Summary
A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), um canal de cloreto epitelial, tem sido relatado para interagir com várias proteínas e regulam importantes processos celulares, entre eles os CFTR PDZ motivo mediadas-interacções têm sido bem documentados. Este protocolo descreve métodos desenvolvidos para montar um macromolecular CFTR PDZ-dependente sinalização complexo
Abstract
A fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR), um canal de cloreto localizados principalmente nas membranas apicais das células epiteliais, desempenha um papel crucial na homeostasia de fluidos transepitelial 1-3. CFTR tem sido implicado em duas doenças principais: fibrose cística 4 (CF) e secretora diarreia 5. Na FC, a síntese ou a actividade funcional do CFTR Cl-canal é reduzida. Esta doença afecta cerca de 1 em 2500 caucasianos nos Estados Unidos 6. Actividade CFTR excessiva também tem sido implicado em casos de toxina induzida por diarreia secretória (por exemplo, por toxina da cólera e enterotoxina calor coli estável E.) que estimula a produção de cAMP ou cGMP no intestino 7.
Evidências sugerem a existência de interações físicas e funcionais entre CFTR e um número crescente de outras proteínas, incluindo os transportadores, canais iônicos, receptores, quinases, fosfatases, sinalmoléculas ing, e os elementos do citoesqueleto, e estas interacções entre CFTR e as suas proteínas de ligação têm sido mostrados para ser criticamente envolvidos na regulação mediada por CFTR transporte de iões transepitelial in vitro e também in vivo 8-19. Neste protocolo, vamos nos concentrar apenas sobre os métodos que auxiliam no estudo das interações entre CFTR cauda carboxilo terminal, que possui um motivo de ligação às proteínas [referido como PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], e um grupo de andaime proteínas, que contêm um módulo de ligação específica referida como domínios PDZ. Até agora, várias proteínas diferentes PDZ andaime têm sido relatados para se ligar ao terminal carboxilo da cauda de CFTR, com afinidades diferentes, tais como NHERF1 e NHERF2 e PDZK1 e PDZK2, CAL (CFTR-associated ligando), Shank2, e agarrar 20-27. O motivo PDZ dentro CFTR que é reconhecido pelo PDZ andaime proteínas são os últimos quatro aminoácidos no terminal C (ie, 1477-DTRL-1480 em CFTR humano) 20. Curiosamente,CFTR pode ligar mais do que um domínio PDZ de ambos os NHERFs e PDZK1, embora com diferentes afinidades 22. Este multivalência com respeito à ligação CFTR foi mostrado para ser de importância funcional, sugerindo que as proteínas PDZ andaime pode facilitar a formação de complexos macromoleculares CFTR sinalização para a sinalização específicas / selectiva e eficaz em células 16-18.
Vários ensaios bioquímicos têm sido desenvolvidos para estudar CFTR-envolvendo interacções proteína, tais como co-imunoprecipitação, suspenso ensaio, pares ensaio de ligação, por pares de ensaio colorimétrico de ligação, e doseamento macromolecular montagem complexa 16-19,28,29 . Aqui vamos nos concentrar sobre os procedimentos detalhados de montagem de um PDZ motivo dependente da CFTR macromolecular contendo complexo in vitro, que é usado amplamente por nosso laboratório para estudar proteína-proteína ou domínio domínio interações envolvendo CFTR 16-19,28,29.
Protocol
1. Expressão e Purificação de Proteínas de Fusão recombinantes Tagged em bactérias
- Amplificar regiões definidas do C-caudas (os últimos 50-100 aminoácidos contendo os motivos PDZ em C-terminal) para CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR, e NHERFs (comprimento completo ou PDZ1 ou PDZ2 domínios ) por metodologia de PCR.
- Clonar os produtos de PCR em pGEX4T-1 vector para GST-proteínas de fusão (tal como GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-C2 vector para MBP de fusão de proteínas (tais como MBP-β 2 AR CT, MBP-CFTR CT ), e pET30 para His-S-proteínas de fusão (como o seu-S-CFTR CT, His-S-PDZK1).
- Transformar num E. protease deficiente coli estirpe (BL21-DE3) para minimizar a degradação da proteína recombinante possível.
- Crescer a cultura durante a noite a 37 ° C em meio Luria-Bertani meio (pH 7,0) contendo antibióticos apropriados (tais como a ampicilina ou canamicina). Dilui-se a cultura durante a noite a 1:10 e crescer durante mais 2 h, a 37 ° C. Emduzir com 0,5-1 m M IPTG para a próxima 4 horas a 30 ° C. Sedimentar as células por centrifugação a 8000 × g durante 10 min a 4 ° C.
