Summary
Den overflod af neurotransmitter receptorer klynger på synapser stærk indflydelse synaptisk styrke. Denne fremgangsmåde kvantificerer fluorescens-mærkede neurotransmitterreceptorer i tre dimensioner med en enkelt-synapse opløsning i
Abstract
Synapse styrke refererer til amplituden af postsynaptiske responser på præsynaptiske neurotransmitterfrigivelse begivenheder, og har en stor indvirkning på den samlede neurale kredsløb funktion. Synapse styrke kritisk afhænger af den overflod af neurotransmitter receptorer klynger på synaptiske steder på den postsynaptiske membran. Receptorniveauer er etableret udviklingsmæssigt, og kan ændres ved hjælp af receptor handel mellem overflade-lokaliseret, subsynaptic og intracellulære pools, der repræsenterer vigtige mekanismer af synaptisk plasticitet og neuromodulation. Strenge metoder til at kvantificere synaptisk-lokaliserede neurotransmitterreceptor overflod er afgørende for at studere synaptisk udvikling og plasticitet. Fluorescens mikroskopi er en optimal tilgang, fordi det bevarer geografisk information, skelne synaptisk fra ikke-synaptiske pools, og at skelne mellem receptor befolkninger lokaliseret til forskellige typer af synapser. Den genetiske modelorganisme Caenorhabditis elegans er særlig velegnet til disse undersøgelser på grund af lille størrelse og relative enkelhed af nervesystemet, gennemsigtighed, og tilgængeligheden af stærke genetiske teknikker, der tillader undersøgelse af native synapser i intakte dyr.
Her præsenterer en fremgangsmåde til kvantificering af fluorescens-mærkede synaptiske neurotransmitterreceptorer i C. elegans. Dens primære funktion er automatiseret identifikation og analyse af enkelte synapser i tre dimensioner i multi-fly konfokal mikroskop output filer, tabulating position, volumen, fluorescensintensitet, og den samlede fluorescens for hver synapse. Denne fremgangsmåde har to vigtige fordele i forhold manuel analyse af z-plane fremspring af konfokale data. Først, fordi hver planet for konfokal datasæt er inkluderet, er der ingen data går tabt gennem z-plan projektion, typisk baseret på pixelintensitetsniveauerne gennemsnit eller maxima. For det andet, identifikation af synapser er automatiseret, men kan kontrolleres af den færdigeperimenter som dataanalyse udbytte, tillader hurtig og nøjagtig ekstraktion af data fra et stort antal af synapser. Hundredvis til tusindvis af synapser pr prøve kan let opnås, der producerer store datasæt for at maksimere statistisk styrke. Overvejelser til forberedelse C. elegans til analyse, og udførelse af konfokal billeddannelse at minimere variabilitet mellem dyr i behandlingsgrupperne er også diskuteret. Selv udviklet til analyse C. elegans postsynaptiske receptorer, denne metode er generelt anvendelig for alle typer af synaptisk-lokaliseret protein eller endog en fluorescens-signal, der er lokaliseret til diskrete klynger, puncta eller organeller.
Fremgangsmåden udføres i tre trin: 1) fremstilling af prøver, 2) konfokal billeddannelse, og 3) billedanalyse. Trin 1 og 2 er specifikke for C. elegans, mens trin 3 er generelt gældende for alle punktformet fluorescens signalet i konfokal mikrografer.
Protocol
1. Udarbejdelse af Worms for Imaging
Dette segment af protokollen er baseret på publicerede C. elegans dyrkningsteknikker 1,2 og er skitseret i figur 1..
- Vokser orme på høje pepton NGM agarplader (10 cm) podet med NA22 E. coli-bakterier indtil næsten sultede. Hvis immunfarvning, vil en plade pålideligt producere nok orme til 1 person pletten, under hensyntagen til tab undervejs, og de strenge kriterier, der anvendes til at vælge orme for imaging (se Del 2).
- Høst orme ved at hælde nogle få ml af Ddh 2 0 på pladen, hvirvlende kortvarigt og hælde væsken i en 15 ml konisk rør (Gentag om nødvendigt at overføre størstedelen af orme til røret). Pelleten i klinisk centrifuge i 3 minutter, 1000 x g. Vask bundfaldet 1-3x med ddH2O indtil supernatanten er klar til fjernelse af resterende bakterier. Anvende polypropylen overførselspipetter at fjerne supernatanterne, som orme klæber til glas(Fra dette trin fremad er det vigtigt at minimere tiden mellem trin for at undgå tab i æg levedygtighed).
