Summary
Regelen van de groei van somatische stamcellen is een belangrijke factor die de studie en het gebruik in therapie. Hier beschrijven we een systeem tijdelijk controle neurale stamcellen expansie en volwassen, die kunnen worden gebruikt om het aantal neuronen gegenereerd in muizenhersenen verhogen.
Abstract
Somatische stamcellen delen extra stamcellen (expansie) of meer gedifferentieerde celtypes (differentiatie), dat essentieel is voor weefselvorming tijdens embryonale ontwikkeling en weefsel homeostase van volwassenen 1 te genereren. Momenteel worden grote inspanningen geleverd in de richting van het regelen van de schakelaar van somatische stamcellen van uitbreiding naar differentiatie, omdat dit wordt beschouwd als essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor de regeneratieve geneeskunde 1,2. Een groot probleem in de studie en het gebruik van somatische stamcellen is dat de expansie bewezen zeer moeilijk te controleren.
Hier beschrijven we een systeem waarmee de controle van neurale stam / voorlopercellen (totaal genoemd NSC) uitbreiding in de muis embryonale cortex of hippocampus de volwassen door manipulatie van de expressie van het cdk4/cyclinD1 complex, een belangrijke regulator van de G1 fase van de celcyclus en somatische stamcellen differentiation 3,4. Specifiek worden twee verschillende benaderingen beschreven die het complex cdk4/cyclinD1 overexpressie wordt gebracht in NSC in vivo. De eerste benadering wordt overexpressie van de celcyclus regulatoren verkregen door het injecteren plasmiden die coderen voor cdk4/cyclinD1 in het lumen van de muis telencephalon gevolgd door elektroporatie in utero te leveren aan NSC van de laterale cortex dus, triggering episomale expressie van het transgenen 5-8. De tweede benadering sterk geconcentreerd HIV-afgeleide virussen stereotaxically geïnjecteerd in de dentate gyrus van de hippocampus volwassen muis dus triggering constitutieve expressie van de celcyclus regulatoren na integratie van het virale construct in het genoom van geïnfecteerde cellen 9. Beide benaderingen, waarvan de basisprincipes werden reeds beschreven door andere video-protocollen 10-14, werden hier geoptimaliseerd om i) te verminderen weefselschade, ii) doel brede gedeelten van zeer specifieke hersengebieden regions, iii) te verkrijgen grote aantallen gemanipuleerde cellen in elke regio, en iv) leiden hoge expressie van de transgenen in elke cel. Voorbijgaande overexpressie van de transgenen met behulp van de twee benaderingen wordt verkregen op verschillende manieren dat wil zeggen door natuurlijke verdunning van het geëlektroporeerde plasmiden als gevolg van de celdeling of tamoxifen bestuur in Cre-expressie NSC geïnfecteerd met virussen die cdk4/cyclinD1 geflankeerd door loxP plaatsen, respectievelijk 9,15 .
Deze methoden zeer krachtig platform acuut en weefsel-specifiek manipuleren de expressie van een gen in de hersenen van muizen. Met name door het manipuleren van de expressie van het cdk4/cyclinD1 complex, ons systeem de tijdelijke controle van NSC expansie en de schakelaar differentiatie dus uiteindelijk het aantal neuronen gegenereerd in de hersenen van zoogdieren. Onze aanpak kan van cruciaal belang zijn voor fundamenteel onderzoek en het gebruik van somatische stamcellen voor therapievan het centrale zenuwstelsel, terwijl een beter begrip van i) stamcel bijdrage aan weefselvorming tijdens de ontwikkeling, ii) weefsel homeostase in de volwassenheid, iii) de rol van volwassenen neurogenese in cognitieve functies en misschien iv) een beter gebruik somatische stamcellen cellen in modellen van neurodegeneratieve ziekten.
