Summary
Förekomsten av neurotransmittorreceptorer klustrade vid synapser påverkar starkt synaptisk styrka. Denna metod kvantifierar fluorescensmärkta neurotransmittorreceptorer i tre dimensioner med enkel-synaps upplösning i
Abstract
Synapse styrka hänvisar till amplituden postsynaptiska svar presynaptiska evenemang neurotransmitterfrisättning, och har en stor inverkan på den totala neural krets funktion. Synapse styrka beror till stor del på det överflöd av neurotransmittorreceptorer klustrade på synaptiska ställen på postsynaptiska membranet. Receptor nivåer är etablerade utvecklingsmässigt och kan ändras genom receptor trafficking mellan yt-lokaliserad, subsynaptic och intracellulär pooler, som representerar viktiga mekanismer för synaptisk plasticitet och neuromodulering. Rigorösa metoder för att kvantifiera synaptiskt-lokal överflöd signalsubstansen receptor är viktigt att studera synaptisk utveckling och plasticitet. Fluorescensmikroskopi är en optimal lösning, då den bevarar rumslig information, och skilja synaptisk från icke-synaptiska pooler och diskriminering bland receptorpopulationer lokaliserade till olika typer av synapser. Den genetiska modellorganism Caenorhabditis elegans är särskilt väl lämpad för dessa studier på grund av den ringa storleken och den relativa enkelheten i dess nervsystemet, dess transparens, och tillgängligheten av kraftfulla genetiska tekniker, medger undersökning av nativa synapser i intakta djur.
Här presenterar vi en metod för att kvantifiera fluorescensmärkta synaptiska neurotransmittor-receptorer i C. elegans. Dess viktigaste funktion är automatiserad identifiering och analys av enskilda synapser i tre dimensioner i flera plan konfokala filer mikroskop produktionen, tabulering ställning, volym, fluorescens intensitet och total fluorescens för varje synaps. Detta tillvägagångssätt har två huvudsakliga fördelar jämfört manuell analys av z-plana projektioner av konfokala data. Först, eftersom varje plan konfokala datamängden ingår, inga data som förloras genom z-planet projektion, vanligtvis baserat på pixelintensiteten genomsnitt eller maxima. Andra, identifiering av synapser är automatiserad, men kan inspekteras av frittperimenter som dataanalysen fortskrider, vilket tillåter snabb och exakt extraktion av data från ett stort antal synapser. Hundratals till tusentals synapser per prov kan lätt erhållas, som producerar stora datamängder för att maximera statistisk styrka. Överväganden för beredning C. elegans för analys, och utför konfokal avbildning för att minimera variabiliteten mellan djur inom behandlingsgrupperna diskuteras också. Även utvecklades för att analysera C. elegans postsynaptiska receptorer, är denna metod i allmänhet är användbara för alla typer av synaptiskt-lokaliserad protein, eller faktiskt varje fluorescenssignalen som är lokaliserat till diskreta kluster, puncta eller organeller.
Ingreppet görs i tre steg: 1) beredning av prover, 2) konfokal avbildning, och 3) bildanalys. Steg 1 och 2 är specifika för C. elegans, medan steg 3 är i allmänhet tillämpliga på alla punktformig fluorescenssignal i konfokala mikrografer.
Protocol
1. Beredning av Worms för Imaging
Detta segment av protokollet är baserad på tillgänglig C. elegans odlingstekniker 1,2, och beskrivs i figur 1.
- Växer maskar på höga pepton NGM agarplattor (10 cm) med kärnor med NA22 E. coli-bakterier tills nästan svalt. Om immunfärgning kommer en platta ger ett tillförlitligt tillräckligt maskar för 1 person fläcken, med beaktande av förluster längs vägen, och de strikta kriterier som används för att välja maskar för avbildning (se del 2).
- Harvest maskar genom att hälla några ml av Ddh 2 0 på plattan, virvlande kort och hälla vätskan i en 15 ml koniskt rör (upprepa om det behövs för att överföra merparten av maskarna till röret). Pelleten i klinisk centrifug under 3 min, 1000 x g. Tvätta pelleten 1-3x med ddHaO 2 O tills supernatanten är klar för att avlägsna kvarvarande bakterier. Använd pipetter polypropylen överföring för att ta bort supematanter som maskar hålla till glas(Från detta steg framåt är det viktigt att minimera tiden mellan åtgärder för att undvika förluster i ägget livskraft).