- Efter den sidste vask i 5 ml basisk hypochlorit resuspender orm pellet for at lysere orme og frigivelse æg. Rock forsigtigt, og undersøge rør under et dissektionsmikroskop ca en gang i minuttet. Når omkring 50% af orme lyseres (de vises bøjet og brudt åben), opsige lyse ved at fylde røret til toppen med Egg Buffer, vende flere gange, og pelletering i 3 minutter, 1000x g. Lysis tid må ikke overstige 5 min.
- Fjern supernatanten med overdragelse pipette, og vask pellet 3x med æg Buffer.
- At adskille æg fra snavs, flyder dem på en pude af 30% saccharose i ddH2O: efter den sidste vask i trin 1.4, fjernes omhyggeligt supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml ddh 2 0. Tilsæt 5 ml sterilt 60% sucrose i Hedeselskabet 2 O, og bland godt. Spinde i klinisk centrifuge 6 min, 1000 x g. Æg samles i menisken (de vil have et uklart udseende), mens snavs vil pellet.
- Ved hjælp af en plastik overførsel pipette, suge æg i et minimalt volumen og overføre til upodet NGM agar plader. Alle æggene, der klæber til siden af røret kan skylles forsigtigt og overføres så godt. En 10 cm upodet plade pr analyseret stamme er tilstrækkelig.
- Inkubér upodet pladerne med æggene natten over (~ 16 timer) ved 20 ° C. Udluft pladen for de første par timer for at tørre det ved at lade låget lidt væk i et par timer, men sørg for at dække natten.
- Efter klækning, overføre L1 larverne til en 15 ml konisk rør i S Basal (tilføje et par ml S Basal til pladen, swirl, hældes i glasset). Pelleten i klinisk centrifuge (3 min, 1000 x g), resuspenderes i et minimalt volumen af S Basal, og overførsel til 10 cm NGM agarplader podet med NA22 bakterier. Brug 2 plader her for hver original plade fra trin 1,1. Inkuber indtil orme når den ønskede alder.
- Overvåge kulturerne en eller to gange om dagen. Hvis de er i fare of sultende, at friske NA22 plader overføre. For vildtype-N2 orme, er sult indledes med dannelsen af en linje eller en bølge af orme, der bevæger sig hen over pladen som dyrene vandrer i hobevis væk fra mad-udtømte zoner. Når denne form, vil fødevaren fuldstændigt udtømt i løbet af få timer.
- Orme er nu klar til immunfarvning eller levende billeder. Fiksering og farvning orme i suspension er optimal da store antal intakte orme kan afbildes let. Farvningsprocedurer baseret på Finney og Ruvkun protokol 3-6 er at foretrække frem for fryse-crack procedurer, fordi et stort antal orme er behov for billeddannelse.
2. Konfokal afbildning
- Montere orme på objektglas til konfokal billeddannelse. Justere densitet orme til nogle få hundrede per mikroliter. Foretag en pude af 2% agarose i S-basal omgivet af en tynd ring af vaseline for at forhindre fordampning under billeddannelse (påføres via en 3 ml sprøjte forsynet med en cut-off 25 gauge nål). Afpipetteres enfå mikroliter af ormen suspensionen på et dækglas (brug narkose hvis imaging levende orme), og sænk agarose puden på dækglasset, spredes ormene jævnt over puden.
- Vælg orme til billeddannelse. Vælge orme hvor synapserne af interesse er orienteret mod objektivlinsen med radial forskydning af ikke mere end ± 45 ° (hvor 0 ° betyder orienteret direkte mod målet). Udfør denne vurdering hurtigt (et par sekunder) for at undgå fotoblegning. Omfanget af de første kulturer er optimeret for at sikre tilstrækkelige orme vil tilfredsstille disse geometriske kriterier.
- Udfyld konfokal afbildning af prøven. Relativt flade prøver, der kan være omfattet inden omkring 14 0,4 um tykke snit giver de bedste resultater. Høj hastighed, lavt opløsning (512 x 512 pixel), er tilstrækkelige til hurtig nøjagtige dataindsamling. Undgå at mætte detektoren med store signalstyrkerne, da dette vil medføre undervurdering af fluorescenssignaler.