Protocol
Opmerking vooraf
Operatie moet worden uitgevoerd door volledig opgeleide onderzoekers na goedkeuring van de lokale autoriteiten voor het welzijn van dieren. Alle voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om de pijn en stress veroorzaakt bij het dier, ook diepe anesthesie, toediening van postoperatieve analgesie en voor operaties die langer dan 10 min, de toepassing van een oog smeermiddel aan de cornea uitdroging en blindheid te voorkomen minimaliseren. Verdoofde muizen moet voortdurend warm bij 37 ° C tot volledig herstel en elk chirurgisch gereedschap en oplossing moet steriel zijn. Hoewel het gebruik van een biologische kap is niet strikt noodzakelijk is, moet de exploitant alle redelijke voorzorgsmaatregelen om de mogelijkheid van het infecteren van de dieren tijdens de operatie door het dragen van een laboratoriumjas, masker en handschoenen te minimaliseren. Ook moet elke stap met betrekking tot de productie en het gebruik van virussen worden toegestaan en moet worden uitgevoerd in S2 gebieden aanwijzen volgens de voorschriften van de plaatselijke autoriteiten.Ten slotte moet een grondige reiniging van alle gereedschappen en oppervlakken die had kunnen zijn in contact met virussen worden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde faciliteit desinfectie praktijken (voor HIV door bestrijken met 70% Et-OH en / of behandeling in een autoclaaf).
Deel 1: Uitbreiding van embryonale NSC
1. In utero elektroporatie
- Na kloneren transgenen (ie cdk4/cyclinD1) in PCM-EGFP (Clontech) of pDSV-mRFPnls vectoren 16, zuiveren de plasmiden met EndoFree kit en resuspendeer in steriele PBS tot een concentratie van 3-5 ug / ul. Al snel voor de operatie, meng de plasmiden met 0,05% FastGreen in PBS bij een uiteindelijke verhouding van ca. 4:04:01 en centrifugeer het mengsel gedurende 2 min bij 16.000 xg te verwijderen alle neerslaat.
- Laad het DNA mengsel in een eerder getrokken borosilicaatglas capillair. Trekken parameters met behulp van een P-97 pipet trekker zijn: pull: 200; vel: 140; tijd: 140. Warmte wordt door een hellingbaan test en afhankelijk van de specific veel capillairen gebruikt. Monteer de capillaire op het mondstuk van de PicoPump die dicht bij de in utero elektroporatie platform (Figuur 1A) en, onder een stereomicroscoop, buig de punt en nick het op het buigpunt.
- Steriliseer alle chirurgie gereedschap op een droge glaskraal sterilisator en diep een zwangere muis verdoven op dag 12-15 van de dracht met behulp van een isofluraan vaporizer. Plaats het dier in rugligging op een verwarming platform ingesteld op 37 ° C en een voortdurend onderzoek isofluraan bestuur door middel van een neuskegel.
- Scheren de huid van de buik, desinfecteren met Betaisodona meerdere malen, eventueel afvegen tussen met 70% ethanol en subcutaan injecteren buprenorfine (verdund in PBS) bij 0,1 mg / kg concentratie pre-emptieve analgetische. Met behulp van fijne schaar, een 2 cm langssnede van de huid en, vervolgens, van de onderliggende spierwand van de buikholte te openen. Afvullen in de peritoneale holte ca. 2IUE ml oplossing (D-PBS bevattende 100 U / ml pen / strep) voorverwarmd bij 37 ° C en bewaar de oplossing in een verwarmingsblok.
- Bedek de muis met steriele drap met een scheur waaruit de baarmoeders verwijderd. Trek de incisie met behulp van een wolfraam oprolmechanisme, identificeren van de baarmoeder en trek deze vast te houden met een pincet tussen aangrenzende embryo's (Figuur 1B, links) en tenslotte leg het op de steriele drap. Gedurende de hele operatie, spoel de baarmoeder met IUE oplossing van het orgaan en lichaamsholte hydrateren en uitdroging van het dier.
- Behandel de baarmoeder voorzichtig vast te houden tussen duim en wijsvinger en draai een embryo tot de kop zichtbaar is en gericht op de gebruiker. Identificeer de telencephalic hemisferen en injecteer een van hen van de dorso-laterale zijde. Laat 1 tot 2 pi van het DNA oplossing met de voetschakelaar van een PicoPump totdat de ventrikel wordt weergegeven door FastGreen (Figuur 1B; rechts).
- Als alle embryo's worden geïnjecteerd en geëlektroporeerd, terug te plaatsen de baarmoeder in de buikholte en sluit de gespierde wanden met een hechting koord hechten om de 3-4 mm. De knopen moet goed aan de spier maar niet te strak om een kleine zwelling van het weefsel mogelijk te maken. Tot slot sluit de bovenliggende huid met behulp van metalen clips. Desinfecteer de huid met Betaisodona, verwijdert u de muis van de isofluraan masker en breng deze in een behuizing kooi toen helemaal wakker. Monitor het herstel van de muis tot locomotorisch gedrag is normaal.