- Lisar as células em tampão de sacarose (50 m M de Tris-HCl, pH 8,0, 1 m M de EDTA, 1 m M de PMSF, e 10% de sacarose) contendo lisozima (1 mg / mL), Triton 0,2% X-100, e protease inibidores. Use 20 mL de sedimento de células proveniente de 1 L de cultura.
- Misturar num agitador rotativo durante 30 min a 4 ° C.
- Girar a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante claro.
- Para o sobrenadante claro, adicionar 1 mL de resina nas seguintes / agarose (suspensão de 50% em tampão de sacarose):
- Pérolas de glutationa agarose para proteínas de fusão GST.
- Contas Talon para His-S proteínas de fusão.
- Amilose resina para proteínas de fusão MBP.
- Mistura-se durante 4 horas a 4 ° C em um agitador rotativo.
- Lavar os grânulos por ressuspensão em PBS 1x (15 mL), misturando durante 2 min, girando a 800 × g durante 2 min, e descartar o sobrenadante. Repita este passo para seis vezes.
- Eluir a proteína a partir das pérolas usando tampão de eluição respectivo (2 mL de tampão de eluição por 1 ml de esferas).
- Tampão de eluição para as proteínas de fusão GST: 25 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M de NaCl, e 20 m M glutationa reduzida.
- Tampão de eluição de proteínas sua fusão: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 500 m M de NaCl, e 200 m M imidazol.
- Tampão de eluição para proteínas de fusão MBP: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M de NaCl, 1 m M de EDTA, 1 m M de DTT, e 10 m M maltose.
- Dialisar as proteínas eluídas contra 2 L de 1x PBS a 4 ° C (para evitar a degradação da proteína possível). Alterar PBS a cada 4 horas, durante quatro vezes. Concentra-se a proteína utilizando um filtro de Centricon (10.000 cutoff MW, Millipore) e armazenada como pequenas alíquotas a -80 ° C.
- Detarminho concentração da proteína pelo método de Bradford. Avaliar a qualidade de proteína por SDS-PAGE utilizando BSA como padrão. Se a integridade da proteína não for satisfatório, os processos de purificação secundários, tais como filtração em gel ou de permuta iónica podem ser utilizados. (Por exemplo, utilizou-se um G-75 coluna de Sepharose para purificar ainda mais GST-proteína de fusão).
2. Cultura de Células e Preparação lisado celular
- Cultura rim de hamster bebé (BHK) que de forma estável sobre-expresso CFTR-wt e CFTR-his10 ou células BHK que transitoriamente sobre-express-Flag LPA 2-peso ou Bandeira-LPA 2-ΔSTL e Madin-Darby rim canino (MDCK ) as células que expressam de forma estável sobre-MRP2 em meio essencial mínimo de Eagle (MEM) contendo 10% de soro fetal de vitelo e penicilina / estreptomicina em frascos de poliestireno a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Cultura de rim embrionário humano 293 (HEK293) células que de forma estável sobre-expresso CFTR-wt e CFTR-his10 em Dulbecco'Média s modificado de Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e penicilina / estreptomicina, em frascos de poliestireno a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Lisar as células em tampão de lise (PBS - 0,2% de Triton-X-100 suplementado com uma mistura de inibidores de protease contendo 1 M de fluoreto de fenilmetilsulfonil m, 1 ug / ml de aprotinina, 1 ug / mL de leupeptina, 1 ug / mL de pepstatina); utilização 500 uL de tampão de lise para cada placa de Petri de 60 mm, e 1000 uL de tampão de lise para cada placa de Petri de 100 mm.
- Balançar a célula lisados durante 20 min a 4 ° C, e remover o material insolúvel por centrifugação a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford.
3. Em Assembléia Vitro de um complexo macromolecular contendo CFTR (CFTR-PDZK1-MRP4)
- Em 200 uL de tampão de lise (PBS - 0,2% de Triton-X 100 + inibidores da protease), adicionar 20 ug de GST-purificada MRP4-C-terminal50 aa (CT50) proteína de fusão.
- Adicionar várias quantidades (0-40 ug) de Purificou His-S-PDZK1 proteína de fusão.
- Misturar as duas proteínas num misturador rotativo a 22 ° C durante 1-2 h.
- Adicionar 20 pérolas de glutationa microlitro (50% de lama) na mistura de proteínas, e continuar a misturar por mais 1 h. Este passo é também referido como pares de ligação.
- Durante este tempo, preparar os lisados de células HEK293 que superexpressam a bandeira-CFTR (em peso) como acima descrito no Passo 2).
- Lavar o complexo duas vezes com tampão de lise. Girar a 800 × g durante 1 min para cada lavagem e aspirar cuidadosamente o sobrenadante após cada lavagem. Tenha cuidado para não sugar as contas no fundo.
- Adicionar os preparados acima HEK293 lisados de células para os grânulos, e misturar suavemente a 4 ° C durante 3 h (ou durante a noite).