3. Automatiseret Identifikation og analyse af individuelle Synaptiske klynger
- Åbne multi-TIF output filer fra konfokal mikroskop bruger Volocity 4,0 (eller højere) software (PerkinElmer).
- Beskær væk områder af billedet, som ikke indeholder struktur af interesse (Billede -> Udvidet Fokus -> Vælg område af interesse ved hjælp af 'Freehand ROI' værktøj -> Handlinger -> Beskær til det valgte, figur 2A). Bemærk, Udvidet Focus giver en z-plan projektion på computerskærmen for at hjælpe din analyse, men påvirker ikke de underliggende data, det samme gælder for lysstyrke og kontrast justeringer, hvis det er nødvendigt).
- Måle længden af det område analyseret under anvendelse af linje. Længden af linien vil blive beregnet og sat til datatabellen (figur 2B).
- Identificere objekter ved hjælp af 'Objects af intensitet' filter (Mål-tilstand). Angiv en grænse, således at synaptiske klynger erfremhævet og ikke-synaptiske baggrund er ikke (figur 2C). Optagelse af en uafhængig synaptisk markør mærket med en anden farve kan hjælpe entydigt identificere synapser. Typiske synapser variere fra nogle få til nogle få hundrede voxels. Indstil tærsklen gang med en kontrolprøve, og bruge det til alle efterfølgende prøver. Tærsklingsparametre hver prøve separat, er uacceptabelt, fordi det introducerer muligheden for eksperimentatoren bias. Objekter udvælges og tabuleret automatisk (fig. 2D).
- Arranger og eksportere data. Fjerne objekter 2 eller færre voxels, da disse sædvanligvis baggrund pletter. Disse kan elimineres ved yderligere filtrering, eller under efterfølgende analyse. For at lette deres fjernelse nedstrøms, re-sortere data fil ved 'object size', så de vil alle gruppe sammen. Eksportér data i CSV-format, som kan åbnes af Microsoft Excel eller andre regnearksprogrammer. Hvert billede producerer en output fil.
- Hvis Volocity blødware er utilgængelige, alternative metoder til at analysere Z-plane projektioner af konfokale data kan udnyttes (f.eks ref. 7, eller manuel analyse ved hjælp ImageJ), selv om 3-dimensionelle oplysninger går tabt (se diskussionen).
4. Repræsentative resultater
Kvantificeringen præsenterede metode bør være i stand til at skelne mellem klynger populationer af forskellig lysstyrke og forskellige mængder. Repræsentative billeder og tilsvarende kvantitative data, præsenteret i figur 3 viser eksempler på differentiering på grundlag af disse parametre. Som en generel regel resultaterne bør svare til, hvad der er indlysende for øjet. I tilfælde af UNC-49 GABA-receptoren immunfarvning den ventrale nerve ledning C. elegans, alle dyr typisk fremstod meget ens i størrelse og modenhed, og de samlede synaptiske fluorescens værdier for en gruppe på fem orme (normaliseret til længden af nerve ledning analyseret) viste Standard Fejl værdier på omkring 10% af middelværdien 4. Genetisk mutation og andre eksperimentelle behandlinger (f.eks lægemiddeleksponering) kan ændre ikke alene volumen og intensitet, værdier og frekvens fordelinger af synaptiske klynger, men muligvis den udviklingsmæssige tidsforløbet og synkront af ormene, hvilket fører til større variabilitet. Men de kvantitative resultater bør altid afspejle, hvad der kan blive værdsat visuelt og hvis ikke, inspektion af billeder og genstande identificeret ved Volocity skulle afsløre hvor fejlen er opstået og foreslå korrigerende foranstaltninger såsom re-tærskel eller fjernelse af kulturgenstandsspor objekter.
Figur 1. Fremstillinq af synkron C. elegans kulturer. Synkrone kulturer stammer fra denne procedure, fordi C. elegans udvikling anholdelser og L1 larvestadiet i mangel af mad, og genoptages, når maden bliver indført.
Figur 2. Kvantificering af synaptisk puncta.