2. Verwerking van de samPLE
- Een of meer dagen na elektroporatie offeren de muis, verzamel de embryo's te identificeren die kunnen geëlektroporeerd met een fluorescent stereomicroscoop (Figuur 1D). Ontleden de hersenen op ijskoude PBS en overnacht bevestig ze in 4% PFA (paraformaldehyde in fosfaat buffer pH 7,4). Uiteindelijk kan BrdU worden toegediend voordat het offer volgens verschillende paradigma's te kinetiek van de celcyclus en celproliferatie 3 te onderzoeken.
- De hersenen worden vervolgens voor het snijden en immunokleuring voor de verschillende markers radiale glia, voorlopers en basale neuronen (Pax6, Nestin, tbr2, TBR1, Tuj1 etc.) om het effect van de functionele transgenen evalueren gerichte NSC en hun nageslacht die die de expressie van de co-geëlektroporeerde reportergen.
Figuur 1.In utero elektroporatie. (A) Schematische weergave van een in utero elektroporatie platform. (B) tekeningen van de positionering van de zwangere muis tijdens chirurgie (rechts) en injectie van het DNA / FastGreen mengsel (blauw) in de telencephalic halfrond van een muis embryo (links). (C) schema dat de plaatsing van de elektroden in contact met de baarmoeder muren met de anode (+) naast de plaats van injectie (blauw). Pijlen geven de migratie van het DNA naar de anode. (D) Foto van een muis embryo 24 uur na elektroporatie met GFP plasmiden op embryonale dag 13. Stippellijn bakent de telencephalic halfrond. Regeling in een aangepaste uit Calegari et al.., 2004 17.
Deel 2: Uitbreiding van Adult NSC
1. Productie van HIV-afgeleide virusdeeltjes
- Dag 1: plaat 5 x 10 6 293T cellen op een 10 cmschotel met 8 ml D-MEM bevattende 10% warmte geïnactiveerd foetaal bovien serum en 100 U / ml pen / strep (kweekmedium). Gebruik 15 schotels voor een viraal preparaat en kweek overnacht bij 37 ° C, 5% CO2.
- Dag 2: bij elke schotel Verdun in 1 ml normaal D-MEM 5 ug van elk van drie plasmiden die coderen voor i) VSVG (vesiculair stomatitis virus type G) manteleiwit, ii) gag / pol (groepsspecifieke antigen / polymerase) en iii) een polycistronisch construct dat de functionele en reporter transgenen (ie cdk4/cyclinD1/GFP) eerder gekloneerd in een HIV-overdracht gebaseerd vector (p6NST90) 9. Meng deze oplossing met 1 ml D-MEM bevattende 45 pi polyethyleenimine die vooraf werd in PBS opgelost bij 1 mg / ml voorraadoplossing, en incubeer 15-30 minuten bij kamertemperatuur. In de tussentijd Verwijder het medium uit de cellen en voeg 4 ml per schotel vers D-MEM bevattende 15% warmte geïnactiveerd foetaal bovien serum en 100 U / ml pen / strep. Voeg 2 ml transfectie mengsel en overnacht cultuur.
- Dag 3: voeg 120 ul van 500 mM Na-butyraat per schotel naar de expressie van de transgenen verbeteren, meng en cultuur voor 6-8 uur waarna het transfectie medium vervangen door 5 ml kweekmedium.
- Dag 4: verzamel de supernatanten (ca. 70 ml totaal), passeren door een 0,22 urn filter en overdracht in 2 polyallomer centrifugebuizen (35 x 89 mm). Ultracentrifuge bij 110.000 xg gedurende 90 min bij 4 ° C met een swing rotor. Verwijder het supernatant, voeg 6 ml PBS aan elke buis en incubeer op ijs gedurende 1 uur. Resuspendeer de pellet en breng deze over in een polyallomer centrifugebuis (14 x 95 mm). Ultracentrifuge bij 110.000 xg gedurende 90 min bij 4 ° C met een swing rotor. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 50 ul PBS, 5 ul aliquots en bewaar maken bij -80 ° C. Virustiter zal in het traject van 10 8 -10 9 cfu / ml. (Opmerking: virussen zijn zeer gevoelig voor temperatuur en opslag AVOid opnieuw invriezen, te houden op droog ijs tijdens het transport en ontdooien snel voor gebruik.)
