Summary
El control de la expansión de células madre somáticas es un factor importante que impide su estudio y uso en terapia. Aquí se describe un sistema para controlar temporalmente madre neural expansión células durante el desarrollo y la edad adulta, que se puede utilizar para aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro de ratón.
Abstract
Células madre somáticas se pueden dividir para generar células madre adicionales (expansión) o tipos de células más diferenciadas (diferenciación), que es fundamental para la formación de tejidos durante el desarrollo embrionario y la homeostasis del tejido durante la edad adulta 1. Actualmente, se invierten grandes esfuerzos hacia el control del interruptor de las células madre somáticas de la expansión a la diferenciación porque este se cree que es fundamental para el desarrollo de nuevas estrategias para el 1,2 medicina regenerativa. Sin embargo, un reto importante en el estudio y el uso de células madre somáticas es que su expansión se ha demostrado ser muy difícil de controlar.
Aquí se describe un sistema que permite el control neural de la madre / progenitoras de células (en conjunto denominado NSC) de expansión en la corteza de embriones de ratón o el hipocampo adulto mediante la manipulación de la expresión del complejo cdk4/cyclinD1, un importante regulador de la fase G1 del ciclo celular y de células madre somáticas differentiation 3,4. En concreto, dos enfoques diferentes son descritos por la que el complejo cdk4/cyclinD1 se sobreexpresa en NSC in vivo. Por el primer enfoque, la sobreexpresión de los reguladores del ciclo celular se obtiene mediante la inyección de plásmidos que codifican para cdk4/cyclinD1 en el lumen del telencéfalo ratón seguido por electroporación en el útero para entregarlos a NSC de la corteza lateral, por lo tanto, la activación de la expresión episomal transgenes 5-8. Por el segundo método, altamente concentrados derivados del VIH virus se inyectaron estereotáxicamente en el giro dentado del hipocampo del ratón adulto, por lo tanto, provocando la expresión constitutiva de los reguladores del ciclo celular después de la integración del constructo viral en el genoma de las células infectadas 9. Ambos enfoques, cuyos principios básicos fueron ya descritos por otros protocolos de vídeo 10-14, se optimizaron para i) reducir los daños en los tejidos, ii) porciones deseadas de todo el cerebro muy específicas regions, iii) obtener un alto número de células manipuladas dentro de cada región, y iv) provocar altos niveles de expresión de los transgenes dentro de cada célula. La sobreexpresión transitoria de los transgenes utilizando los dos enfoques se obtiene por diferentes medios es decir, por dilución natural de los plásmidos electroporados debido a la división celular o la administración de tamoxifeno en Cre que expresan NSC infectados con virus que transportan cdk4/cyclinD1 flanqueado por sitios loxP, respectivamente 9,15 .
Estos métodos proporcionan una plataforma muy poderosa para manipular tejido agudamente y específicamente la expresión de cualquier gen en el cerebro de ratón. En particular, mediante la manipulación de la expresión del complejo cdk4/cyclinD1, nuestro sistema permite el control temporal de la expansión NSC y su interruptor a la diferenciación, por lo tanto, en última instancia, el aumento del número de neuronas generadas en el cerebro de los mamíferos. Nuestro enfoque puede ser de importancia crítica para la investigación básica y el uso de células madre somáticas para la terapiade los mamíferos del sistema nervioso central mientras que proporciona una mejor comprensión de i) detener contribución a la formación de tejido de células durante el desarrollo, ii) la homeostasis del tejido durante la edad adulta, iii) el papel de la neurogénesis adulta en las funciones cognitivas, y quizás, iv) mejor usando madre somáticas células en modelos de enfermedades neurodegenerativas.
Protocol
Nota preliminar
La cirugía debe ser realizada por investigadores entrenados completamente tras la aprobación de las autoridades locales para el bienestar animal. Todas las precauciones se deben tomar para minimizar el dolor y el estrés causado al animal, incluyendo anestesia profunda, la administración de analgesia postoperatoria y, para las operaciones que duran más de 10 minutos, la aplicación de un lubricante ocular para prevenir la deshidratación corneal y ceguera. Ratones anestesiados deben mantenerse constantemente caliente a 37 ° C hasta su recuperación completa y todas las herramientas quirúrgicas y la solución debe ser estéril. Aunque el uso de una campana biológica no es estrictamente necesario, el operador debe tomar todas las precauciones necesarias para reducir al mínimo la posibilidad de infectar al animal durante la operación con el uso de una bata, mascarilla y guantes. Del mismo modo, cada paso sobre la generación y el uso de virus debe ser autorizado y debe llevarse a cabo en áreas S2 de acuerdo con las regulaciones de las autoridades locales.Finalmente, una descontaminación completa de todas las herramientas y las superficies que podría haber estado en contacto con los virus deben ser realizados de acuerdo con las prácticas de las instalaciones aprobadas desinfección (para el VIH, limpiando con 70% Et-OH y / o esterilización en autoclave).
Parte 1: Expansión de Embryonic NSC
1. En la electroporación in utero
- Después de la clonación de los transgenes (es decir cdk4/cyclinD1) en PCMS-EGFP (Clontech) o pDSV-mRFPnls vectores 16, purificar los plásmidos usando kit EndoFree y se resuspende en PBS estéril a una concentración de 3-5 g / l. Poco antes de la cirugía, se mezclan los plásmidos con 0,05% FastGreen en PBS a una relación final de ca. 04:04:01 y se centrifuga la mezcla durante 2 minutos a 16.000 xg para eliminar todo precipitados.
