Summary
Kontrollere utvidelsen av somatiske stamceller er en viktig faktor hindrer sine studier og anvendelse i terapi. Her beskriver vi et system for å kontrollere timelig nevrale stamceller ekspansjon under utvikling og voksen, som kan brukes til å øke antallet av nevroner som genereres i musen hjernen.
Abstract
Somatiske stamceller kan dele for å generere flere stamceller (utvidelse) eller mer differensierte celletyper (differensiering), som er grunnleggende for vev formasjon under embryonal utvikling og vev homeostase i voksen alder 1. Foreløpig er stor innsats investert mot styre bryteren av somatiske stamceller fra ekspansjon til differensiering fordi dette er tenkt å være grunnleggende for å utvikle nye strategier for regenerativ medisin 1,2. Imidlertid, er en stor utfordring i studien og bruk av somatiske stamcelle som deres ekspansjon har vist svært vanskelig å kontrollere.
Her beskriver vi et system som tillater kontroll av nevrale stammen / stamceller (helt kalt NSC) ekspansjon i mus embryonale cortex eller voksen hippocampus ved å manipulere ekspresjonen av cdk4/cyclinD1 komplekset, en viktig regulator av G1 fasen av cellesyklus og somatiske stamceller differentiation 3,4. Spesielt er to ulike tilnærminger beskrevet hvorved cdk4/cyclinD1 komplekset overexpressed i NSC in vivo. Ved den første tilnærmingen, er overuttrykte cellesyklus regulatorer oppnådd ved å injisere plasmider som koder for cdk4/cyclinD1 i lumen av musen telencephalon etterfulgt av i utero electroporation å levere dem til NSC av lateral cortex, og dermed utløser episomal uttrykk for transgener 5-8. Ved den andre tilnærmingen, er svært konsentrert HIV-deriverte virus stereotaxically injisert i dentate gyrus av den voksne mus hippocampus, og dermed utløser konstituerende uttrykk av cellesyklus regulatorer etter integrasjon av viral konstruere i genomet av infiserte celler 9. Begge tilnærminger, hvis grunnleggende prinsipper ble allerede beskrevet av andre video protokoller 10-14, var her optimalisert for å i) redusere vevsskade, ii) mål brede deler av svært spesifikke hjernen regions, iii) oppnå et høyt antall av manipulerte celler innenfor hver region, og iv) utløse høy ekspresjon nivåer av transgener innenfor hver celle. Forbigående overexpression av transgener med de to tilnærmingene oppnås ved ulike virkemidler dvs. ved naturlig utvanning av electroporated plasmider grunn celledeling eller tamoxifen administrasjonen i Cre-uttrykke NSC infisert med virus som bærer cdk4/cyclinD1 flankert av loxP områder, henholdsvis 9,15 .
Disse metodene gir en svært kraftig plattform til akutt og vev-spesifikt manipulere uttrykk av noe gen i musen hjernen. Spesielt, ved å manipulere ekspresjon av cdk4/cyclinD1 komplekse, tillater systemet tidsmessig styring av NSC ekspansjon og deres bryteren til differensiering, og dermed, til slutt å øke antall nevroner generert i hjernen hos pattedyr. Vår tilnærming kan være kritisk viktig for grunnforskning og bruke somatiske stamceller for terapiav pattedyr sentralnervesystemet samtidig som det gir en bedre forståelse av i) stamcelletransplantasjon bidrag til vev formasjon under utvikling, ii) vev homeostase i voksen alder, iii) rolle voksen neurogenesis i kognitive funksjoner, og kanskje, iv) bedre ved hjelp somatisk stammen celler i modeller av nevrodegenerative sykdommer.