- Efter den sista tvättningen, återsuspendera mask pellet i 5 ml alkalisk hypokloritlösning att lysera maskar och ägg release. Rock försiktigt och undersöka rören under ett dissektionsmikroskop ungefär en gång per minut. När ca 50% av maskar lyseras (de visas böjs och bryts öppen), avsluta lys genom att fylla röret till toppen med ägg buffert, vända flera gånger, och pelletering i 3 min, 1000x gram. Lys tiden får inte överstiga 5 min.
- Avlägsna supernatanten med överföringspipett och tvätta pellets 3x med ägg buffert.
- För att separera ägg från skräp, flyta dem på en kudde av 30% sackaros i ddHaO 2 O: efter den sista tvätten från steg 1,4, försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 ml ddHaO 2 0. Tillsätt 5 ml steril 60% sackaros i ddHaO 2 O, och blanda väl. Spin i klinisk centrifug 6 min, 1000x gram. Ägg samlar vid menisken (de kommer Have ett grumligt utseende), medan skräp kommer pellet.
- Med hjälp av en plast-överföringspipett suga upp ägg i en minimal volym och överföra till oympade plattor NGM agar. Alla ägg som ansluter sig till sidan av röret kan sköljas ner försiktigt och överfördes också. En 10 cm oympade plattan per analyseras stammen är tillräckligt.
- Inkubera plattorna oympade med äggen över natten (~ 16 h) vid 20 ° C. Avlufta plattan under de första timmarna för att torka det genom att lämna locket något av för några timmar, men tänk på att täcka över natten.
- Efter kläckning, överföra L1 larverna till ett 15 ml koniskt rör i S Basal (tillsätt några ml S Basal på plattan, snurra, häll rör). Pelleten i klinisk centrifug (3 minuter, 1000x g), återsuspendera i en minimal volym av S Basal, och överföring till 10 agar cm NGM plattor ympade med NA22 bakterier. Använd 2 plattor här för varje original platta från steg 1,1. Inkubera fram maskar når önskad ålder.
- Övervaka kulturerna en gång eller två gånger per dag. Om de är i fara of svälter, transfer till nya NA22 plattor. För vildtyp N2 maskar, är svält föregås av bildandet av en linje eller våg av maskar som rör sig över plattan som djur flyttar en masse från mat utarmat-zoner. När detta formulär kommer maten att vara helt slut inom några timmar.
- Maskar är nu redo för immunfärgning eller levande avbildning. Fastställande och färgning maskar i suspension är optimalt eftersom stora mängder intakta maskar kan avbildas enkelt. Färgning förfaranden som bygger på Finney och Ruvkun protokollet 3-6 är att föredra att frysa-crack förfarandena eftersom ett stort antal maskar behövs för avbildning.
2. Konfokal avbildning
- Montera maskar på bilder för konfokal avbildning. Justera tätheten av maskar till några hundra per mikroliter. Göra en dyna av 2% agaros i S-basal omgiven av en tunn ring av vaselin för att förhindra avdunstning under avbildning (appliceras via en 3 ml spruta försedd med en cut-off-25 gauge nål). Pipettera ennågra mikroliter av masken suspensionen på ett täckglas (använd bedövning vid bildbehandling levande maskar), och sänka agarosen dynan på täckglaset, sprida maskar jämnt över plattan.
- Välj maskar för avbildning. Välj maskar där synapserna av intresse är orienterade mot objektiv med radiell förskjutning av inte mer än ± 45 ° (där 0 ° betyder inriktad direkt mot målet). Utför denna bedömning snabbt (några sekunder) för att undvika fotoblekning. Omfattningen av de första kulturerna är optimerad för att säkerställa tillräckliga maskar kommer att tillfredsställa dessa geometriska kriterier.
