Summary
Biz çıplak farelerin ve sonraki seri beyinlerine insan glioblastoma multiforme hücrelerinin hassas, stereotaktik implantasyon için tümleşik bir yöntem tarif
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) cerrahi rezeksiyon, post-operatif radyasyon tedavisi ve kemoterapi temozolomide 1 oluşan standart üçlü tedavi şekillerinden rağmen insanlarda sadece 14.6 aylık medyan sağkalım ile yüksek dereceli primer beyin kanseri olduğunu. Yeni tedavi yaklaşımları açıkça hastaların yaşam süresini ve yaşam kalitesini artırmak için ihtiyaç vardır. Daha etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesi insan hastalık recapitulate henüz tümör büyümesini ve tedaviye yanıtı izlemek için seri görüntüleme izin GBM hayvan modelleri yardımıyla olacaktır. Bu yazıda, GBM 2 temel klinik özellikleri özetlemek tümör xenografts sonuçlanan çıplak farelerin beyinlerine biyo-resimlenebilir GBM kanser hücrelerinin hassas stereotaktik implantasyonu için bizim teknik tarif. Bu yöntem tekrarlanabilir tümörler verir ve seri içi izlemek için in vivo bioluminescent görüntüleme sağlarken hassas anatomik konumlarda bulunankranial ksenogreft büyüme ve tedavileri 3-5 yanıt. Bu yöntem aynı zamanda düşük perioperatif morbidite ve mortalite ile hayvanlar tarafından iyi tolere edilir.
Protocol
A. Ön-Operatif Tümör Hücre Hazırlanması
- Lentiviral ifade vektörü (pGreenFire, Sistem Biosciences) ile transduce U251 glioblastoma multiforme hücrelerinin stabil ateşböceği lusiferaz gen ifade etmek.
- Bu hücreler,% 10 fetal buzağı serumu,% 1 penisilin-streptomisin, ve inkübe bir T75 doku kültürü şişesi içinde% 1 esansiyel olmayan amino asitler ile takviye edilmiş DMEM oluşan Kartal ortamı (DMEM), tam Dulbecco Modifiye 10 ml içinde büyütülmüştür % 5 C0 2 ile 37 ° C
- Standart hücre kültür gerçekleştirme fosfat ile yıkama hücreleri ile başlayan salin (PBS) ile tripsinize ve ardından tamponlu.
- Tam DMEM ile tripsin Quench, 50 ml'lik bir erlene çözüm aktarmak ve Coulter Sayaç kullanılarak hücresel konsantrasyonunu belirlemek.
- Dakikada yaklaşık 3.000 devirde 3 dakika boyunca tam DMEM hasat hücreleri santrifüjleyin.
- Santrifüjlemeden sonra, bir aspire50 ml konik şişenin alt kısmında hücrelerin sadece bir pelet bırakarak f medya.
- Taze DMEM tam bir hacim içinde tekrar askıya hücreleri 50.000 hücre / ml 'den ve buz üzerine yerleştirilir, bir 2 ml steril bir şişeye transfer istenen konsantrasyon elde etmek için, kurumasını engellemek için hücrelerin hızlı bir şekilde çalışmak.
- Buz üzerinde Hücreler kısaca düşük bir ayara hücre yapışmasını önlemek için her ~ 20 dak vortekslenerek edilmelidir. Hücreler güvenle buz üzerinde yerleştirildikten sonra iki saat intrakranial implantasyonu için kullanılabilir.
B. Ortotopik Xenograftlarında İmplantasyonu
- Temel, pre-implantasyon kilo kurmak için çıplak atimik NCR fare (nu / nu) tartılır. Biz genellikle 17 ve 24 gram arasındaki ağırlıkları ile farelerin yaşı 6-10 hafta seçin.