- Uvedkommende områder af billedet er beskåret til at reducere filstørrelser og øge specificiteten. Venstre panel viser startbilledet, midterste panel viser valgte område, højre panel viser billedet efter beskæring. Rød signal er UNC-49 GABA-receptor immunfluorescens, grønt signal er synaptobrevin-GFP (en præsynaptisk markør) udtrykt i præsynaptiske GABA neuroner 4. Klik her for at se større figur .
- En linie tegnes længden af nerve ledningen segmentet, der skal analyseres, og dens længde automatisk registreres i resultattabellen. Disse oplysninger er nødvendige for at normalisere synaptiske data på grund af længden af analyserbare nerve ledning, der kan variere flere gange, hvis orme bliver fragmenteret under farvning.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
- En tærskel anvendes til at identificere de enkelte synaptiske klynger. Venstre panel viser billedet før tærskelværdiansættelse, eksempler på forskellige tærsklingsprocesparametre niveauer er vist i separate paneler (grønt signal udeladt). Hvert identificeret objekt er afbildet på billedet som en farvet region. Bemærk korrespondancen mellem de visuelt tydelige synaptiske klynger i længst til venstre panel og de farvede regioner på den yderste højre panel. Klik her for at se større figur .
- Hver identificerede objekt er opført særskilt i resultat tabellen. Individuelle objekter kan blive valgt, og er fremhævet på billedet for inspektion, hvis det ønskes. Bemærk, at tabel indeholder oplysninger om den røde ('rhodamin') og grøn ('EGFP') kanaler, den grønne kanal oplysninger er potentielt misvisende, da genstande varidentificeret baseret udelukkende på rød fluorescens. Denne analyse kan også udføres på enkelte farvebilleder. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Repræsentative resultater Repræsentative mikrografer fra vildtype C. elegans farvet for UNC-49 GABA-receptorer før (A) og efter (B) behandling med muscimol, en GABA-receptor-agonist, der forårsager receptorer bliver nedreguleret efter lang tids eksponering. Paneler viser beskårede billeder før (til venstre) og efter (højre) tærskel og fjernelse af små baggrund pletter. (C) Plots af kvantitative synaptiske parametre for modellerne i (A) og (B): samlede fluorescens normaliseret til nerve Ledningslængde (til venstre), og kumulative sandsynlighed histogrammer af de enkelte synapser fluorescens indhold (i midten) og synapser volumen (right), viser statistisk signifikant reduktion i synaptisk indhold og omfang induceret af agonist eksponering (n = 60 synapser for ubehandlede, n = 115 synapser til muscimol-behandlede, p <0,001, Kolmogorov-Smirnov-test http://www.physics.csbsju .edu / statistik / KS-test.html ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden præsenteres her, er designet til at udtrække kvantitative multi-parameter data for store populationer af synapser i C. elegans, og samtidig maksimere konsistens inden for behandlingsgrupper. Tre funktioner bidrager til disse mål. Først immunfarvning udføres på synkrone snekkegear befolkninger at sikre, at alle dyr er den samme alder. Dette trin er kritisk på grund udviklingsmæssig regulering af ekspressionsniveauer kan tilsløre virkninger eksperimentel behandling (f.eks UNC-49 GABA-receptor immunofluorescens varierer adskillige gange under udvikling (K. Davis et al., Under forberedelse)). Derudover kan permeabilisering og fiksering være yderst variable, hvilket gør kvantitative sammenligninger vanskelig. Brug af synkroniserede kulturer minimerer denne iboende variation, forbedre pålideligheden af teknikken. Andre måder at løse denne variation indbefatter anvendelse af et andet antistof til et ubeslægtet mål, kan uafhængigt være visualiseres som en internkontrol til permeabilisering eller billeddannende GFP-mærkede proteiner i levende orme, der undgår behovet for permeabilisering helt. Men denne sidstnævnte fremgangsmåde introducerer nye problemer, fordi det endogene protein ikke længere måles direkte, så potentielle artefakter på grund af manglende sammenhæng i transgen ekspression / kopital, strukturel ændring skyldes fusionen af GFP, eller ikke-fysiologiske transgenekspression niveauer skal være betragtning. Ingen enkelt metode er perfekt, ideelt, kan underbyggende data opnås ved hjælp af flere tilgange. I denne protokol, har størrelsen af de starterkulturer blevet optimeret til at resultere i tilstrækkeligt antal faste og farvet orme til konfokal analyse. Et stort antal orme er nødvendig, fordi de geometriske kriterier, der anvendes til at vælge orme til