- Fullborda konfokal avbildning av provet. Relativt plana prov som kan omfattas inom ca 14 0,4 | im tjocka sektioner ger de bästa resultaten. Hög hastighet, låg upplösning (512 x 512 pixlar) är tillräckliga för snabb exakt datainsamling. Undvik mättar detektorn med alltför signalstyrkor, eftersom detta kommer att orsaka underskattning av fluorescenssignaler.
3. Automatisk Identifiering och analys av enskilda Synaptic kluster
- Öppna flera TIF output filer från konfokalmikroskop med Volocity 4,0 (eller högre) mjukvara (PerkinElmer).
- Beskär bort delar av bilden som inte innehåller strukturen av intresse (Bild -> Extended Focus -> Välj område av intresse att använda "Freehand ROI" verktyg -> Åtgärder -> Beskär till markering, figur 2A). Observera Utökad Focus ger en z-plan projektion på skärmen för att hjälpa din analys, men påverkar inte de underliggande data, samma gäller för ljusstyrka och kontrast anpassningar vid behov).
- Mät längden på området analyseras med hjälp av linjeverktyget. Längden av linjen kommer att beräknas och adderas till den datatabell (figur 2B).
- Identifiera objekt med hjälp av "Objekt med Intensity" filter (Mått-läge). Ange en tröskel så att synaptiska kluster ärfram och icke-synaptisk bakgrunden inte (fig 2C). Införande av en oberoende synaptisk markör märkt med en annan färg kan hjälpa otvetydigt identifiera synapser. Typiska synapser varierar från några få till några hundra voxlar. Ställ in tröskelvärdet gång med ett kontrollprov, och använda den för alla efterföljande prover. Tröskling varje prov för sig är oacceptabelt, eftersom det inför risken för försöksledaren bias. Objekt väljs och tabuleras automatiskt (figur 2D).
- Ordna och exportera data. Eliminera föremål av 2 eller färre voxlar, eftersom dessa oftast bakgrunden fläckar. Dessa kan elimineras genom ytterligare filtrering, eller under efterföljande analys. För att underlätta deras avlägsnande nedströms, re-sortera datafil med "objekt storlek" så att de kommer alla grupp tillsammans. Exportera data i CSV-format, som kan öppnas av Microsoft Excel eller andra kalkylprogram. Varje bild ger ett utdatafil.
- Om Volocity mjukware är tillgänglig, alternativa metoder för att analysera Z-planet prognoser konfokala data kan användas (t.ex. ref. 7, eller manuell analys med ImageJ), även om 3-dimensionell information går förlorad (se diskussion).
4. Representativa resultat
Kvantifieringen metod som presenteras skall kunna skilja mellan kluster populationer av olika ljusstyrka och olika volymer. Representativa bilder och motsvarande kvantitativa data som presenteras i Figur 3 visar exempel på differentiering på basis av dessa parametrar. Som en allmän regel bör resultaten överensstämmer med vad som är uppenbart för ögat. I fallet med UNC-49 GABA-receptorn immunofärgning den ventrala nerven ur C. elegans, verkade alla djur normalt mycket lika i storlek och mognad, och den totala synaptiska fluorescens värden för en grupp av fem maskar (normaliserad till längden på nerven sladden analyserade) visade standardfel värden av omkring 10% av medelvärdet 4. Genetisk mutation och andra experimentella behandlingar (t.ex. läkemedel exponering) kan förändra inte bara volym och värderingar intensitet och fördelningar frekvens synaptiska kluster, men eventuellt utvecklings tid förlopp och synkronisering av maskar, vilket leder till högre variabilitet. Men de kvantitativa resultaten bör alltid återspegla vad som kan uppskattas visuellt och om inte, inspektion av bilder och objekt som identifierats av Volocity bör avslöja var felet uppstod och föreslå korrigerande åtgärder som re-tröskling eller borttagning av artefactual objekt.
Figur 1. Beredning av synkrona C. elegans kulturer. Synkrona kulturer erhålls från detta förfarande eftersom C. elegans utveckling gripanden och L1 larvstadiet i frånvaro av mat, och återupptar då mat införs.
Figur 2. Kvantifiering av synaptisk puncta.