- Implantasyondan önce 1 saat, ameliyat sonrası ağrı ve enflamasyon tedavisi için deri altı enjeksiyon yoluyla non-steroid anti-inflamatuar ilaç meloksikam 5 mg / kg ile fare ön-ilaç vermek.
- Anesthetize 140 mg / kg ve 10 mg / kg 'lik bir dozda bir ksilazin / ketamin karışımının bir intraperitoneal enjeksiyon ile hayvan.
- Fare ayak tutam hayvanın kendiliğinden tepkisi değerlendirilerek yeterli anestezi olduğunu onaylayın. Hayvan ayak tutam yanıt verirse anestezi yürürlüğe girmesi veya ek anestezi (asıl miktarının <25%) enjekte düşünebilirsiniz kadar prosedürü geciktirmek.
- Burun süzgeç acısını çubuğuna fare kesici dişleri çengel ve fare kafasına olmasını sağlarken, burun üzerinde burun kelepçe sıkarak Sadece Fare Stereotaktik platformu (Stoelting A.Ş.) için Stoelting Dijital konumlandırma için anestezi fare hazırlayın bir seviye uçağı.
- Kulak çubuklarının ipuçları kulak kanalının kaudal sonunda böylece hayvanın konumlandırma ayarlayarak, Stoelting stereotaktik platformuna ölçülü fare aktarın. Hayvanın kafatası-to-kaudal konumlandırma adjus olmuştur kezTed, stereotaktik çerçeve lokma çubuğunu sabitleyin. Fare ameliyat sırasında geribildirim kontrollü sıcaklık regülasyonu sağlamak amacıyla Stoelting platformuna bant ile sabitlenmiş bir firma plastik ısıtma plakası (Harvard Apparatus) üzerine oturtulmuş olmalıdır.
- Gerektiği gibi kulak çubuklarının yüksekliğini ayarlayın ve sonra kulak kanalı kaudal bölümünü içine kulak çubukları ilerlemek, fare kafası bir seviyede düzlemde ve parmak dokunuşu üzerine immobilize böyle onlara güvence. Kulak çubuklarının yerleştirilmesi sonrası solunum sıkıntısı belirtileri açısından dikkatle izleyin. Çözün ve hayvan sıkıntı ise yeniden pozisyon.
- Sırasında hayvanın sıcaklığını izlemek ve 36 de hayvanın vücut ısısını korumak için fare altında konumlandırılmış ısıtma plakası geri bildirim kontrolü sağlamak için tcat-2DF Sıcaklık Kontrolörü (Harvard Apparatus) bağlı bir rektal ısı probu yağlanmış ucu ° C yerleştirin prosedürü.
- Prève için gözleri oftalmik merhem uygulayınnt kurutma.
- Gözleri önlemek için dikkat çekici, kesi yeri dezenfekte etmek için fare başının üstüne betadin çözümü uygulayın.
- Fare ek ketamin / xylazine (ilk dozun <% 25), gerekirse bir miktar teslim, bilinçsiz onaylamak için bir ayak tutam gerçekleştirin.
- 0.45 mm çapak matkap ucu (Stoelting) bir alkol pedi kullanarak matkap (Foredom mikrotur) bağlı ve sonra içine yalnızca matkap daldırarak, 15 saniye boyunca bir cam boncuk sterilizatör (Germinator 500, CellPoint Bilimsel) olarak matkap sterilize temizleyin sterilizatör boncuk.
- Steril bir neşter kullanılarak, kaudal göz hizasına kadar uzanan orta-kafa derisi uzunlamasına bir 0.75 cm'lik bir kesi yapmak. Bregma görselleştirme onaylayın.
- Stoelting platforma matkap tutucu takın ve matkap tutucu bir 0.45 mm çapak matkap ucu (Stoelting) bir matkap (Foredom mikrotur) yerleştirin pozisyonda sabitleyerek.
