotaxique glioblastome multiforme ont été traités soit par radiothérapie externe de 16 Gy en 4 fractions ou aucun traitement. Les souris ont été imagées avec l'imagerie bioluminescente avant le traitement et la semaine après le début du traitement. Le graphique présente bioluminescence relative calculée comme facteur de variation médiane où le changement de pliage est définie comme le rapport de la valeur maximale de courant BLI de pré-traitement BLI valeur maximale.
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Discussion
La méthode d'implantation stéréotaxique de cellules cancéreuses chez les souris décrites dans cet article génère de façon reproductible des tumeurs qui sont raisonnablement récapitulent le modèle d'infiltration et de croissance rapide du glioblastome multiforme clinique 2, 6-8. Cette technique est particulièrement bien adaptée à une stratification des expériences souris uniformément sur différents groupes de traitement où les tumeurs de taille comparable reproductibles et les propriétés biologiques et dans certains endroits anatomiques sont souhaitables. L'implantation stéréotaxique de cellules tumorales en utilisant les techniques que nous décrivons devrait être facilement réalisable par les laboratoires de recherche les plus traductionnelles 7,9-11.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants envers le Dr Andrew Hollander, Sara Davis, Lee Shuman, Tim Jenkins, et le Dr Xu Xiangsheng pour leur expertise. Nous reconnaissons l'appui du Dr Ann Kennedy. BCB a été pris en charge sur la formation Radiation Biology Grant C5T32CA009677. JFD a été pris en charge sur le prix de Burroughs Wellcome carrière pour les scientifiques médicaux (1006792). JLB a été pris en charge par la subvention hausses (5 R25 CA140116-03). Nous tenons à remercier le Dr Steve Hahn dont les encouragements et le soutien a contribué à rendre notre recherche possible. Nous tenons également à remercier l'Université de Pennsylvanie Centre de Nano-Bio Interface (NBIC) et le Dr Dennis Discher d'encouragement et des commentaires utiles. Nous reconnaissons le Fonds pour l'imagerie des petits animaux (SAIF) à l'Université de Pennsylvanie pour l'utilisation de leurs installations centrales IRM et optique / bioluminescence. Ces techniques ont été développées dans le cadre de projets qui ont été soutenus par le National Institutes of Health (RC1 CA145075 et K08 NS076548-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic platform for mouse implantation |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| Puralube Vet Ointment (ophthalmic) | Amazon.com | To prevent drying of the mouse's eyes | |
| drill holder for the stereotactic platform | Stoelting | 51681 | |
| Micromotor Electric Drill | Stoelting | 51449 | For drilling through the skull |
| .45 mm carbide drill bit | Stoelting | 514551 | |
| Sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| Glass bead dry sterilizer (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER-5287 | To sterilize metal surgical instruments |
| Mouse rectal probe | Braintree Scientific | RET-3-ISO | Compatible with the temperature controller |
| Temperature Controller (TCAT-2DF) | Harvard Apparatus | 727561 | Temperature controller to maintain animal's temperature during surgery |
| Small heating plate | Harvard Apparatus | 727617 | For use with temperature controller to warm mouse during surgery. The heating plate fits under the mouse on the stereotaxic platform. |
| Disposable Scalpels | BD Bard-Parker | 2015-11 | #10 scalpel |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | For injection of tumor cells |
| 30 gauge needles, 1" long, with flat point | Hamilton | Various | Must be compatible with the 10 μl syringe |
| Nanomite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704507 | Digital motorized syringe injector for stereotaxic device |
| Cellulose sterile surgical spear sponges | Ultracell | 40410 | To dry the surgical field |
| Bone wax | Ethicon | W31 | To seal the burr hole |
| Tissumend II synthetic absorbable tissue adhesive | Veterinary Products Laboratories | 3002931 | To seal the incision |
| Hot water pump with warming pad | Gaymar | TP-650 | Warms mice in post-operative period |
| IVIS Lumina II | Caliper Life Science | Bioluminescent imager | |
| D-Luciferin potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | Luciferin for bioluminescent imaging |
References
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