Summary
Контроль за расширение соматических стволовых клеток является основным фактором, препятствующим их изучения и использования в терапии. Здесь мы опишем систему управления временно нейронных стволовых клеток расширения во время развития и зрелости, которые могут быть использованы для увеличения числа нейронов генерируются в мозге мыши.
Protocol
Предварительное замечание
Операция должна быть выполнена полностью подготовленных следователей по согласованию с местными органами власти для животных. Все меры предосторожности должны быть приняты, чтобы минимизировать боль и стресс причиненного животным, включая глубокий наркоз, администрация послеоперационного обезболивания, а для операции длительностью более 10 мин, применение глаз смазкой, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы и слепоту. Наркозом мышей должен постоянно теплая при 37 ° С до полного выздоровления, и каждый хирургический инструмент и решения должны быть стерильными. Хотя использование биологических капот не является строго необходимым, оператор должен принять все разумные меры, чтобы свести к минимуму возможность заражения животного во время операции, надев халат, маску и перчатки. Кроме того, каждый шаг в области сбора и использования вирусов должны быть разрешены и должны быть выполнены в S2 районы в соответствии с нормативными правовыми актами местных органов власти.Наконец, тщательное обеззараживание всех инструментов и поверхностей, которые могли быть в контакте с вирусами должны быть выполнены в соответствии с утвержденными центр дезинфекции практики (на ВИЧ, вытирая с 70% Et-OH и / или автоклавирования).
Часть 1: Расширение эмбриональные НСК
1. Кроме электропорации внутриутробно
- После клонирования трансгенов (т.е. cdk4/cyclinD1) в ПКМ-EGFP (Clontech) или pDSV-mRFPnls векторов 16, очистить плазмид использованием EndoFree комплект и ресуспендируют в стерильном PBS до концентрации 3-5 мкг / мкл. Вскоре перед операцией, смешать плазмид с 0,05% FastGreen в PBS в конечной отношение ок. 4:04:01 и центрифугируют смесь в течение 2 мин при 16000 мкг, чтобы удалить все осадки.
- Загрузите ДНК смесь в ранее вытащил из боросиликатного стеклянный капилляр. Тяговая параметров с помощью P-97 пипетки съемника являются: тяга: 200; Vel: 140; время: 140. Тепло дает рампы теста и зависит от спецификацииБР много капилляров используется. Установите капиллярную на сопло PicoPump, что находится недалеко от внутриутробного электропорации платформу (рис. 1а), а при стереомикроскопа, согнуть ее кончик и ник он в точке перегиба.
- Стерилизовать всех хирургии инструменты в сухом стерилизаторе стеклянная бусина и глубоко обезболить беременных мышей на 12-15 день беременности использовании изофлурана испарителя. Поместите животных в положении лежа на спине на отопление установлен на уровне платформы 37 ° C и держать под постоянным изофлуран администрации через носовой конус.
- Бритье кожи живота, дезинфекции Betaisodona несколько раз, в конце концов вытирая между ними с 70% этанола, и придать бупренорфин (разводят в PBS) подкожно в дозе 0,1 мг / кг концентрация в качестве преимущественного анальгетик. Использование тонких ножниц, сделать 2 см продольный разрез кожи и, соответственно, базового мышечной стенки для доступа в брюшную полость. Внесите в брюшной полости около. 2ИЭГ мл раствора (D-PBS, содержащий 100 ЕД / мл пера / стрептококковая), предварительно нагретой при 37 ° C и поддерживать решения на нагревательный блок.
- Крышка мыши стерильной Drap содержащих трещины, из которых матки будет удалена. Уберите разрез использованием вольфрамового втягивающим, определить матки и вытащить его держа его пинцетом между соседними эмбрионов (рис. 1б; слева) и, наконец, отдать ее на стерильную Drap. Во время всей операции, промыть матки с IUE решение для увлажнения органов и полости тела и предотвращает обезвоживание животных.
- Ручка матки тщательно держа ее между большим и указательным и превратить одного эмбриона до его голова видна и ориентирован на оператора. Определение конечного мозга полушарий и ввести одну из них из спинно-боковой стороны. Выпуск 1-2 мкл раствора ДНК помощью педали из PicoPump пока желудочка очерчена FastGreen (рис. 1б; справа).