Protocol
Foreløpig notat
Kirurgi må utføres av fullt utdannet etterforskere ved godkjenning fra lokale myndigheter for dyrevelferd. Alle forholdsregler må tas for å minimere smerte og stress påført til dyret inkludert dyp anestesi, administrasjon av postoperativ analgesi, og for operasjoner som varer mer enn 10 minutter, anvendelse av et øye smøremiddel for å unngå hornhinnen dehydrering og blindhet. Bedøvede mus må holdes konstant varm ved 37 ° C inntil full gjenoppretting og hver kirurgisk verktøy og løsning må være sterile. Selv om bruken av en biologisk hette ikke er strengt nødvendig, må operatøren ta alle rimelige forholdsregler for å minimere muligheten for å infisere dyret under operasjonen med seg en lab frakk, maske og hansker. Likeledes må hvert trinn om produksjon og bruk av virus bli autorisert og må utføres i S2 områder i henhold til forskrift av lokale myndigheter.Til slutt må en grundig rensing av alle verktøy og overflater som kunne ha vært i kontakt med virus utføres i henhold til godkjente anlegg desinfeksjon praksis (for HIV ved å tørke med 70% Et-OH og / eller autoklavering).
Del 1: Utvidelse av Embryonic NSC
1. I utero electroporation
- Etter å klone de transgener (dvs. cdk4/cyclinD1) i PCMS-EGFP (Clontech) eller pDSV-mRFPnls vektorer 16, rense plasmidene hjelp EndoFree kit og resuspender i sterilt PBS til en konsentrasjon på 3-5 pg / pl. Snart før kirurgi, bland plasmidene med 0,05% FastGreen i PBS ved en endelig forhold på ca. 04:04:01 og sentrifuger blandingen i 2 minutter ved 16.000 xg for å fjerne alt bunnfall.
- Laste DNA blandingen i en tidligere trukket borsilikatglass kapillær. Pulling parametere ved hjelp av en P-97 pipette avtrekker er: pull: 200; Vel: 140; tid: 140. Varmen blir gitt ved en rampe test og avhenger specific masse kapillærer som brukes. Monter kapillære på munnstykket av PicoPump som er i nærheten av i utero electroporation plattform (figur 1A) og under en stereomikroskop, bøy spissen og nick det på vendepunkt.
- Steriliser alle kirurgi verktøy på et tørt glass perle sterilizer og dypt anesthetize en gravid mus på dag 12-15 av drektigheten ved hjelp av en isofluran vaporizer. Plasser dyret i ryggleie på en oppvarming plattform satt ved 37 ° C og holde under konstant isofluran bruk gjennom et nese kjegle.
- Barbere huden på magen, desinfisere med Betaisodona flere ganger, til slutt tørke i mellom med 70% etanol, og injisere buprenorfin (fortynnet i PBS) subkutant til 0,1 mg / kg konsentrasjon som pre-emptive smertestillende. Bruke fine saks, lage en 2 cm langsgående snitt i huden og, senere, av den underliggende muskulære veggen for å få tilgang til bukhulen. Dispensere i bukhulen ca. 2ml IUE oppløsning (D-PBS inneholdende 100 U / ml av pennen / strep) forvarmet ved 37 ° C og holde løsningen på en varmeblokk.
- Dekk musen med steril drap inneholdende en fissur hvorfra uteri vil bli fjernet. Trekke snittet med en tungsten retractor, identifisere livmoren og trekk den ut holder det med tang mellom tilstøtende embryoer (figur 1B, venstre) og til slutt legge det ned på sterile drap. Under hele operasjonen, skyll livmoren med IUE løsning å fukte orgel og kroppens hulrom og hindre dehydrering av dyret.
- Håndter livmoren forsiktig holder den mellom tommel og pekefingeren og slå ett embryo til hodet er synlig og orientert mot brukeren. Identifiser telencephalic halvkuler og injisere en av dem fra dorso-lateral side. Slipp 1-2 pl av DNA-løsningen ved hjelp av en fotbryter PicoPump inntil ventrikkelen er skissert av FastGreen (figur 1B, høyre).
- Når alle embryoer er injisert og electroporated, plasserer livmoren tilbake i bukhulen og lukke muskuløse vegger med en sutur streng suturing hver 3-4 mm. Knutene skal tettsittende til muskel men ikke for stramt å tillate litt hevelse av vevet. Til slutt lukker den overliggende huden med metallklips. Desinfiser huden med Betaisodona, fjerne musen fra isofluran maske og overføre den i en bolig bur når helt våken. Monitorere recovery fra musen til bevegelsesapparatet er normalt.