- Tam t üzerinde matkap ucu yerleştirinO bregma ve sonra sıfır-out z dijital stereotaktik ekran koordinatları x, y,. Sadece kemik delici, bir pozisyon posterior 2 mm ve Foredom matkap ile Hayvanın kafatası içine sağ serebral hemisfer ve matkap bregma lateral 1.5 mm matkap ucu hareket ettirin. Bir steril pamuklu bez yavaşça kafatası görselleştirilmesi kolaylaştırmak için kesi kenarları geri çekmek için kullanılabilir.
- Stereotaktik platformdan matkap ve matkap tutucu çıkarın.
- Stereotaktik platforma nanomit enjektör şırınga pompası (Harvard Apparatus) takın.
- Buz hücreleri çıkarın ve yavaşça kısa darbeler ile tümör hücreleri içeren flakon veya hücreleri yeniden askıya flakon fiske ya yavaşça girdap. 10 ul şırınga (Hamilton Şırınga) bağlı bir 30 gauge 1 "uzun düz konik iğne ile hücre süspansiyonu 7 ul hazırlayın. Şırıngada büyük hava kabarcıkları kaçının. Sıvının ilk 6 ul hiçbir hava kabarcığı kalmayıncaya olun which fare içine enjekte toplam hacim olacaktır. Kalan 1 ul küçük hava kabarcıkları hiç ilgilendirmez. Hücrelerin hasarı en aza indirmek için mümkün olduğunca hücre süspansiyonu tekrar beraberlik-up kaçının.
- Şırınga enjektöre yüklü şırınga yerleştirin. Bir alkol pedi kullanarak, ekstrakraniyal uzay büyüyen tümör neden olabilir kanser hücreleri ile kesi yeri kirlenmesini önlemek için iğne ucunda görünen hücre süspansiyonu sıvının kaldırın.
- 0.5 ul / dk 'lık bir hızda 6.0 ul sağlamak için enjektör pompası ayarlayın. Implantasyondan sonra şırınga içinde kalan hücre süspansiyonu sık sık 1 ul şırınga içinde toplamak hava kabarcıkları hayvan içine enjekte edilmez olmasını sağlar. Hava kabarcıkları enjeksiyon ölümcül hava embolisi neden olabilir.
- Kafatasına iğne dik (90 derece) muhafaza burr hole içine şırınga iğne ilerletin. Iğne coordin dışarı kafatası, sıfır geçilen sonrabunun 2.5 mm arasında bir derinliğe ulaşıncaya kadar stereotaktik dijital görüntü ile ilgili ATEŞ sonra yavaşça 4 dakikalık bir süre boyunca iğne ucu ilerletmek. Iğne arka hipokampus, korteks ve bölümleri geçer. X, y, z stereotaktik implantasyon için koordinatları gibi talamus ve böylece tümör hücreleri ile beyin omurilik sıvısı tohumlama olasılığını azaltarak ventriküller yakınlık gibi kritik beyin yapılarının yaralanma kaçınarak serebral hemisferin içindeki yanal olarak yerleştirilmiş tümör oluşturmak için seçildi istenmeyen omurilik tümörleri neden olabilir. Bregma göreli bir posterior konuma yörüngeye yaralardan bir büyük, lokal ilerlemiş tümör olasılığını azaltmak için seçildi. Sonra 2 dakika süreyle derinlikte iğne ile Duraklat ve hücrelerin implantasyonu başlatabilir.
- Implantasyon sırasında sırasında çapak delikten dışarı reflaksa olabilecek herhangi bir tümör içeren sıvı kaldırmak için bir mikrocerrahi sünger mızrak ile art arda kafatası kurulayınimplantasyonu. Mikrocerrahi sünger ile iğne bozuyor kaçının. Bu sıvının çıkarılması ekstrakranial yer büyüyen tümör olasılığını azaltmak gerekir.
- Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, yaklaşık olarak 2 dakika için beyindeki iğne bırakın ve daha sonra yavaş yavaş 3-4 dakikalık bir süre boyunca iğne çıkarın.