2. Stereotaxische injectie
- Verdoven een 6-10 weken oude muis met isofluraan en plaats het dier in buikligging op een stereotaxisch frame (Figuur 2A) met de oor bars en het gehemelte steun vast te zetten het hoofd. Het dier wordt warm gehouden op een verwarming pad ingesteld op 37 ° C en onder constante isofluraan administratie.
- Injecteer subcutaan 100 ul van buprenorfine werkende oplossing als pre-emptive pijnstillende, scheren een streep van de huid op de kop van de muis en desinfecteren, zoals beschreven in 1.4. Met behulp van een scalpel, maak een ca. 1,5 cm lange longitudinale incisie op de hoofdhuid blootstellen van de schedel ter hoogte van de pijlnaad. Trek de huid en zachtjes het bot oppervlak schoon met een steriel wattenstaafje.
- Half-Vul een glazen capillaire (specificaties in 1.2) met paraffine olie en monteer deze op de injector pomp plaatsende capillaire tot de tweede ring (Figuur 2B). Verplaats de capillaire houder in de x, y en z-as tot het uiteinde van het capillair wordt op de bregma, de samenhang punt tussen de sagittale en laterale hechtingen (figuur 2C) (te bepalen met behulp van een stereomicroscoop), en re-set x, y en z 0.
- Verplaats de capillair met ± 1,6 mm in de medio-laterale as (x) en -1,9 mm in de anterior-posterior as (y) en markeer het bot met behulp van een chirurgische stift. Maak een gat van ca. 0,5 mm diameter op de schedel met een elektrische boor aandacht niet naar de hersenen beschadigen.
- Plaats een 5 ul druppel virussuspensie (een gedeelte) op een stuk parafilm in het oor bars en dompel het uiteinde van het capillair in de druppel. Suck ca. 3,5 ul van virale suspensie op met een nanoliter injector ingesteld op 55 nl / sec. Snel uitvoeren van deze stap als de druppel zal verdampen.
- Verplaats de capillaire om de site of injectie en verplaats deze naar beneden totdat de punt raakt het pial oppervlak. Stel de dorso-ventrale aswaarde (z) op 0. Op dit moment dringen het weefsel met de capillaire voor -1,9 mm en laat 1,5 ul virale suspensie met een snelheid van 4 nl / sec. Wacht 2-3 minuten tot het terugstromen van virale schorsing via de capillaire track te minimaliseren en de capillaire trekken. Een tweede injectie kan worden uitgevoerd in de controlaterale halfrond.
- Hechten de huid te ontsmetten en het dier herstellen van anesthesie zoals eerder beschreven in utero elektroporatie (1,8).
Figuur 2. Stereotaxische virale injectie. (A en B) Schematische weergave van de componenten om stereotactische injectie (A) en een gedemonteerde capillaire houder die het inbrengen van een ca voerenpillary tot de tweede ring (B). (C) Foto van de muis hoofd geïmmobiliseerd door het oor bars en gehemelte ondersteuning met de huid gesneden om de schedel (links) bloot te leggen. De vergroting van het gestippelde vak (rechts) toont de laterale en sagittale hechtingen, de bregma, en de injectieplaats (cirkel).
3. Behandeling van het monster
- Een tot drie weken na infectie, perfuseren de muis met ca. 100 ml van 4% PFA, ontleden van de hersenen en post-fix het 's nachts in 4% PFA. Uiteindelijk kan BrdU en / of tamoxifen worden toegediend vóór opoffering volgens verschillende paradigma celcycluskinetiek onderzoeken en de expressie van de virale transgenen geflankeerd door loxP plaatsen stoppen, respectievelijk 9.
- De hersenen kunnen worden verwerkt voor immunokleuring met meerdere markers van stamcellen en voorlopercellen cellen en neuronen (bijvoorbeeld SOX2, GFAP, Nestin, tbr2, doublecortin, etc).