- Когда все эмбрионы вводят и электропорации, поместить в матку обратно в брюшную полость и закрыть мышечной стенки с шовный строку ушивание каждые 3-4 мм. Узлы должны быть плотно к мышце, но не слишком туго, чтобы немного отек тканей. Наконец, закройте вышележащих кожи с помощью металлических зажимов. Лечить кожу Betaisodona, удалите мышь от изофлуран маску и передать его в корпус клетке, когда окончательно проснулся. Следить за восстановление мыши, пока опорно-двигательного поведение является нормальным.
2. Обработка образцовPLE
- Один или несколько дней после электропорации, пожертвовать мыши, сбор эмбрионов и определить те правильно электропорации с помощью флуоресцентного стереомикроскопа (рис. 1D). Препарировать мозг на ледяной PBS, и закрепить их на ночь в 4% PFA (параформальдегида в фосфатный буфер рН 7,4). В конце концов, BrdU может быть введен до жертвы по разным парадигмам, чтобы исследовать кинетику клеточного цикла и пролиферации клеток 3.
- Мозги затем обрабатываются для резки и иммунной для нескольких маркеров радиальной глии, базальные предшественников и нейроны (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 и т.д.), чтобы оценить эффект функционального трансгенов на целевые НБК и их потомства, которые определены по выражению совместно электропорации гена-репортера.
Рисунок 1.В электропорации внутриутробно. (А) Схематическое представление в платформу электропорации внутриутробно. (B) чертежи с указанием расположения беременной мыши во время операции (справа) и инъекции ДНК / FastGreen смеси (синий) в полушария конечного мозга эмбриона мыши (слева). (C) схема, показывающая расположение электродов в контакте с маточной стенки с анода (+) рядом с местом инъекции (синий). Стрелки указывают на миграцию ДНК к аноду. (D) Изображение эмбриона мыши через 24 часа после электропорации с плазмидами GFP в эмбриональный день 13. Пунктирная линия разграничивает конечного мозга полушария. Схема в редактировался Calegari и соавт., 2004 17.
Часть 2: Расширение взрослых НСК
1. Производство ВИЧ-вирусных частиц, полученных
- День 1: плита 5 х 10 6 клеток 293Т на 10 смБлюдо с 8 мл D-MEM, содержащей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки и 100 ЕД / мл ручка / стрептококковой (культуральная среда). Использование 15 блюд для одного вирусного препарата и культуры в течение ночи при 37 ° C, 5% CO 2.
- День 2: для каждого блюда, развести в 1 мл простого D-MEM 5 мкг каждого из 3 плазмиды, кодирующие я) VSVG (везикулярного стоматита типа вируса G) белок оболочки, II) кляп / Pol (группа специфический антиген / полимераза) и III) полицистронный построить выражающих функциональную и репортер трансгенов (т.е. cdk4/cyclinD1/GFP), ранее клонированы в ВИЧ на основе вектора переноса (p6NST90) 9. Смешайте этот раствор по 1 мл D-MEM, содержащую 45 мкл полиэтиленимин, которые были предварительно растворенного в PBS в концентрации 1 мг / мл маточного раствора и инкубировать в течение 15-30 мин при комнатной температуре. В то же время, извлеките носитель из клеток и добавляют 4 мл на чашку свежего D-MEM, содержащей 15% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки и 100 ЕД / мл ручка / стрептококк. Добавить 2 мл смеси трансфекции и культуры в течение ночи.
- День 3: добавить 120 мкл 500 мМ Na-бутират за блюдо для повышения экспрессии трансгенов, аккуратно перемешать и культуры в течение 6-8 часов, после чего заменить трансфекции среду с 5 мл питательной среды.