- Kulak çubukları ve burnu süzgeç gevşetin ve stereotaktik aygıttan fareyi çıkarın.
- Steril kemik balmumu ile kafatası burr hole kapat steril pamuk uçlu aplikatör ahşap ucundan burr hole üzerinde ileri geri balmumu sürtünme tarafından yatırılır. Delik tamamen kapalı ve burr hole mühürleme kemik balmumu bitişik kafatası ile aynı hizaya gelene kadar kemik balmumu uygulayarak devam edin.
- Yeniden yaklaşık steril pamuklu çubuk ile kesi kenarları ve hayvanın gözlerine yapıştırıcı maruz önlemek için dikkat çekici, yara kapatmak için veteriner doku yapıştırıcısı uygulayın.
- Son olarak, 37 olarak ayarlanmış bir ısıtma yastığı farenizi °Hayvan kadar C bilinç kurtarır. Fare uyarı ve duyarlı bir kez orijinal kafesine geri hayvan aktarın.
C. Bioluminescent görüntüleme (BLI) Tümör Büyüme ve Tedaviye Yanıtın Monitör
Kısa talimatlar bioluminescent görüntüleme için izleyin.
- Daha önce% 2 izofluran ve oksijen bir odanın içinde tümör implante fareler uyuştur.
- Fareler anestezi olmakla birlikte, 50 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile PBS içinde sulandırılmış D-lusiferin potasyum tuzu, 60 ul ile deri altından veya intraperitoneal yoldan ya da bunların enjekte edilir.
- Bioluminescent görüntüleme tarayıcı burun konileri anestezi akışını açın ve hızlı bir şekilde burun konileri kendi snouts yerleştirerek tarayıcıya fareler aktarın.
- Çok daha düşük bir sinyal ile bitişik tümöre yüksek sinyal intensitesi ile tümör bioluminescent sinyalinin kanama sınırlamak için fareler arasında siyah bölücüler yerleştirin.
- KullanmaYaşayan Image yazılımı, D-luciferase enjeksiyon sırasında 30 dakika sonra kadar toplam süresi için sık sık seri çekimlerinin. Biz altında veya aşırı pozlanmış bir görüntü olasılığını sınırlamak için "Auto" Pozlama süresi ayarı taraftarıdırlar. Hayır tek maruziyet> 5 dakika olmalıdır.
- Uygun aralıklarla bioluminescent görüntüleme tekrar gerçekleştirin. Seri haftalık görüntüleme tedaviye yanıt test birçok uzunlamasına deneyler için uygun bir seçenektir.
- Görüntü edinimi sonra bioluminescent görüntüleme oturumu sırasında alınan her görüntü her tümör çevresindeki faiz (ROI) bir bölgede çizerek tümörleri analiz Yaşayan Image yazılımı programı kullanmak. Arka bioluminescent sinyal intensitesi derecesine göre tümörün bioluminescent sinyal düzeltmek için ilgi bir arka plan bölge olarak her görüntünün her fare alt kanadını ilgilendiren ikinci bir küçük bölgelere uygulayınız. Biz "Radiance" ayarı ziyade çıkış olarak "Counts" kullanmayı tercihbioluminescent sinyal değerleri.
- Excel'e ROI sonucu aktar ve her fare için maksimum plan düzeltilmiş bioluminescent sinyal belirler.
- Tümör büyüme seri izlenmesi için belirtilen bioluminescent görüntüleme tekrarlayın. Deneylerde, biz haftalık BLI gerçekleştirin. D-luciferase enjeksiyonundan sonra 30 dk - Biz 5 üzerinde sık sık poz alarak belirli bir görüntüleme oturum için maksimal BLI sinyal belirlenmesinde tercih.