Representative Results
- Algemeen in utero elektroporatie levert 60-80% van geëlektroporeerde embryo tonen sterke expressie van het reportergen in een groot gebied van de laterale cortex (Figuur 3A). Fluorescerende eiwitten kan gemakkelijk worden gedetecteerd op whole mount embryo zodra 3-6 uur na chirurgie met het signaal gedurende meer dan een week. Binnen het doelgebied, ongeveer 30-50% van de cellen gewoonlijk het transgen expressie (s) met het percentage van cellen co-expressie twee (of meer) co-geëlektroporeerde transgenen zijn meestal meer dan 90% (Figuur 3B, links) 6,8 , 15. Hoewel een minimale mate van apoptose (ca. 2,0-2,5%) kon worden waargenomen na ongeveer 2 uur van elektroporatie, wordt deze waarde terug naar fysiologische niveaus (ca. 0,5-1,0%) na ca. 6 uur (FC, ongepubliceerde gegevens). Het percentage van embryo's of zwangere muizen sterven als gevolg van de operatie is meestal verwaarloosbaar (<5%). Co-elektroporatie met cdk4/cyclinD1 onder deze omstandigheden gevolgd door 48 uur ontwikkeling veroorzaakt een toename van de expansie van neurale voorlopercellen met 30% (Figuur 3B, rechts, en C) 15.
Figuur 3. Expansie van neurale stamcellen door cdk4/cyclinD1 overexpressie. (A) Fluorescentie beeld van een doorsnede door de laterale cortex van een muis embryo 24 uur na elektroporatie met GFP en RFP plasmiden op embryonale dag 13. (B) TL-afbeeldingen als in A 48 uur na gelijktijdige elektroporatie met cdk4/GFP en cyclinD1/RFP plasmiden en immunokleuring voor de basale stamvader marker tbr2. Fluorescente reporters met DAPI counterstainig (links) en tbr2 (rechts) getoond. Lijnen geven het apicale oppervlak van de ventriculaire zone (VZ; witte lijn) en de grenzen van de subventriculaire zone (SVZ, gele stippellijnen). Let op de verhoogde thickness van de SVZ in de geëlektroporeerde deel van de cortex (witte pijlen) als gevolg van een verhoogde productie en uitbreiding van basale progenitors na overexpressie van cdk4/cyclinD1. (C) Kwantificering van het effect weergegeven in B. Bars = SD, p <0,05, n = 3. Staafdiagram in C is afkomstig van Lange et al.., 2009 15.
- Na virale stereotactische injectie ca. 80% van de geopereerde muizen vertonen sterke expressie van de transgenen in de hele dentate gyrus. Constitutieve expressie van GFP kan gemakkelijk worden gedetecteerd op 40 urn secties zodra 4 dagen na operatie. Langs de rostrale-caudale to-as van de dentate gyrus, ongeveer 10-30% van de cellen (overeenkomend met een totaal van ca.. 10,000-30,000 cellen) meestal het transgen expressie (s) (Figuur 4A) 9. Het aandeel van muizen sterven als gevolg van de operatie is verwaarloosbaar (<5%). Drie weken overexpressie van cdk4/cyclinD1 onder deze omstandigheden veroorzaakt een toename van de NSC met meer dan twee-plooien (Figuur 4B) met minder neurogenese met 70% (figuur 4C) 9.
Figuur 4. Effecten van virale infectie. (A) 3D-reconstructie van 7 fluorescentie foto's genomen van 40 urn dik seriële coronale secties (verzameling 1 per 6) langs de rostrale-caudale to-as van de hippocampus. GFP + geïnfecteerde cellen (groen) en DAPI nucleaire kleuring (blauw) van de dentate gyrus getoond (boven). Helderveld foto's van de coronale secties die overeenkomen met die getoond in A (midden) en 3D-weergave (onder) van het hele hersenhelft met de hippocampus in het groen pseudocolor (gewijzigd ten opzichte van de Allen Brain Atlas; www.brain-map.org ) . Witte pijlen wijzen de plaats van injectie. Lateral (L), rostrale (R), en dorsal (D) assen (x, y, z en stereotactische coördinaten) zijn aangegeven (rechts). (B en C) Aandeel van nestine + NSC (B) en DCX + pasgeboren neuronen (C) binnen de populatie van GFP + geïnfecteerde cellen 3 weken na stereotactische injectie van GFP (wit) of cdk4/cyclinD1/GFP (zwart) virussen. Bars = SD, p <0,005, n = 3. Grafieken B en C uit Artegiani et al.., 2011.