2. Behandling av sample
- En eller flere dager etter electroporation, ofre musen, samle embryoene og identifisere de riktig electroporated med en fluorescerende stereomikroskop (figur 1D). Skjær hjerne på iskald PBS, og fikse dem over natten i 4% PFA (paraformaldehyd i fosfat-buffer pH 7,4). Til slutt, kan BrdU gis før offer i henhold til ulike paradigmer for å undersøke cellesyklus kinetikk og celleproliferasjon 3.
- Hjernen blir deretter behandlet for seksjonering og farging for flere markører for radial gliaceller, basal forfedre og nevroner (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 etc.) for å evaluere effekten av de funksjonelle transgener på målrettet NSC og deres avkom som er identifisert av uttrykk for co-electroporated reporter genet.
Figur 1.I utero electroporation. (A) Skjematisk framstilling av en i utero electroporation plattform. (B) Tegninger viser plasseringen av den gravide mus under operasjon (høyre) og injeksjon av DNA / FastGreen blanding (blå) i telencephalic halvkule av en mus embryo (venstre). (C) Reaksjonsskjema viser plasseringen av elektrodene i kontakt med livmor veggene med anoden (+) tilstøtende til injeksjonsstedet (blå). Pilene indikerer migrering av DNA mot anoden. (D) Bilde av en mus embryo 24 timer etter electroporation med GFP plasmider på embryonale dag 13. Stiplet linje avgrenser den telencephalic halvkule. Ordningen i en modifisert fra Calegari et al., 2004 17.
Del 2: Utvidelse av Adult NSC
1. Produksjon av HIV-stammer viruspartikler
- Dag 1: plate 5 x 10 6 293T celler i et 10 cmtallerken med 8 ml av D-MEM inneholdende 10% av varme-inaktivert føtalt bovint serum og 100 U / ml av pennen / strep (dyrkningsmedium). Bruk 15 retter for en viral forberedelse og kultur over natten ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Dag 2: for hver tallerken, fortynnes i 1 ml av vanlige D-MEM 5 ug av hver av 3 plasmider koding for i) VSVG (vesikulær stomatitt virus type G) konvolutten protein, ii) gag / pol (gruppe spesifikk antigen / polymerase) og iii) en polycistronic konstruere uttrykke de funksjonelle og reporter transgener (dvs. cdk4/cyclinD1/GFP) tidligere klonet i en HIV-basert overføring vektor (p6NST90) 9. Bland denne løsningen med en ml D-MEM inneholdende 45 pl av polyetylenimin som har blitt oppløst på forhånd i PBS ved 1 mg / ml stamoppløsning, og inkuber i 15-30 minutter ved romtemperatur. I mellomtiden fjernes mediet fra cellene, og tilsett 4 ml pr parabolen av fersk D-MEM inneholdende 15% av varme-inaktivert føtalt bovint serum og 100 U / ml av penn / strep. Legg til 2 ml transfeksjon blandingen og kultur over natten.
- Dag 3: Tilsett 120 ul av 500 mM Na-butyrat per parabolen å forbedre ekspresjonen av de transgener, bland forsiktig og kultur for 6-8 hr hvoretter erstatte transfeksjon medium med 5 ml dyrkningsmedium.
- Dag 4: samle supernatantene (ca. 70 ml totalt), passerer gjennom et 0,22 mikrometer filter og overføring i 2 polyallomer sentrifugerør (35 x 89 mm). Ultrasentrifuge ved 110.000 xg i 90 minutter ved 4 ° C ved hjelp av en sving rotor. Kast supernatanten, tilsett 6 ml PBS til hvert rør og inkuberes på is i 1 time. Resuspender pellet og overføre det i ett polyallomer sentrifugerør (14 x 95 mm). Ultrasentrifuge ved 110.000 xg i 90 minutter ved 4 ° C ved hjelp av en sving rotor. Kast supernatanten, resuspender pelleten i 50 pl PBS, gjør 5 pl aliquoter og lagre ved -80 ° C. Viral titer vil være i området fra 10 8 -10 9 cfu / ml. (Merk: virus er svært følsom for temperatur og lagring, avoid re-frysing, holde på tørris under transport og tine snart før bruk.)