D. Temsilcisi Sonuçlar
Bu stereotaktik implantasyon tekniği% 90-100 arasında başarılı bir tümör alacak oranı ve% 5 genellikle daha az düşük perioperatif mortalite ile ilişkilidir. Istenmeyen yan etki riski, tümör hücreleri ya da yetersiz çapak deliğin kapatılması ile kesi ya da tohum dan ventriküller, ekstra veya tümör gelişimini içine implante edilmiş tümör hücrelerinden omurilik tohum gibi komplikasyonlar dahil olmak üzere, aynı zamanda bu teknikte düşüktür BirKafatasında açıklıktan genişletmek intrakraniyal tümör llowing.
Tümör xenografts Ex vivo analizi hipoksi beklenen alanlar, artmış VEGF ekspresyonu, ve nekroz gösterdi. Stably GBM hücre hattı ile ifade yeşil floresan protein (GFP) için Floresan mikroskopi bu xenografts arasında infiltratif doğasını ortaya çıkardı.
Şekil 1, bir fare beyin içine GBM hücreleri tipik başarılı bir stereotaksik implantasyon sonuçlarını göstermektedir. Bu 21 gün burada açıklanan tekniği ile implantasyon sonrası bir 9.4 Tesla magnet ile yapılan bir fare beyninin bir T2-ağırlıklı beyin MR taraması yapılır. Şekil 1 19 mm 3 ölçüm sağ hemisfer (pembe konturlu) tümör tek bir odak ortaya Bu implantasyon site tam koordinatlar sınırlanmasına neden olur.
Şekil 2, techn kullanılarak bioluminescent görüntüleme sonuçlarını gösterir iques ya kranial radyoterapi (4 Gy x 4 günlük fraksiyon) ya da hiç tedavi için maksimum bioluminescent sinyal yoğunluğuna göre eşit derecelendirildi stereotaksi implante tümörlü 10 farelerin bir grup için buraya nitelendirdi. Bu deneyde, biyolüminesans görüntüleme sinyalini önemli ölçüde kanser hücrelerinin kontrolsüz çoğalması nedeniyle mock-ışınlanmış kontrol tümörleri olarak artan oysa radyasyon terapisi, algılanan sinyal bioluminescent herhangi bir artış ile sonuçlanan, implante edilmiş tümörlere çoğalmasını inhibe ettiğini göstermektedir.
Şekil 1 (Video). Tümör hacmi (pembe) ve şekillendirme ile U251 glioblastoma multiforme tümörü içeren bir fare beyin koronal MRG kesitleri. Tarama bir 9.4 Tesla tarayıcı üzerinde bir spin eko T2 ağırlıklı protokolü kullanılarak yapıldı. filmi görmek için buraya tıklayın .
re 2 "src =" / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg "/>
Şekil 2. Stereotaksi implante glioblastoma multiforme tümörü olan 10 farelerin eksternal radyasyon 4 fraksiyonda 16 Gy tedavisi veya hiçbir tedavi ile ya da tedavi edildi. Fare tedavi başladıktan sonra tedavi öncesinde ve haftalık bioluminescent görüntüleme ile görüntülendi. Grafik değişim kat ön-işlem maksimal BLI akımı değeri BLI maksimal değerinin oranı olarak tanımlanır medyan kat değişiklik olarak hesaplanmış göreli biyolüminesans sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda anlatılan farelerde kanser hücrelerinin stereotaktik implantasyon yöntemi tekrarlanabilir makul klinik multiformenin 2, 6-8 infiltratif ve hızlı büyüme paterni recapitulate tümörler oluşturur. Bu teknik, özellikle benzer boyutlara ve biyolojik özellikleri ve spesifik anatomik bölgelerde tekrarlanabilir tümörler arzu vardır farklı tedavi gruplarına eşit fareler katlama deneyleri için çok uygundur. Biz tarif teknikleri kullanılarak tümör hücrelerinin Stereotaktik implantasyonu en translasyonel araştırma laboratuvarları 7,9-11 tarafından kolaylıkla ulaşılabilir olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Dr Andrew Hollander, Sara Davis, Lee Shuman, Tim Jenkins, ve uzman yardımı için Dr Xiangsheng Xu minnettarız. Biz Dr Ann Kennedy destek için minnettarım. BCB Radyasyon Biyolojisi Eğitimi Hibe C5T32CA009677 tarihinde desteklenmiştir. Jfd Medical Bilim Adamları (1006792) için Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü desteklenmiştir. JLB supers hibe (5 R25 CA140116-03) üzerinde desteklenmiştir. Biz kimin teşvik ve desteği bizim araştırma mümkün kılmak yardımcı olan Dr Steve Hahn kabul etmek