billedbehandling er strenge, som er det andet element i den protokol, for at minimere variabilitet. Samme anatomiske struktur skal afbildes i hvert dyr (enten den mest biologisk relevante site, eller envalgt vilkårligt sted i tilfælde af bred vævsfordeling af proteinet af interesse), og at strukturen skal være orienteret mod objektivlinsen med kun mindre afvigelse på begge sider. Dette kriterium forbedrer konsistens ved at eliminere variationer i mængden af mellemliggende væv, der kan sprede excitation og emission lys, der påvirker signalstyrke. Det er vigtigt, at dette er det eneste kriterium, der anvendes til at vælge orme, da det er let at forspænde resultater baseret på forventning om et bestemt resultat. Faktisk eksperimenter udføres bedst blind hvor det er muligt. Den tredje funktion, der bidrager til effekten af denne teknik er den automatiske identifikation og kvantitativ karakterisering af synaptiske klynger i tre dimensioner ved hjælp af Volocity. Denne analyse er enkel og hurtig, kan identificere og tabulerer hundreder til tusinder af individuelle synapser for hver forsøgsbetingelse. Mere vigtigt, Volocity omfatter data fra alle planerne af flerlagsenheden confocal data stakke, snarere end at frasortere data til generering af to-dimensionale z-fremspring, der anvendes i tidligere protokoller. Nedstrøms i denne analyse, kan eksperimentelle grupper kan sammenlignes i forhold til den samlede synaptisk fluorescens pr dyr, den rumlige fordeling af synapser, og frekvens fordelinger af mængder, samlede fluorescens og maksimal fluorescens for de enkelte synapser. Disse parametre kan afsløre vigtige overgange indikerer synaptiske udvikling begivenheder, de roller udviklingsmæssige og regulatoriske proteiner, og synaptisk plasticitet.
Kvantificering af fluorescenssignaler anvendelse Volocity har anvendelser i neurobiologi ud analyse af permeabiliseret fast C. elegans prøver, er nyttige til kvantificering af et fluorescenssignal lokaliseret til stor kontrast puncta. Derfor er egnet til analyse af faste væv eller celler fra en organisme. Men, fiksering og permeabilisering fører til visualisering af den samlede synaptiske protein befolknings uanset om de er overflade-udtrykte, hvorimod receptorer i hvert fald kun den overfladeudtrykte fraktion bidrager til synaptisk styrke. Volocity-analyse kan også anvendes til at kvantificere overfladeudtrykte populationer, forudsat ikke-permeabiliserende fastgørelsesdelene betingelser anvendes. Volocity analyse vil også være nyttigt at undersøge protein dynamik i levende celler. Mange protein-domæner shuttle mellem vesikulære og ekstracellulære miljø med forskellig pH-værdien under neuronal signalering hændelser (f.eks carboxyterminalen af synaptobrevin under synaptiske vesikler frigivelse 8-10, eller de aminoterminale områder af neurotransmitterreceptorer under handel til celleoverfladen 11). Fusing pH-følsomme Ekliptiske GFP tags til disse regioner kan producere in vivo indberettere af disse overgange, der kan studeres kvantitativt ved hjælp af en Volocity tilgang. Tilsvarende, GFP-tagging af neuropeptid gener resulterer i GFP-mærkede tæt-core vesikler, der de-pletten, daDisse vesikler fusionerer med plasmamembranen 12 Volocity analyse kan være nyttige i denne forbindelse som et assay til specifik neuropeptid frigivelse in vivo. Fordelen ved Volocity analyse af alle disse indstillinger er dets evne til hurtigt at identificere og kvantificere et stort antal synapser, så subtile forskelle i deres individuelle egenskaber eller befolkningsgrupper udlodninger til dokumenteres med statistisk stringens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke A. Benham for at hjælpe med udviklingen af protokollen. Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud NS06747 til BAB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
|
|||||||||
| Table 1. Solutions. | |||||||||
References
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122, 2517-2527 (1996).
- Davis, K. M. Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Rowland, A. M. Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).
- Burbea, M. Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans. Neuron. 35, 107-120 (2002).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).
- Sankaranarayanan, S. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- McDonald, N. A. Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging. Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).
- Shakiryanova, D. Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).