- Ovidkommande områden av bilden beskärs för att minska filstorleken och öka specificiteten. Vänstra panelen visar startbilden visas mellersta panelen valt region visas högra bilden efter beskärning. Röd signal är UNC-49 GABA-receptorn immunofluorescens är grön signal synaptobrevin-GFP (en presynaptisk markör) uttryckt i presynaptiska GABA nervceller 4. Klicka här för att visa en större bild .
- En linje dras längden av nerven sladden segmentet som skall analyseras, och dess längd registreras automatiskt i resultattabellen. Denna information är nödvändig för att normalisera synaptiska data på grund av längden på analyserbart nerv kabel, som kan variera flera gånger om maskarna blir fragmenterade under färgning.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
- En tröskel tillämpas för att identifiera enskilda synaptiska kluster. Vänstra panelen visar bilden innan tröskling, exempel på olika tröskeljämförelseparametrar nivåer visas i separata paneler (grön signal utelämnas). Varje identifierad ändamål avbildas på bilden som en färgad regionen. Notera överensstämmelsen mellan de visuellt uppenbara synaptiska kluster i den vänstra panelen och de färgade regionerna om längst till höger panel. Klicka här för att visa en större bild .
- Varje identifierad objekt anges separat i resultattabellen. Enskilda objekt kan väljas och markeras på bilden för besiktning om så önskas. Observera att tabellen innehåller information för den röda (rodamin) och grön (EGFP ") kanaler, den gröna kanalinformationen är potentiellt missvisande eftersom föremålen varidentifieras utifrån strikt på röda fluorescens. Denna analys kan också utföras på enstaka färgbilder. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Representativa resultat Representativa mikrofotografier från vild-typ C. elegans färgats för UNC-49 GABA-receptorer före (A) och efter (B) behandling med muscimol, en GABA-receptor-agonist som orsakar receptorer blir nedregleras efter lång exponering. Paneler visar beskurna bilder före (vänster) och efter (höger) tröskling och borttagning av små bakgrund fläckar. (C) Tomter kvantitativa synaptiska parametrar för de förlagor som visas i (A) och (B): totalt fluorescens normaliseras till nerv Sladdlängd (vänster), och kumulativa histogram sannolikheten för enskilda synaps fluorescens innehåll (mitten) och synapsen volym (right), visar statistiskt signifikant minskning i synaptisk innehåll och volym inducerad av agonisten exponering (n = 60 synapser för obehandlade, n = 115 synapser för muskimol-behandlade, p <0,001, Kolmogorov-Smimov-testet http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-test.html ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteras här är utformad för att extrahera kvantitativa multi-parameterdata för stora populationer av synapser i C. elegans, samtidigt maximera enhetlighet inom behandlingsgrupper. Tre funktioner bidra till dessa mål. Först immunfärgning utförs på synkrona mask populationer för att se till att alla djur är i samma ålder. Detta steg är avgörande eftersom utvecklande reglering av uttryck nivåer kan dölja effekterna av experimentell behandling (t.ex. UNC-49 GABA-receptorn immunofluorescens varierar flera gånger under utveckling (K. Davis et al., Som en förberedelse)). Dessutom kan permeabilisering och fixering vara mycket varierande, vilket gör kvantitativa jämförelser svår. Med synkroniserade kulturer minimerar denna inneboende variabilitet förbättra tillförlitligheten av tekniken. Andra sätt att hantera denna variation inkluderar användning av en andra antikropp till en oberoende mål som kan vara självständigt visualiseras som en internkontrollera för permeabilisering, eller avbildning GFP-märkta proteiner med levande maskar, som undviker behovet av permeabilisering helt och hållet. Men detta senare metoden införs nya problem eftersom det endogena proteinet inte längre mäts direkt, så potentiella föremål på grund av inkonsekvenser i transgenexpression / antal kopior, strukturell förändring på grund av fusion av GFP, eller icke-fysiologiska transgena nivåer uttryck måste beaktas. Ingen enskild metod är perfekt, helst kan bekräftande uppgifter erhållas med hjälp av flera metoder. I detta protokoll, har storleken på startkulturer har optimerats för att resultera i tillräckligt antal fasta och färgade maskar för konfokala analys. Ett stort antal maskar nödvändig eftersom de geometriska kriterier som används för att välja maskar för avbildning är stränga, som är den andra funktionen