Discussion
Een kritische stap in utero elektroporatie is de kwaliteit en zuiverheid van het DNA, aangezien de migratie bij directionele afgifte van de elektrische velden afhankelijk zijn lading. Protocollen voor DNA-zuivering die niet de verwijdering van aanvullende geladen moleculen, zoals endotoxinen, leiden tot de maskering van de natuurlijke DNA negatieve ladingen leidt tot slechte levering. Uiteraard zal het aanraken van de baarmoeder muren met de elektroden zo dicht mogelijk bij het te verbeteren gerichte elektroporatie efficiency. Even belangrijk is de kwaliteit van de elektroden gebruikt omdat dit essentieel is voor de levering van optimale elektrische velden. Microkrassen zelfs zichtbaar oog en / of organische resten, zoals sporen van serum, lipiden, enz., onvermijdelijk ophopen in de tijd leidt tot het verlies van hun eigenschappen elektroden. Oude en / of vuil electropes de meest waarschijnlijke oorzaak van een plotselinge elektroporatie efficiëntie en dus moet rzodra dit wordt opgemerkt eplaced. Terwijl relatief eenvoudig, in utero elektroporatie vereist doorgaans een paar weken van de opleiding om te komen tot voldoende en reproduceerbare resultaten. Deze techniek is zeer veelzijdig, aangezien deze kan worden toegepast, vrijwel aan alle organen en weefsels van het ontwikkelende embryo. Zeker, organen die een holte, zoals de hersenen, zijn bijzonder eenvoudig te richten en een hoog percentage getransfecteerde cellen door het gemak van het injecteren van een relatief grote hoeveelheid DNA mogelijk.
Een veel voorkomend probleem bij het opzetten stereotaxisch virale injectie moet enkele geïnfecteerde cellen en / of ongewenste te pakken. Het eerste probleem is vooral gecorreleerd met de injectie van lage titer virussen. 293T-cellen met een lagere aantal passages in cultuur sneller groeien en leiden tot een hogere virale titers. Cuvetten ouder dan ca. 20 passages wordt niet aanbevolen en de middelen van transfectie met minder dan 80% rendement zal niet zorgen voor een goedevirale productie. Resuspensie van de virale pellet is kritisch, de virale suspensie moet verschijnen homogene en virale klonten die zouden occluderen het capillair moeten worden vermeden. Virussen zijn zeer gevoelig voor temperatuur daalt en langdurige opslag. Om deze redenen moeten aliquots permanent opgeslagen bij -80 ° C en kunnen niet worden ingevroren. Zelfs onder deze omstandigheden kan een afname in infectiviteit worden waargenomen na 6-12 maanden opslag. In de leerfasen, raden wij u aan de virale titer van elk virale prepareren en het opnieuw te doen na langdurige opslag. De aanwezigheid van geïnfecteerde cellen in ongewenste gebieden van de hersenen kan afhangen van een suboptimale positionering van de muis hoofd op het stereotactische frame, waarvan sommige praktijk vereist. Bovendien is het belangrijk dat het oppervlak van de hersenen beschadigen tijdens het openen de opening in de schedel omdat anders niet mogelijk is om volledig te kunnen resetten 0 op de pial oppervlak, waardoor onnauwkeurige injectie. De coördinatendat we in dit protocol wordt verwezen naar C57/BL6 6-10 weken oude vrouwtjes en we raden te optimaliseren voor verschillende stam / leeftijd / geslacht. Verwerving van deze techniek meer tijd nodig dan in utero elektroporatie door langere fasen nodig virussen bereiden en te analyseren. We raden sterk aan dat alleen virussen worden gebruikt na muis operatie en stereotactische injectie zijn geworden betrouwbaar en reproduceerbaar. De eerste stap om dit te bereiken is het cel-permeant DNA kleurstoffen, zoals Hoechst 33342, injecteren in euthanized muizen en direct analyseren van de hersenen.