- День 4: собирают супернатант (около 70 мл общего объема), проходит через фильтр 0,22 мкм и передачи в 2 polyallomer пробирок (35 х 89 мм). Ультрацентрифуга на 110000 х г в течение 90 мин при 4 ° С с использованием качели ротора. Удалите супернатант, добавить 6 мл PBS в каждую пробирку и инкубируют на льду в течение 1 часа. Ресуспендируют гранул и передать его в одном polyallomer центрифужные пробирки (14 х 95 мм). Ультрацентрифуга на 110000 х г в течение 90 мин при 4 ° С с использованием качели ротора. Удалите супернатант, ресуспендируют осадок в 50 мкл PBS, составит 5 мкл аликвоты и хранят при температуре -80 ° C. Титр вируса будет находиться в диапазоне 10 8 -10 9 КОЕ / мл. (Примечание: вирусы очень чувствительны к температуре и хранения, AVOID повторного замораживания, держать в сухом льду во время транспортировки и скоро оттепель перед использованием.)
2. Стереотаксическая инъекций
- Anesthetize 6-10 недель мыши с изофлурана и поместить животное в положении лежа на стереотаксической рамы (рис. 2A) с помощью уха баров и неба поддержке должным образом зафиксировать голову. Животное теплым на грелку установлен на уровне 37 ° С и при постоянном изофлуран администрации.
- Вводят подкожно по 100 мкл рабочего раствора бупренорфина в качестве преимущественного обезболивающее, бритье полоса кожи на голове мыши, и desinfect, как описано в 1.4. Использование скальпеля, сделать ок. 1,5 см длиной продольный разрез на коже головы подвергая черепа на уровне сагиттального шва. Уберите кожи и осторожно очистите поверхность кости стерильным ватным тампоном.
- Half-заполнит стеклянный капилляр (спецификации 1.2) с парафиновой нефти и смонтировать его на насос-форсунка вставкикапиллярная до второго кольца (рис. 2В). Перемещение капиллярной держатель на оси х, у и г до кончика капилляра расположен на брегмы, совместно точке между сагиттальной и боковые швы (рис. 2) (будет определяться с помощью стереомикроскопа), и повторного набора х, у, г значения на 0.
- Переместить капилляра ± 1,6 мм в медио-поперечной оси (х) и -1,9 мм в передне-задней оси (у) и отметьте кости с помощью хирургического маркером. Сделайте отверстие ок. Диаметром 0,5 мм на черепе с помощью электрической бурильщика обращая внимание, чтобы не повредить мозг.
- Положить 5 мкл капли вирусной суспензии (1 аликвоты) на куске парафильмом размещены на ухо баров и погрузиться наконечник капилляра в капле. Сосать ок. 3,5 мкл вирусной суспензии использованием nanoliter инжектор установлен на уровне 55 л / сек. Выполнение этого шага быстро, как капли будут испаряться.
- Перемещение капиллярной на сайт оинъекций F и переместите его вниз, пока кончик не коснется поверхности мягкой мозговой оболочки. Сброс спинно-вентральной оси значений (г) до 0. На данный момент, проникают в ткани с капиллярной за -1,9 мм и отпустите 1,5 мкл вирусной суспензии в размере 4 NL / сек. Подождите 2-3 минуты, чтобы свести к минимуму обратного вирусного корыта подвески капиллярной дорожке, а затем убрать капилляров. Вторая инъекция может быть выполнена в controlateral полушарии.
- Шва кожи, вылечить, и позволяют животному, чтобы оправиться от наркоза, как описано выше для внутриутробно электропорации (1,8).
Рисунок 2. Стереотаксическая вирусные инъекции. (А и B) Схематическое изображение компонентов, необходимых для выполнения стереотаксической инъекции (А) и разобрали капиллярной держатель показывает вставки окpillary до второго кольца (B). (C) Изображение мыши голову иммобилизованных на слух баров и неба поддержку с кожей разрезать, чтобы разоблачить черепа (слева). Увеличение пунктирную рамку (справа) показывает, боковые и сагиттального швов, брегмы, и в месте инъекции (круг).
3. Обработка образца
- Один-три недели после заражения, заливать мыши с ок. 100 мл 4% PFA, препарировать мозг и пост-это исправить в течение ночи в 4% PFA. В конце концов, BrdU и / или тамоксифен может быть введен до жертвы по разным парадигмам, чтобы исследовать кинетику клеточного цикла и, чтобы остановить выражение вирусных трансгенов в окружении сайтов loxP, соответственно, 9.