2. Stereotaksiske injeksjon
- Anesthetize en 6-10 uker gammel mus med isofluran og plassere dyret i liggende stilling på en stereotaksiske ramme (Figur 2A) ved hjelp av øret barer og gane støtte til riktig fikse hodet. Dyret holdes varm på en varmepute innstilt på 37 ° C og under konstant isofluran administrasjon.
- Injisere subkutant 100 ul av buprenorfin arbeider løsning som pre-emptive smertestillende, barbere en stripe av huden på hodet av musen, og desinfect som beskrevet i 1.4. Ved hjelp av en skalpell, lage en ca. 1,5 cm lang langsgående snitt på hodet huden eksponere skallen på nivået av den sagittal sutur. Trekke huden og forsiktig rense bein overflaten med en steril bomullspinne.
- Half-fylle et glass kapillær (spesifikasjoner i 1.2) med parafin olje og montere den på injektoren pumpe settekapillæret inntil den andre ringen (figur 2B). Flytt kapillært holderen i x, y og z-aksen til spissen i kapillarrøret er plassert på bregma, konjunksjonen punktet mellom sagittale og laterale suturer (figur 2C) (som skal bestemmes ved hjelp av en stereomikroskop), og re-set x, y, og z-verdier til 0.
- Flytt kapillær med ± 1,6 mm i medio-lateral aksen (x) og -1,9 mm i anterior-posterior aksen (y) og merke beinet med en kirurgisk tusj. Lage et hull på ca. 0,5 mm diameter på skallen med en elektrisk driller betaler oppmerksomhet til ikke å skade hjernen.
- Sette en 5 pl dråpe av viral suspensjon (en alikvot) på et stykke Parafilm i øret barer og immerge tuppen av kapillarrøret i dråpene. Suge ca. 3,5 pl av suspensjonen med en viral nanoliter injektor satt til 55 nl / sek. Utfør dette trinnet raskt som dråpen vil fordampe.
- Flytt kapillære til nettstedet of injeksjon og flytte det ned til spissen berører pial overflaten. Tilbakestille dorso-ventrale akseverdi (z) til 0. På dette punktet, trenge vevet med kapillæret for -1,9 mm og slipp 1,5 pl av viral suspensjon ved en hastighet på 4 nl / sek. Vent i 2-3 minutter for å minimere tilbakestrømning av viral suspensjon trau kapillær sporet og deretter trekke kapillæret. En andre injeksjon kan utføres i controlateral halvkule.
- Suturere huden, desinfisere, og at dyret kan gjenopprette fra anestesi som beskrevet tidligere for in utero elektroporering (1,8).
Figur 2. Stereotaksiske viral injeksjon. (A og B) Skjematisk representasjon av komponentene som trengs for å utføre stereotaksiske injeksjon (A) og en demontert kapillær holderen som viser innsetting av en capillary til den andre ringen (B). (C) Bilde av musen hodet immobilisert av øret barer og gane støtte med huden kuttet for å avsløre skallen (til venstre). Forstørrelsen av den stiplede boksen (til høyre) viser laterale og sagittal sting, den bregma og injeksjonsstedet (sirkel).
3. Behandling av prøven
- En-til-tre uker etter infeksjon, perfuse musen med ca. 100 ml 4% PFA, dissekere hjernen og post-fikse det over natten i 4% PFA. Til slutt, kan BrdU og / eller tamoxifen gis før offer i henhold til ulike paradigmer for å undersøke cellesyklus kinetikk og å stoppe uttrykk for viral transgener flankert av loxP områder, henholdsvis 9.
- Hjernen kan da bli behandlet for farging ved hjelp av flere markører for stilk og forfedre celler og nevroner (f.eks Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublecortin, etc).