av det protokoll för att minimera variabiliteten. Samma anatomiska struktur måste avbildas i varje djur (antingen den mest biologiskt relevant plats eller engodtyckligt vald plats i fallet med bred vävnadsfördelning av proteinet av intresse), och att strukturen skall vara orienterad mot objektivlinsen med endast obetydlig avvikelse åt endera sidan. Detta kriterium förbättrar konsistensen genom att eliminera variationer i mängden av mellanliggande vävnad som kan skingra excitation och emission ljus, påverkar signalstyrkan. Det är viktigt att detta är det enda kriteriet för att välja maskar, eftersom det är lätt att belasta resultatet baserat på förväntningar om ett visst resultat. I själva verket experiment utförs bäst blinda där så är möjligt. Den tredje funktionen som bidrar till att kraften i denna teknik är automatiserad identifiering och kvantitativ bedömning av synaptiska kluster i tre dimensioner med hjälp av Volocity. Denna analys är enkel och snabb, med förmåga att identifiera och tabulering hundratals till tusentals individuella synapser för varje experimentbetingelse. Ännu viktigare, innefattar Volocity data från alla planen hos multi-planet Confocal uppgifter staplar Snarare än att förkasta data för att alstra den 2-dimensionella z-utsprång som används i tidigare protokoll. Nedströms av denna analys kan experimentella grupper jämföras med avseende på den totala synaptiska fluorescens per djur, den rumsliga fördelningen av synapser, och fördelningar frekvens volymer, totalt fluorescens och maximal fluorescens för enskilda synapser. Dessa parametrar kan avslöja viktiga övergångar visar synaptiska utveckling händelser, roller utvecklings-och reglerande proteiner, och synaptisk plasticitet.
Kvantifiering av fluorescens signaler med hjälp av Volocity har tillämpningar inom neurobiologi efter analys av permeabiliserade fasta C. elegans prover, som är användbar för kvantifiering av alla fluorescerande signal lokaliserad till hög kontrast puncta. Därför är det lämpligt för analys av fixerad vävnad eller celler från en organism. Leder dock fixering och permeabilisering till visualisering av totalt synaptisk protein befolkningenar oberoende av om de är ytuttryckta, medan för receptorer åtminstone bidrar endast den ytuttryckta fraktionen till synaptisk styrka. Volocity-baserad analys kan också användas för att kvantifiera ytuttryckta populationer, som icke-permeabiliserande fixering förhållanden användes. Volocity analys kommer också att vara användbara för att studera protein-dynamik i levande celler. Många protein-domäner skytteln mellan vesikulära och extracellulära miljöer med olika pH under neuronala signaleringshändelser (t.ex. karboxiterminalen av synaptobrevin under synaptiska 8-10 vesikel frisättning, eller amino-domänerna terminala hos signalsubstans-receptorer under handel till cellytan 11). Fusing pH-känsliga ekliptiska GFP taggar till dessa regioner kan producera in vivo uppgiftslämnare i dessa övergångar som kan studeras kvantitativt med hjälp av en Volocity metod. Likaså GFP-märkning av neuropeptid gener resulterar i GFP-märkta tät kärna blåsor som de-fläcken somDessa vesiklar säkring med plasmamembranet 12, Volocity analys kan vara användbara i detta sammanhang som en analys för specifik neuropeptid frigivning in vivo. Fördelen med Volocity analyser i alla dessa inställningar är dess förmåga att snabbt identifiera och kvantifiera ett stort antal synapser, så subtila skillnader i deras individuella egenskaper eller fördelningar befolkning som ska bevisas med statistisk stringens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka A. Benham för att hjälpa med utvecklingen av protokollet. Detta arbete har finansierats av NIH anslag NS06747 till Bab
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
|
|||||||||
| Table 1. Solutions. | |||||||||
References
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122, 2517-2527 (1996).
- Davis, K. M. Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Rowland, A. M. Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).
- Burbea, M. Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans. Neuron. 35, 107-120 (2002).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).
- Sankaranarayanan, S. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- McDonald, N. A. Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging. Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).
- Shakiryanova, D. Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).