- Мозг может быть обработан для иммунной использовании нескольких маркеров стволовых и предшественники клеток и нейронов (например, Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublecortin и т.д.).
Representative Results
- В целом, в электропорации внутриутробно дает 60-80% электропорации эмбрионов отображения сильное выражение гена-репортера в широком площадь боковой коры (рис. 3А). Флуоресцентные белки могут быть легко обнаружены на всей эмбрионов крепление, как только 3-6 часа после операции с сигналом продолжительностью более одной недели. В рамках целевой области, около 30-50% клеток обычно выражают трансген (ы) с долей клеток совместно выразить двумя (или более) совместно электропорации трансгенов бытия как правило, выше 90% (рис. 3В, левое) 6,8 , 15. В то время как минимальный уровень апоптоза (около 2.0-2.5%) можно было наблюдать примерно через 2 часа после электропорации, это значение будет вернуться в физиологическом уровнях (около 0.5-1.0%) после 6 часов (FC, неопубликованные данные). Доля эмбрионов или беременных мышей смерти в результате операции, как правило, незначительна (<5%). Co-электропорации с cdk4/cyclinD1 в этих условиях, затем 48 часов развития вызывает увеличение расширения нейронных предшественников на 30% (рис. 3В, справа, и C) 15.
Рисунок 3. Расширение нейронных предшественников по cdk4/cyclinD1 гиперэкспрессия. (A) флуоресценции картина разреза боковой коры эмбрионов мышей через 24 часа после электропорации с GFP и RFP плазмид в эмбриональный день 13. (B) Флуоресцентные фотографии, как и в течение 48 часов после совместного электропорации с cdk4/GFP и cyclinD1/RFP плазмид и иммунного для базисной маркер предшественников Tbr2. Флуоресцентные журналистов с DAPI counterstainig (слева) и Tbr2 (справа) показаны. Линии указывает на апикальной поверхности вентрикулярной зоне (VZ, белые линии) и границы субвентрикулярной зону (СВЗ, желтые пунктирные линии). Обратите внимание на повышенный Тхиckness из SVZ в электропорации часть коры (белые стрелки) за счет увеличения выработки и расширение базального предшественников после того, как избыточная экспрессия cdk4/cyclinD1. (C) Количественный эффект показан на B. Bars = SD, р <0,05, п = 3. Гистограмма в C взята из Lange и соавт., 2009 15.
- После вирусной стереотаксической инъекции, ок. 80% оперированных мыши обнаруживают сильную экспрессию трансгенов на протяжении всего зубчатой извилины. Учредительный выражения GFP может быть легко обнаружена на 40 мкм разделы, как только через 4 дня после операции. Наряду ростральной к хвостовой оси зубчатой извилине, около 10-30% клеток (эквивалент в общей сложности ок. 10,000-30,000 клеток) обычно выражают трансген (ы) (рис. 4а) 9. Доля мышей умирают из-за операции незначительна (<5%). Три недели сверхэкспрессия cdk4/cyclinD1 в этих условиях вызывает увеличение НСК более чем на два-складки (рис. 4, б) при уменьшении нейрогенеза на 70% (рис. 4С) 9.
Рисунок 4. Воздействие вирусной инфекции. (A) 3D реконструкции 7 флуоресценции фотографии взяты из толщиной 40 мкм серийный корональные разделы (сбор 1 раз в 6) по ростральной к хвостовой оси гиппокампа. GFP + инфицированных клеток (зеленый) и DAPI окрашивание ядер (синий) в зубчатой извилине показаны (сверху). Яркие фотографии области корональных разделы, соответствующие показанным на (в центре) и 3D-представление (нижней) части целого полушария с гиппокампе выделены зеленым цветом псевдоцвете (с изменениями от Allen мозга Атлас; www.brain-map.org ) . Белые стрелки указывают в месте инъекции. Боковой (L), ростральной (R), и дорSAL (D) оси (х, у, г стереотаксических координат) указаны (справа). (B и C) Доля нестин + NSC (B) и DCX + новорожденных нейронов (C) в популяции GFP + инфицированных клеток через 3 недели после стереотаксической инъекции GFP (белый) или cdk4/cyclinD1/GFP (черный) вирусов. Бары = SD, р <0,005; п = 3. Графики в B и C взяты из Artegiani и соавт., 2011.