istiyorum. Biz de cesaret ve yararlı yorumlar için Pennsylvania Nano-Biyo Arayüz Merkezi (NBIC) ve Dr Dennis Discher Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum. Biz onların MRG ve Optik / Biyoparlaklık Çekirdek Hizmetleri kullanımı için Pennsylvania Üniversitesi Küçük Hayvan Görüntüleme Tesis (Saif) kabul etmektesiniz. Bu teknikler, Ulusal Sağlık Enstitüleri (RC1 CA145075 ve K08 NS076548-tarafından desteklenen projelerin bir parçası olarak geliştirilmiştir01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic platform for mouse implantation |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| Puralube Vet Ointment (ophthalmic) | Amazon.com | To prevent drying of the mouse's eyes | |
| drill holder for the stereotactic platform | Stoelting | 51681 | |
| Micromotor Electric Drill | Stoelting | 51449 | For drilling through the skull |
| .45 mm carbide drill bit | Stoelting | 514551 | |
| Sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| Glass bead dry sterilizer (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER-5287 | To sterilize metal surgical instruments |
| Mouse rectal probe | Braintree Scientific | RET-3-ISO | Compatible with the temperature controller |
| Temperature Controller (TCAT-2DF) | Harvard Apparatus | 727561 | Temperature controller to maintain animal's temperature during surgery |
| Small heating plate | Harvard Apparatus | 727617 | For use with temperature controller to warm mouse during surgery. The heating plate fits under the mouse on the stereotaxic platform. |
| Disposable Scalpels | BD Bard-Parker | 2015-11 | #10 scalpel |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | For injection of tumor cells |
| 30 gauge needles, 1" long, with flat point | Hamilton | Various | Must be compatible with the 10 μl syringe |
| Nanomite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704507 | Digital motorized syringe injector for stereotaxic device |
| Cellulose sterile surgical spear sponges | Ultracell | 40410 | To dry the surgical field |
| Bone wax | Ethicon | W31 | To seal the burr hole |
| Tissumend II synthetic absorbable tissue adhesive | Veterinary Products Laboratories | 3002931 | To seal the incision |
| Hot water pump with warming pad | Gaymar | TP-650 | Warms mice in post-operative period |
| IVIS Lumina II | Caliper Life Science | Bioluminescent imager | |
| D-Luciferin potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | Luciferin for bioluminescent imaging |
References
- Stupp, R. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro. 3, e00063 (2011).
- Shelton, L. M. A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion. J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).
- Brehar, F. M. The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain. J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Radaelli, E. Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease. Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).
- Baumann, B. C. Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy. , Submitted (2012).
- Baumann, B. C. An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP). Transl. Oncol. , Forthcoming (2012).
- Park, S. S. MicroPET/CT imaging of an orthotopic model of human glioblastoma multiforme and evaluation of pulsed low-dose irradiation. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 80, 885-892 (2011).
- Szentirmai, O. Noninvasive bioluminescence imaging of luciferase expressing intracranial U87 xenografts: correlation with magnetic resonance imaging determined tumor volume and longitudinal use in assessing tumor growth and antiangiogenic treatment effect. Neurosurgery. 58, 365-372 (2006).
- Dinca, E. B. Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy. J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).