Representative Results
- Samlet i utero elektroporering gir 60-80% av electroporated embryoer viser sterk ekspresjon av reportergen i et bredt område av det laterale cortex (figur 3A). Fluoriserende proteiner kan lett oppdages på hele mount embryoer så snart 3-6 timer etter operasjonen med signalet som varer i mer enn én uke. Innenfor målområdet, ca 30-50% av celler vanligvis uttrykker transgenet (e) med andelen av celler co-uttrykkende to (eller mer) samtidig electroporated transgener blir vanligvis over 90% (figur 3B, venstre) 6,8 , 15. Mens et minimalt nivå av apoptose (ca. 2,0 til 2,5%), kan observeres etter ca 2 timer fra elektroporering, vil denne verdien tilbake til fysiologiske nivåer (ca. 0,5 til 1,0%) etter 6 timer (FC, upubliserte data). Andelen embryoer eller gravide mus døende grunnet kirurgi er typisk ubetydelig (<5%). Co-elektroporering med cdk4/cyclinD1 under disse betingelser etterfulgt av 48 timer med utvikling utløser en økning i utvidelsen av nevrale stamfar med 30% (figur 3B, høyre, og C) 15.
Figur 3. Utvidelse av nevrale stamceller ved cdk4/cyclinD1 overekspresjon. (A) Fluorescens bilde av et snitt gjennom den laterale cortex av en mus embryo 24 timer etter elektroporering med GFP og RFP plasmider ved embryonisk dag 13. (B) Fluorescent bilder som i en 48 timer etter co-electroporation med cdk4/GFP og cyclinD1/RFP plasmider og immunolabeling for basal progenitor markør Tbr2. Fluorescerende reportere med DAPI counterstainig (til venstre) og Tbr2 (høyre) er vist. Linjer indikerer apikale overflaten av ventrikulære sonen (VZ, hvit linje) og grensene for subventricular sonen (SVZ, gule stiplede linjer). Legg merke til den økte thickness av SVZ i electroporated delen av hjernebarken (hvite pilspisser) på grunn av en økt produksjon og utvidelse av basale stamfedre etter overuttrykte cdk4/cyclinD1. (C) Kvantifisering av effekten er vist i B. Bars = SD, p <0,05, n = 3. Søylediagrammet i C er tatt fra Lange et al. 2009 15.
- Etter viral stereotaksiske injeksjon, ca. 80% av opererte mus viser sterkt uttrykk av transgener i hele dentate gyrus. Konstitutiv ekspresjon av GFP kan lett oppdages på 40 mikrometer seksjoner snarest 4 dager etter operasjonen. Langs rostral til caudal akse dentate gyrus, ca 10-30% av celler (tilsvarer totalt ca. 10,000-30,000 celler) vanligvis uttrykker transgenet (e) (fig. 4A) 9. Andelen mus dør grunnet kirurgi er ubetydelig (<5%). Tre ukers overuttrykte cdk4/cyclinD1 under disse betingelser utløser en økning i NSC med over to-folder (fig. 4B), mens avtagende neurogenesis med 70% (figur 4C) 9.
Figur 4. Effekter av viral infeksjon. (A) 3D rekonstruksjon av 7 fluorescence bilder tatt fra 40 mikrometer tykke serielle koronale seksjoner (samle en hver 6) langs rostral til caudal aksen av hippocampus. GFP + infiserte celler (grønn) og DAPI kjernefysisk flekker (blå) av dentate gyrus vises (øverst). Lyse feltet bilder av koronale seksjoner som tilsvarer de som er vist i A (i midten) og 3D-representasjon (nederst) av hele cerebral halvkule med hippocampus uthevet i grønt PseudoColor (modifisert fra Allen Brain Atlas, www.brain-map.org ) . Hvite piler peker injeksjonsstedet. Lateral (L), rostral (R), og dorSal (D) akser (x, y, og z stereotaksiske koordinater) er angitt (høyre). (B og C) Andel nestin + NSC (B) og DCX + nyfødte nerveceller (C) innenfor befolkningen i GFP + infiserte celler tre uker etter stereotaksiske injeksjon av GFP (hvit) eller cdk4/cyclinD1/GFP (svart) virus. Streker = SD, p <0,005, n = 3. Grafer i B og C tatt fra Artegiani et al., 2011.