- Lavar os grânulos extensivamente três vezes com tampão de lise, conforme descrito no Passo 3,6).
- Eluir as proteínas utilizando 30 uL Tampão de amostra (5 ×): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), glicerol a 50%, SDS a 2%, e 0,1% de azul de bromofenol; contendo 5% de β-mercaptoetanol.
- Incubar a 37 ° C banho de água durante 10-15 min, e giram a 5000 × g durante 30 s para precipitar os grânulos.
- Carregar todo o eluído em gel de 4-15%.
- Executar SDS-PAGE para cerca de 30-40 min.
- Transferir bandas de proteína para a membrana PVDF, durante 1,5 horas.
- Bloquear a membrana em TBS-Tween contendo gordura do leite a 5% não.
- Incubar a membrana com o anticorpo primário (tais como anti-CFTR IgG, R1104) a 4 ° C, durante a noite.
- Lava-se a membrana com TBS-Tween durante 5 min, seis vezes.
- Incubar a membrana com anticorpo secundário (tal como o anticorpo de cabra anti-rato conjugado com HRP nd 2) durante 45 min a 22 ° C.
- Lava-se a membrana com TBS-Tween durante 5 min, seis vezes.
- Visualizar as bandas de proteínas através de ECL.
- Os dados representativos são mostrados na Figura 1.
Um exemplo de CFTR contendo complexo macromolecular de sinalização que foi montado in vitro é mostrado na Figura 1. Um complexo macromolecular foi formado entre MRP4 C-terminal 50 aminoácidos (MRP4-CT50) e PDZK1, e de comprimento completo CFTR (Figura 1, parte inferior). A formação do complexo aumentou dose-dependente com quantidades crescentes de proteína do intermediário, PDZK1 (Figura 1, parte inferior) 18.
Figura 1. Uma representação pictórica do ensaio complexo macromolecular (topo). Um complexo macromolecular foi detectada in vitro com três proteínas (GST-MRP4-CT50, His-S-PDZK1, e-Flag CFTRwt) de uma forma dependente da dose (inferior) 18.
| CFTR-NHERF2-LPA 2 (ref. 15) | CFTR-PDZ proteínas-MRP 2 (ref. 17) | CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16) | ||
| Contas de afinidade | Resina de amilose | S-proteína de agarose | Resina de amilose | Glutationa agarose |
| Purificou-proteína-1 | MBP β-2 AR CT | His-S-CFTR CT | MBP-CFTR CT | GST-MRP4 CT |
| Purificou-2 de proteína | GST-NHERF1 | GST-NHERF2 | GST-PDZ proteínas | His-S-PDZK1 |
| Proteína purificada-3 (ou lisados de células) | CFTR-wt ou CFTR-his10 (BHK ou lisados de células HEK) | BandeiraLPA-2-em peso ou bandeira-LPA 2-ΔSTL (lisados de células BHK) | MRP2 (lisados de células MDCK) | Purificou-Flag CFTR-wt ou CFTR-his10 (ou lisados de células) |
| Anticorpo | Anti-IgG CFTR | Anti-Flag HRP | Anti-IgG MRP2 | Anti-Flag HRP |
Resumo Tabela 1. De vários complexos de CFTR contendo macromoleculares montadas in vitro.
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Discussion
Neste protocolo que demonstraram um método para a montagem in vitro e detecção de um complexo macromolecular CFTR contendo sinalização utilizando proteínas purificadas (ou fragmentos de proteínas) e / ou lisados celulares como relatado anteriormente 16-19,29,30. Para alcançar melhores resultados os seguintes pontos críticos durante o processo de preparação requerem especial atenção:
- É importante que o pH do tampão de eluição ser ajustado para 8,0 após a adição de glutationa reduzida quando purificação da proteína de fusão GST-conforme descrito no passo 1). O pH pode ser tão baixo como 3,0 após a adição de glutationa reduzida. Se o pH não é ajustado antes da eluição, a eficiência de eluição é drasticamente reduzida.
- Quando a proteína é eluida a partir dos grânulos, que necessitam de ser dialisada imediatamente, caso contrário, a proteína purificada pode sair da solução. Se a diálise da proteína não é possível logo após o processo de eluição, não eluir a proteína e deixá-los com the de agarose / grânulos.
- É altamente recomendado que você não ferver as amostras CFTR contendo complexos macromoleculares preparadas para Western blotting como CFTR agregação é um problema comum. Em vez disso, as amostras devem ser aquecida a 37 ° C durante 10-15 minutos antes carregado no gel.
- Para o complexo de proteína com a interacção de afinidade baixa, o immunoblot podem ser visualizados usando SuperSignal Oeste Femto (ou Pico) Substrato sensibilidade máxima (Pierce) para aumentar o sinal.
