Summary
ओवो electroporation में चिकी एक तकनीक है जो एवियन भ्रूण के आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति देता है. इस तकनीक का आम अनुप्रयोगों जीन और ख्यात बढ़ाने तत्वों की कार्यात्मक विश्लेषण शामिल हैं. यह वीडियो एचएच 10 लड़की भ्रूण में न्यूरल ट्यूब electroporation को दर्शाता है. इंजेक्शन तकनीक और उचित अंडे से निपटने पर चर्चा कर रहे हैं.
Abstract
बड़े आकार और चिकन भ्रूण के बाह्य विकास के लंबे समय से यह विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण बना दिया है. आणविक जैविक तकनीक के आगमन के साथ, लड़की में जो जीन विनियमन और समारोह का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी प्रणाली बन गया है. चिकन भ्रूण के विकास में डीएनए या शाही सेना constructs electroporating, जीन या व्यक्त किया जा सकता है नीचे गिरा क्रम में vivo जीन समारोह में विश्लेषण. इसी तरह, संवाददाता constructs भाग्य मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या ख्यात जीन विनियामक तत्वों की जांच. माउस में इसी तरह के प्रयोगों की तुलना में, लड़की electroporation, जल्दी आसान और सस्ती होने के फायदे हैं. यह वीडियो पहले दर्शाता है कि कैसे eggshell में एक खिड़की बनाने के भ्रूण में हेरफेर करने के लिए. अगला, भ्रूण भारत भ्रूण नीचे इंजेक्शन स्याही की एक पतला समाधान के साथ कल्पना है. एक गिलास सुई और विंदुक विकासशील न्यूरल ट्यूब, तो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड समानांतर भ्रूण के लिए रखा जाता है और कम बिजली दालों एक पल्स जनरेटर के साथ प्रशासित रहे हैं में डीएनए और फास्ट ग्रीन डाई इंजेक्षन करने के लिए उपयोग किया जाता है. अंत में, अंडे टेप के साथ बंद है और आगे विकास के लिए एक मशीन में वापस रखा. इसके अतिरिक्त, वीडियो उचित अंडे भंडारण और हैंडलिंग से पता चलता है और भ्रूण के नुकसान के बाद electroporation की संभावित कारणों की चर्चा है.
Protocol
अंडे से निपटने
- अंडे 13 ° C में रखा जा सकता है है, एक ऊष्मायन के लिए पहले सप्ताह के लिए व्यवहार्यता की महत्वपूर्ण नुकसान (एक छोटे से शराब कूलर इस उद्देश्य के लिए आदर्श है) के बिना.
- पहले ऊष्मायन अंडे एक humidified चिकन इनक्यूबेटर 37.8 करने के लिए सेट में कमरे के तापमान, तो जगह को गर्म करने के लिए अनुमति डिग्री सेल्सियस (100 ° एफ).
- हम आम तौर पर भ्रूण ऊष्मायन शुरू है, जब भ्रूण हैम्बर्गर और हैमिल्टन चरण 10 तक पहुँच गया है से लगभग 48 घंटे electroporate.
- ऊष्मायन समय वांछित हैम्बर्गर और हैमिल्टन चरण के अनुसार भिन्न हो सकते हैं. तापमान महत्वपूर्ण और इष्टतम ऊष्मायन तापमान से विचलन है ऊष्मायन समय और कम भ्रूण व्यवहार्यता बदल जाएगा.
- अंडे, ऊष्मायन के दौरान अपने पक्ष पर रखा होना चाहिए ताकि भ्रूण ठीक electroporation के लिए तैनात किया जाएगा. भ्रूण की जर्दी के ऊपर तैरने लगते हैं और यह उपयोगी है एक पेंसिल के साथ गवाक्षन पहले अंडे के शीर्ष निशान इतनी है कि आप जानते हैं कि कहाँ करने के लिए काट जाएगा.
तैयार
- गर्म लेबोविट्ज़ एल 15 37 सी. सेंटीग्रेड मीडिया सुई में कांच capillaries खींचो. स्थिति इलेक्ट्रोड और micromanipulator और पल्स जनरेटर के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
Windowing
- बड़े बोर सुई के साथ एक सिरिंज का प्रयोग, अंडा के छोटे अंत में खोल पियर्स.