Discussion
Et kritisk trinn for in utero elektroporering er kvaliteten og renheten av DNA siden dens retningsbestemt migrasjon under levering av de elektriske feltene avhenger ladet. Protokoller for DNA rensing som ikke inkluderer fjerning av ytterligere ladede molekyler, slik som endotoksiner, kan føre til maskering av de naturlige DNA negative ladningene fører til dårlig levering. Åpenbart vil berøre livmor veggene med elektrodene så nær som mulig til området for å være målrettet forbedre elektroporering effektivitet. Like viktig er det kvaliteten av elektrodene brukt siden dette er grunnleggende for levering av optimale elektriske felt. Mikro-riper ikke engang synlige ved øyet og / eller organiske rester, slik som spor av serum, lipider og så videre, vil uunngåelig akkumuleres over tid fører til elektroder miste sine egenskaper. Gamle og / eller skitne electropes er den mest sannsynlige årsaken til en brå nedgang i electroporation effektivitet, og dermed bør være replaced så snart dette blir lagt merke til. Mens relativt enkelt, i utero electroporation krever vanligvis et par uker med trening for å oppnå tilfredsstillende og reproduserbare resultater. Denne teknikken er veldig allsidig, siden det kan brukes, nesten, til hvilket som helst organ og vev i utvikling av embryo. Absolutt, organer inneholdende et hulrom, slik som hjernen, er spesielt enkle til å målrette og gi rom for en høy andel av transfekterte celler på grunn av den enkle injisere et relativt stort volum av DNA.
Et vanlig problem oppstått i å sette opp stereotaksiske viral injeksjon er å ha noen infiserte celler og / eller for å målrette uønskede områder. Det første problemet er hovedsakelig korrelert med injeksjon av lav-titer virus. 293T celler med lavere antall passeringer i kultur vokse raskere og føre til høyere viral titere. Ved hjelp av celler eldre enn ca. 20 passasjer er ikke anbefalt og betyr transfeksjon med mindre enn 80% effektivitet vil ikke sikre en godviral produksjon. Resuspendering av viral pelleten er også kritisk, har viral suspensjon skal vises homogene og viral klumper som kunne occlude kapillæret må unngås. Virus er svært følsomme for temperaturen synker og langsiktig lagring. Denne grunner, alikvoter må permanent lagret ved -80 ° C og kan ikke fryses igjen. Selv under disse forhold, kan en reduksjon av infektivitet observeres etter 6-12 måneders lagring. I læring faser, foreslår vi å teste viral titer av hver viral forberedelse og for å gjøre det igjen etter lang tids lagring. Tilstedeværelsen av infiserte celler i uønskede områder av hjernen kan være avhengig av en suboptimal posisjonering av musen hodet på stereotaksiske ramme, som krever litt øvelse. I tillegg er det viktig ikke å skade overflaten av hjernen mens åpne hullet på skallen fordi ellers vil det ikke være mulig å tilbakestille 0 riktig på pial overflaten, noe som resulterer i upresis injeksjon. Koordinateneat vi i denne protokollen er referert til C57/BL6 6-10 uker gamle kvinner, og vi foreslår å optimalisere dem for annen stamme / alder / kjønn. Oppkjøp av denne teknikken kan kreve mer tid enn i utero electroporation på grunn av lengre faser som trengs for å forberede virus og analysere prøvene. Vi anbefaler på det sterkeste at virus blir bare brukt etter mus kirurgi og stereotaksiske injeksjon har blitt pålitelig og reproduserbar. Det første trinnet for å oppnå dette på er å injisere celle-permeant DNA fargestoffer, for eksempel Hoechst 33342, i euthanized mus og analysere hjernen umiddelbart.