Discussion
Важным шагом для электропорации в внутриутробно является качество и чистоту ДНК, так как его направленности миграции во время родов электрического поля зависит от его заряда. Протоколы для очистки ДНК, которые не включают в себя удаление дополнительных заряженных молекул, таких как эндотоксины, может привести к маскировке природной ДНК отрицательных зарядов приводит к доставке бедных. Очевидно, касаясь стен матки с электродами как можно ближе к области, чтобы быть нацелены улучшить электропорации эффективности. Не менее важным является качество используемых электродов, так как это является основой для предоставления оптимального электрического поля. Микро-царапины не видно на глаз и / или органических остатков, таких как следы сыворотки, липидов и т. д., неизбежно накапливаются с течением времени приводит к потере электродами своих свойств. Старые и / или грязные electropes являются наиболее вероятной причиной резкого падения электропорации эффективность и, таким образом, должно быть тeplaced, как только это заметили. В то время как относительно простые, в электропорации внутриутробно обычно требуется несколько недель тренировок, чтобы достичь удовлетворительного и воспроизводимые результаты. Этот метод очень универсален, поскольку она может быть применена практически к любому органов и тканей развивающегося эмбриона. Конечно, содержащий органов полости, таких как головной мозг, особенно легко на цель и обеспечить высокую долю трансфицированных клеток из-за легкости потребителей инъекционных относительно большой объем ДНК.
Общей проблемой столкнулись в создании стереотаксической вирусных инъекций иметь несколько зараженных клеток и / или целевой нежелательных местах. Первая проблема в основном связана с введением низким титром вируса. 293T клетки с меньшим числом проходов в культуре растут быстрее и привести к повышению титров вируса. Использование клеток старше ок. 20 проходов не рекомендуется и средства трансфекции с менее чем 80% эффективности не обеспечит хорошеевирусной производства. Ресуспендирование вирусных гранул также имеет важное значение, вирусной суспензии должен появиться однородной и вирусных сгустки, которые могут закупоривать капиллярной следует избегать. Вирусы очень чувствительны к перепадам температуры и длительного хранения. По этим причинам, аликвоты должны быть постоянно хранится при температуре -80 ° C и не может быть замораживать. Даже в этих условиях, снижение инфекционной можно было наблюдать через 6-12 месяцев хранения. В учебной фазы, мы рекомендуем проверить титр вируса каждого вирусного препарата и сделать это еще раз после длительного хранения. Наличие инфицированных клеток в нежелательных областях мозга может зависеть от оптимального позиционирования мыши голову на стереотаксической рамы, которая требует некоторой практики. Кроме того, очень важно, чтобы не повредить поверхность мозга, открывая отверстие в черепе, потому что в противном случае он не будет возможно сбросить от 0 правильно, на поверхности мягкой мозговой оболочки, в результате неточного инъекций. Координатыпри условии, что мы в этом протоколе говорится C57/BL6 6-10 недель женщин, и мы предлагаем их оптимизации для различных деформаций / возрасту / полу. Приобретение этой техники может потребовать больше времени, чем внутриутробно электропорации в связи с чем дольше фазы, необходимой для подготовки вирусов и анализа образцов. Мы настоятельно рекомендуем вирусов используются только после операции мыши и стереотаксической инъекции стали надежным и воспроизводимым. Первым шагом к достижению этой цели является инъекционные клеточной ДНК проникающих красителей, таких как Hoechst 33342, в эвтаназии мыши и анализировать мозг немедленно.