A técnica aqui demonstrados fornece um ensaio conveniente e reprodutível para bioquimicamente definir uma CFTR contendo complexo de proteína terciário. Existem várias maneiras de montar o em complexos macromoleculares in vitro CFTR, conforme descrito na Tabela-1.
- A fim de obter resultados convincentes, um deve tentar montar o complexo em ambos os sentidos, isto é, I) CFTR - PDZ andaime proteína (s) - a terceira proteína, ii) proteína do terceiro - PDZ proteína andaime (s) - CFTR.
- A fim de demonstrar o ZDP motivo-dependência da formação de macromoléculas complexo, CFTR-his10 (CFTR-his10 contém 10 Seus resíduos na cauda C-terminal; esta proteína tem um motivo PDZ interna e não pode ligar NHERFs 29), proteínas com a sua motivos PDZ mutado ou eliminado (por exemplo, β 2 AR-L413A; LPA 2-ΔSTL; etc) podem ser utilizados em paralelo no ensaio macromolecular complexos também.
- Em vez de utilizar os lisados de células inteiras de que também contêm muitos outros componentes, pode-se utilizar proteínas purificadas (como a proteína terceiro) com o passo a 3,7) (tal como na montagem de MRP4-PDZK1-CFTR, também foi utilizado o purificado Bandeira CFTR; ref 18).. Isto proporciona resultado convincente de um complexo de proteína unicamente tri-, como existem apenas três proteínas purificadas contidos no sistema de montagem inteira.
No entanto, a detecção do complexo macromolecular CFTR in vitro, utilizando purificaçãoED (proteínas ou fragmentos de proteínas) ou lisados de células que sobreexpressam CFTR ou as proteínas que interagem não indica se o complexo macromolecular sinalização existe em células que expressam endogenamente estas proteínas que interagem. Para abordar esta questão, co-imunoprecipitação pode ser realizada para avaliar os complexos endógenos CFTR em células como as células epiteliais das vias aéreas e 16 nas células epiteliais intestinais 17,18. Além disso, a análise por espectrometria de massa e de 2-dimensional electroforese em gel de 29 pode ser realizado para identificar parceiros de ligação para desconhecidos CFTR. No entanto, é fora do âmbito deste protocolo para demonstrar essas técnicas.
Além disso, a localização subcelular de interagir proteínas in vivo pode também afectar as interacções moleculares. Por exemplo, MRP4 foi mostrado para ser expresso em membranas tanto apicais e basolateral, enquanto que CFTR está localizada principalmente na membrana apical, embora tenham sido detrado para interagir fisicamente e funcionalmente com o outro através da proteína de andaime PDZ PDZK1 18. Além disso, a superexpressão das proteínas recombinantes, como utilizado no protocolo de corrente, pode afectar a sua localização subcelular e, assim, permitir interacções que de outra forma não ocorrem. Estes possibilidade também deve ser levado em consideração na interpretação dos dados e extrapolação dos achados.
Embora o protocolo actual centra-se sobre o procedimento para montar PDZ-dependentes complexos CFTR contendo macromoleculares, este protocolo também tem aplicações potenciais na montagem não-CFTR envolvidos complexo de proteínas multi-(ou PDZ-dependente ou independente). Mais recentemente, com este ensaio montagem macromolecular, demonstramos que um receptor de quimiocina CXCR2 fisicamente forma um complexo de proteína com a sua efectora PLCβ a jusante 2 mediada por via NHERF1 em neutrófilos, e este complexo macromolecular CXCR2 tem funcionalrelevância como interromper o complexo (via utilizando um peptídeo CXCR2 exógena) funções significativamente atenuados neutrófilos 31.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Nosso trabalho foi suportado por concessões do American Heart Association (Grande Afiliado Sudeste) A partir de doações em ajuda-0765185B, a Elsa U. Pardee Foundation bolsa de investigação, e Wayne State University fundo de inicialização intramural e Cardiovascular Research Institute prêmio Iniciativa de Isis. Este método de in vitro conjunto complexo macromolecular CFTR foi originalmente pioneira pelo Dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX4T-1 vector | GE Healthcare | 28-9545-49 | formerly Amersham Biosciences |
| pMAL-C2 vector | New England BioLabs | ||
| pET30 vector | EMD Chemicals | 69077-3 | formerly Novagen |
| Glutathione agarose beads | BD Biosciences | 554780 | |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | |
| Talon beads | Clontech | 635501 | |
| reduced glutathione | BD Biosciences | 554782 | |
| imidazole | Fisher | BP305-50 | |
| maltose | Fisher | BP684-500 | |
| S-protein agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | formerly Novagen |
| Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
| Anti-CFTR IgG | Custom-made | R1104 | mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734 |
| Anti-MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | Now a part of Millipore |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
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