I utero electroporation og stereotaksiske viral injeksjon er to kraftige systemer til akutt og vev-spesifikt manipulere genuttrykk i SNS under pattedyr utvikling og voksenlivet. Til tross for sin begrensning i målretting bare en undergruppe av celler, disse systemene gir en enestående hastighet og brukervennlighet i forhold til mer konvensjonelle metoder, jegn særlig arbeidskrevende og tidkrevende generasjon av transgene mus. Likevel, til tross denne likheten, flere forskjeller mellom de to teknikkene som er verdt å nevne. Først med hensyn til målretting av ulike celletyper, i utero elektroporering fører innledningsvis til transfeksjon av stamceller riktig (også kalt radial gliacellene) fordi disse er de eneste cellene avgrensende ventrikkelen der DNA er injisert. Som et resultat av celledelinger vil plasmider senere bli arvet fra målrettede, mor stamceller til deres progenitor-og / eller neuronal datterceller fører til omfordeling av transfekterte celler i hele cortex som en funksjon av tid. I kontrast, fører bruken av HIV lentiviruses i den voksne hjernen til den samtidige infeksjon av en celle type inkludert stamceller, forfedre, nevroner samt modne gliaceller. Av notatet, med hensyn til å bruke HIV lentiviruses i motsetning til mer brukte retrovirus er det faktumat lentiviral integrasjon ville skje uavhengig av mitotisk staten celler, og dermed gir målretting også av voksne, lydige stamceller.
Sekund, er en annen viktig forskjell mellom elektroporering og viral infeksjon som et forbigående, episomal uttrykk oppnås ved den tidligere, i motsetning til den irreversible integrering av DNA i genomet av infiserte celler oppnådd ved sistnevnte. Som et resultat av etterfølgende celledelinger, fortynning av electroporated plasmider, og nedbrytning av ektopisk cyclinD1 protein, ville ensue hver cellesyklus. Dermed ble utvidelse av NSC under embryonal utvikling vist seg å bare vare i ca to dager 15 mens i den voksne hjernen denne effekten ble funnet å varer i flere måneder (upubliserte resultater).
Tredje, siden jeg) cdk4/cyclinD1 har en sterkere effekt på celler med en lengre G1 og ii) begått nevrale stamceller under utvikling har en lengre cellesyklusenn stamceller mens det motsatte gjelder i voksen alder, ble våre to manipulasjoner funnet å utløse utvidelse, i første rekke nevrale stamceller under utvikling og stamceller i voksen alder. I begge tilfeller en økning i nevroner er blitt oppnådd ved begge metoder.
Fjerde, viral injeksjon kan enkelt utføres, pålitelig og reproduserbart, i mange forskjellige regioner av den voksne hjernen ved å endre stereotaksiske koordinater. I kontrast, kan nøyaktig målretting av visse områder av sentralnervesystemet, for eksempel hjernestammen, hippocampus formasjon eller ryggmargen, etter in utero elektroporering være vanskeligere å oppnå reproduserbar. Videre, mens stereotaksiske injeksjon kan utføres på mus i alle aldre, er optimal ytelse i utero electroporation begrenset fra om E11 til E16. Stadier før E11 ville kreve enten bruk av en ultralyd tilbakespredning mikroskop 18,19 eller en hel embryo kulture system 17,20.
Nylig har en økende interesse for grunnleggende cellebiologi av somatiske stamceller blitt forfremmet fordi deres studier og manipulasjon er tenkt å være grunnleggende å utvikle nye celle-baserte regenerativ behandling. Særlig for overuttrykte cdk4/cyclinD1 gir vår protokoll midlene til forbigående øke utvidelsen av NSC in vivo (figur 3B og C og 4B og C) for å øke antall nevroner genereres i den voksne hjernen. Vi tror at disse manipulasjon kan være viktig i en rekke forskjellige sammenhenger å bedre forstå rollen NSC i hjernens utvikling, evolusjon og homeostase samt deres bidrag til kognitiv funksjon eller utvinning fra nevrale degenerasjon eller skade.
Disclosures
BA og FC har levert en patentsøknad beskriver den betingede utvidelse av voksne somatiske stamceller ved cdk4/cyclinD1 virus (EP 10160288.6).
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Senter for regenerativ behandling, Det medisinske fakultet av TU Dresden, og DFG Collaborative Research Center SFB655 (delprosjekt A20). BA ble støttet av et fellesskap av digs-BB-programmet, Dresden. Vi takker legene. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie, og Ravi Jagasia for verdifulle råd under opprettelsen av i utero electroporation og stereotaksiske viral injeksjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
- Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. , Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
- Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
- Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
- Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
- Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
- De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
- Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
- Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