- ध्यान जर्दी के विघटन को रोकने के नीचे सुई उनका कहना है, albumin का 5ml के बारे में हटा दें.
- टेप का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ छेद सील.
- टेप का एक टुकड़ा (4x4 सेमी के बारे में) के साथ कवर अंडे के शीर्ष.
- घुमावदार कैंची का उपयोग करना, और देखभाल लेने के भ्रूण को बाधित नहीं, बस काफी बड़े में काम करने के एक खिड़की प्रदान छेद काटा.
वैकल्पिक: न्यूरल ट्यूब कल्पना करने के लिए, भ्रूण के नीचे 26 गेज सुई (रक्त अंगूठी के बाहर से भ्रूण के तहत सुई सम्मिलित) के साथ स्याही समाधान इंजेक्षन. भारत स्याही 01:05 हैंक्स या तुलनीय बाँझ बफर समाधान के साथ पतला होना चाहिए.
इंजेक्शन और electroporation
- इच्छित व्यास केशिका टिप चिमटी का उपयोग कर तोड़
- मुँह विंदुक का प्रयोग, प्लाज्मिड / फास्ट ग्रीन रंग के साथ केशिका लोड.
- आप की ओर सिर के साथ भ्रूण की स्थिति और न्यूरल ट्यूब में एक उथले कोण पर सुई डालने.
- न्यूरल ट्यूब तक डाई संपूर्ण अंतरिक्ष भरता के लुमेन में प्लाज्मिड समाधान इंजेक्षन.
नोट: टिप बड़ा तो न्यूरल ट्यूब व्यास नहीं है सावधान रहो. सामान्य में, आप अगर इष्टतम टिप आकार कितना आसान या मुश्किल यह केशिका में तरल खींच द्वारा हासिल किया गया है बताने के लिए सक्षम हो जाएगा. यदि वहाँ चरम प्रतिरोध है, खोलने शायद बहुत छोटा है और टिप फिर से टूट जाना चाहिए ऊपर. अगर वहाँ कम या कोई प्रतिरोध है, उद्घाटन बहुत बड़ी है और एक नई सुई का इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- जगह भ्रूण पर एक बाँझ एल-15 मीडिया के दो बूँदें.
- तत्काल 10-24 वोल्ट में 1 सेकंड के अंतराल पर 50 mseconds के लिए भ्रूण के दोनों ओर इलेक्ट्रोड, न्यूरल ट्यूब के समानांतर, और नाड़ी 5 बार जगह है. आप इलेक्ट्रोड के पास बुलबुले को देखने के लिए अगर यह ठीक से काम करेंगे.
- ध्यान इलेक्ट्रोड को निकालने के लिए भ्रूण के शीर्ष पर L-15 के 5 बूँदें डाल दिया है और टेप के साथ अंडा मुहर. यकीन है कि अंडे अच्छी तरह से बंद है के रूप में सुखाने भ्रूण electroporation निम्नलिखित हानि के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता है.
- इनक्यूबेटर में प्लेस वापस अंडे, खिड़की ऊपर की ओर, और जब तक वे एच एंड एच मंच वांछित तक पहुँचने सेते.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल HH10 लड़की भ्रूण की न्यूरल ट्यूब electroporation के लिए कदम गाइड द्वारा एक कदम प्रदान करता है. तकनीक दिखाने के अलावा, अंडे का भंडारण और हैंडलिंग के लिए दिशा निर्देश भी प्रदान की जाती है. इस तकनीक आनुवांशिक विश्लेषण के लिए आवेदनों की एक व्यापक रेंज है और प्रयोगों की आसानी और कम लागत उन्हें कई प्रयोगशालाओं के लिए संभव बनाता है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | ||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | ||
| Connecter cables | |||
| Micromanipulator | |||
| Dissecting scope | with large working distance | ||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | ||
| Leibovitz’s L-15 media | |||
| chicken eggs | fertilized | ||
| Curved scissors | |||
| 10 ml syringe | |||
| Large bore needle | 16-18G | ||
| Mouth pipette | |||
| India ink | |||
| Insulin syringe/syringe | |||
| Plasmid DNA | ≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