In utero elektroporatie en stereotaxische virale injectie zijn twee krachtige systemen om acuut en weefsel-specifiek genexpressie te manipuleren in het CZS tijdens de ontwikkeling van zoogdieren en volwassenheid. Ondanks hun beperking in uitsluitend is gericht op een subpopulatie van cellen, deze systemen bieden een ongekende snelheid en het gemak in vergelijking met meer conventionele methoden, in name de moeizame en tijdrovende genereren van transgene muizen. Ondanks deze gelijkenis, een aantal verschillen bestaan tussen de twee technieken die het vermelden waard zijn. Eerst met betrekking tot het richten van verschillende celtypes, in utero elektroporatie aanvankelijk leidt tot de transfectie van stamcellen zelf (ook wel radiaal gliacellen) omdat dit de enige cellen afgrenzing van de ventrikel waar het DNA wordt geïnjecteerd. Als gevolg van celdelingen wordt plasmiden vervolgens overgenomen van gerichte moeder stamcellen hun voorlopercellen en / of neuronale dochtercellen leidt tot de herverdeling van getransfecteerde cellen in de cortex als functie van de tijd. In contrast, het gebruik van HIV lentivirussen in de volwassen hersenen leidt tot de gelijktijdige infectie van celtype zoals stamcellen, progenitorcellen, neuronen en gliacellen rijpe. Van belang is met betrekking tot het gebruik HIV lentivirussen tegenover vaker gebruikt retrovirussen is het feitlentivirale dat integratie zou onafhankelijk van de stand van mitotische cellen voorkomen, waardoor de targeting ook volwassen, rustende stamcellen.
Tweede, ander belangrijk verschil tussen elektroporatie en virale infectie is een tijdelijke, episomale expressie wordt bereikt door de eerste tegenstelling tot de onomkeerbare integratie van DNA in het genoom van geïnfecteerde cellen bereikt door de laatstgenoemde. Als gevolg van opeenvolgende celdelingen verdunning van het geëlektroporeerde plasmiden en afbraak van het ectopische cyclinD1 eiwit zouden ontstaan bij elke celcyclus. Zo werd uitbreiding van NSC tijdens embryonale ontwikkeling aangetoond slechts voor ongeveer twee dagen 15 terwijl in de volwassen hersenen dit effect blijkt duurt verscheidene maanden (ongepubliceerde resultaten).
Ten derde, omdat i) cdk4/cyclinD1 heeft een sterker effect op cellen met een langere G1 en ii) gepleegd neurale voorlopercellen tijdens de ontwikkeling hebben een langere celcyclusdan stamcellen, terwijl het tegenovergestelde geldt tijdens de volwassenheid, werden onze twee manipulaties gevonden om de uitbreiding, in de eerste plaats, van neurale voorlopercellen te activeren tijdens de ontwikkeling en stamcellen tijdens de volwassenheid. In beide gevallen een verhoging van neuronen is bereikt door beide methoden.
Vierde virale injectie kan gemakkelijk worden uitgevoerd, betrouwbaar en reproduceerbaar in verschillende gebieden van de volwassen hersenen door eenvoudig de stereotactische coördinaten. Daarentegen zou precieze targeting van bepaalde gebieden van het centrale zenuwstelsel, zoals hersenstam, hippocampale formatie of het ruggenmerg, door in utero elektroporatie moeilijker te bereiken reproduceerbaar. Bovendien, terwijl stereotactische injectie kan worden uitgevoerd op muizen van elke leeftijd, optimale werking van in utero elektroporatie beperkt tot ongeveer E11 E16. Stadia voorafgaand aan E11 zou de aanwending van een ultrasone microscoop backscatter 18,19 of geheel embryo culture systeem 17,20.
Onlangs is er een toenemende belangstelling voor elementaire celbiologie van somatische stamcellen is gepromoveerd omdat hun studie en manipulatie zijn gedacht te worden fundamentele richting van de ontwikkeling van nieuwe cel-gebaseerde regeneratieve therapieën. Met name voor overexpressie van cdk4/cyclinD1, ons protocol biedt de mogelijkheid om voorbijgaand verhogen uitbreiding van NSC in vivo (Figuur 3B en C en 4B en C) om het aantal neuronen gegenereerd in de volwassen hersenen verhogen. We geloven dat deze manipulatie belang kunnen in een aantal verschillende contexten de rol van NSC beter begrip in hersenontwikkeling, ontwikkeling en homeostase en hun bijdrage aan cognitieve functie of herstel van neurale degeneratie of letsel.
Disclosures
BA en FC hebben een patent aanvraag waarin de voorwaardelijke expansie van volwassen somatische stamcellen door cdk4/cyclinD1 virussen (EP 10160288.6).
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Centrum voor regeneratieve therapieën, de medische faculteit van de TU Dresden, en de DFG Collaborative Research Center SFB655 (deelproject A20). BA werd ondersteund door een beurs van de DIGS-BB-programma, Dresden. Wij danken Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie, en Ravi Jagasia voor waardevolle adviezen tijdens het opzetten van in utero elektroporatie en stereotaxische virale injectie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
- Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. , Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
- Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
- Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
- Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
- Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
- De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
- Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
- Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