В внутриутробно электропорации и стереотаксической инъекции вирусных два мощных систем остро и тканей специально манипулировать экспрессии генов в ЦНС млекопитающих во время развития и зрелости. Несмотря на свою ограниченность в таргетингом только на субпопуляции клеток, эти системы обеспечивают беспрецедентную скорость и простота по сравнению с более традиционными методами, яN частности трудоемкая и отнимает много времени поколение трансгенных мышей. Однако, несмотря на это сходство, некоторые различия существуют между этими двумя методами, которые стоит упомянуть. Во-первых, в связи с нападкам на различные типы клеток, в электропорации внутриутробно первоначально приводит к трансфекции стволовых клеток собственного (также называемые радиальные глии), потому что только эти клетки разграничения желудочка, где ДНК вводят. В результате деления клеток, плазмиды будет впоследствии унаследовала от целевых, материнские клетки стволовые своих предшественников и / или нервных клеток дочь, ведущих к перераспределению трансфицированных клеток по всему коры как функция времени. В противоположность этому, использование лентивирусов ВИЧ-инфекции во взрослом мозге приводит к одновременному заражения других типов клеток, включая стволовые клетки, предшественники, нейроны, а также глиальные клетки зрелой. Следует отметить, что в связи с использованием лентивирусов ВИЧ, в отличие от наиболее часто используемых ретровирусов является тот факт,лентивирусов, что интеграция будет происходить независимо от митотического состояния клеток, что позволяет адресности и взрослых, спокойных стволовых клеток.
Во-вторых, еще одно важное различие между электропорации и вирусные инфекции является то, что преходящее, эписомные выражении достигается за счет бывших в отличие от необратимой интеграции ДНК в геном инфицированной клетки достигается последнего. В результате последовательных клеточных делений, разведение электропорации плазмиды, и деградация внематочной cyclinD1 белка, будет вытекать в каждом клеточном цикле. Таким образом, расширение НСК во время эмбрионального развития был показан лишь в течение примерно двух дней 15 в то время как мозг взрослого человека этот эффект оказался длится в течение нескольких месяцев (неопубликованные результаты).
В-третьих, поскольку я) cdk4/cyclinD1 имеет более сильный эффект на клетки с большей G1 и б) совершенные нейронных предшественников во время разработки имеют более клеточного циклачем стволовые клетки, в то время как противоположное справедливо во взрослом возрасте, наши две манипуляции были найдены, чтобы вызвать расширение, в первую очередь, нейронных предшественников во время разработки и стволовых клеток во взрослом возрасте. В любом случае рост нейронов была достигнута обоими методами.
В-четвертых, вирусные инъекции могут быть легко выполнены, надежно и воспроизводимо, в различных регионах мозга взрослого человека, просто изменив стереотаксических координат. В отличие от точного нацеливания некоторых регионах центральной нервной системы, такие как ствол головного мозга, гиппокампа, или спинного мозга, в в электропорации внутриутробно может быть более трудно достичь воспроизводимо. Кроме того, в то время как стереотаксической инъекции могут быть выполнены на мышах любого возраста, оптимальной производительности в электропорации внутриутробно ограничен примерно от E11 до E16. Этапы до E11 потребуется либо использование микроскопа ультразвукового обратного рассеяния 18,19 или целый культ эмбрионаЮр системы 17,20.
В последнее время возрастает интерес к фундаментальной биологии клетки соматические стволовые клетки был повышен, потому что их исследования и манипуляции, как считается фундаментальным к разработке новой клеточной восстановительной терапии. В частности, для сверхэкспрессии cdk4/cyclinD1, наш протокол предоставляет средства для transitorily увеличить расширение НСК в естественных условиях (рис. 3В и С и 4В и C), с тем чтобы увеличить число нейронов генерируется во взрослом мозге. Мы считаем, что эти манипуляции могут иметь важное значение в ряде различных контекстов, чтобы лучше понять роль НБК в развитии мозга, развитие и гомеостаза, а также их вклад в когнитивные функции или восстановление нейронной дегенерации или травмы.
Disclosures
BA и ФК подали заявку на патент описывающий условные расширение клеток взрослого соматические стволовые cdk4/cyclinD1 вирусы (EP 10160288,6).
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Центром по регенеративной терапии, медицинский факультет ТУ Дрездена, и DFG совместных научно-исследовательский центр SFB655 (подпроект A20). BA была поддержана общение DIGS-BB программы, Дрезден. Мы благодарим доктора. Норико Osumi, Tadashi Nomura, Дитер Chichung Ли, и Рави Jagasia за ценные советы при создании внутриутробно электропорации и стереотаксической вирусные инъекции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
- Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. , Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
- Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
- Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
- Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
- Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
- De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
- Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
- Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