- Cargar la mezcla de ADN en un vaso previamente sacó borosilicato capilar. Tirando parámetros utilizando una pipeta P-97 Extractor son: extracción: 200; vel: 140; hora: 140. El calor es dada por un ensayo de la rampa y depende de la especificaciónmucho ific de capilares que se utiliza. Montar el capilar en la boquilla de la PicoPump que está cerca de la plataforma en la electroporación in utero (Figura 1A) y, bajo un microscopio estereoscópico, doblar su punta y nick en el punto de inflexión.
- Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un vaso seco esterilizador de cuentas y profundamente anestesiar a un ratón embarazada en el día 12-15 de gestación utilizando un vaporizador de isoflurano. Colocar el animal en posición supina sobre una plataforma de calefacción a 37 ° C y mantener bajo administración isoflurano constante a través de un cono nasal.
- Afeitar la piel del abdomen, desinfectar con tiempos de Betaisodona múltiples, eventualmente limpiar entre en con 70% de etanol, y se inyecta la buprenorfina (diluido en PBS) por vía subcutánea a 0,1 mg / kg de concentración como preventivo analgésico. Usando unas tijeras finas, realizar un corte longitudinal de 2 cm de la piel y, posteriormente, de la pared subyacente muscular para acceder a la cavidad peritoneal. Vierta en la ca cavidad peritoneal. 2ml de solución de IUE (D-PBS que contenía 100 U / ml de penicilina / estreptomicina) precalentado a 37 ° C y mantener la solución en un bloque de calentamiento.
- Cubra el ratón con drap estéril que contiene una grieta de la que se retira el útero. Retirar la incisión con un retractor de tungsteno, identificar el útero y tire de ella sujetándola con pinzas entre embriones adyacentes (Figura 1B; izquierda) y, finalmente, se tendió en el drap estéril. Durante toda la operación, enjuagar el útero con solución de IUE para hidratar la cavidad de órganos y el cuerpo y prevenir la deshidratación del animal.
- Maneje con cuidado el útero lo sostiene entre los dedos pulgar e índice y gire un embrión hasta que su cabeza es visible y orientada hacia el operador. Identificar los hemisferios telencefálicas e inyectar uno de ellos desde el lado dorso-lateral. Liberar 1-2 l de la solución de ADN usando el interruptor de pie de un PicoPump hasta el ventrículo se describe por FastGreen (Figura 1B; derecha).
- Cuando todos los embriones son inyectados y electroporación, colocar el útero en la cavidad abdominal y cerrar las paredes musculares con una cadena de sutura para suturar cada 3-4 mm. Los nudos debe ser ajustado para el músculo, pero no demasiado apretado para permitir una ligera hinchazón del tejido. Por último, cierre la piel que lo recubre con clips metálicos. Desinfecte la piel con Betaisodona, quitar el ratón de la máscara de isoflurano y la transfiere en una jaula de la vivienda cuando está completamente despierto. Controlar la recuperación del ratón hasta que el comportamiento locomotor es normal.
2. Tratamiento de la sample
- Uno o más días después de la electroporación, sacrifica el ratón, recoger los embriones e identificar aquellas correctamente electroporación utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Figura 1D). Diseccionar el cerebro en PBS enfriado en hielo, y fijar durante la noche en 4% PFA (paraformaldehído en tampón de fosfato pH 7,4). Eventualmente, BrdU se puede administrar antes de sacrificio de acuerdo a diferentes paradigmas para investigar la cinética del ciclo celular y la proliferación celular 3.
- Los cerebros se procesan entonces para seccionar y la inmunotinción para los varios marcadores de la glía radial, progenitoras basal y las neuronas (Pax6, nestina, Tbr2, Tbr1, Tuj1 etc) para evaluar el efecto de los transgenes funcionales en específica NSC y su progenie que son identificado por la expresión del gen indicador co-electroporada.
Figura 1.En la electroporación in utero. (A) Representación esquemática de una plataforma en el útero de la electroporación. (B) los planos que muestran el posicionamiento del ratón embarazada durante la cirugía (a la derecha) y la inyección de la mezcla de ADN / FastGreen (azul) en el hemisferio telencephalic de un embrión de ratón (izquierda). (C) Esquema que muestra la colocación de los electrodos en contacto con las paredes del útero con el ánodo (+) adyacente al sitio de inyección (azul). Las flechas indican la migración del ADN hacia el ánodo. (D) Imagen de un embrión de ratón de 24 horas después de la electroporación con plásmidos GFP en el día embrionario 13. La línea de puntos delimita el hemisferio telencephalic. Esquema de una modificación de Calegari et al., 2004 17.
Parte 2: Ampliación del Consejo de Seguridad Nacional de Adultos
1. Producción de derivados del VIH partículas virales
- Día 1: placa de 5 x 10 6 células 293T en una de 10 cmplato con 8 ml de D-MEM que contiene 10% de inactivado por calor suero fetal bovino y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina (medio de cultivo). Utilice 15 platos para una preparación viral y la cultura durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Día 2: para cada plato, se diluye en 1 ml de D-MEM llano 5 g de cada uno de los 3 plásmidos que codifica para i) VSVG (tipo de virus de la estomatitis vesicular G) proteína de la envoltura, ii) gag / pol (antígeno específico de grupo / polimerasa) , y iii) un polycistronic construcción que expresa los transgenes funcionales y reportero (es decir cdk4/cyclinD1/GFP) previamente clonado en un vector de transferencia basado en VIH-(p6NST90) 9. Mezclar esta solución con 1 ml de D-MEM que contiene 45 l de polietilenimina que se ha disuelto previamente en PBS a 1 mg / ml de solución madre, y se incuba durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, eliminar los medios de comunicación de las células y añadir 4 ml por placa de D-MEM fresco que contiene 15% de inactivado por calor suero fetal bovino y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina. Añadir el m 2l de mezcla de transfección y cultivo durante la noche.
- Día 3: añadir 120 l de 500 mM Na-butirato por placa para mejorar la expresión de los transgenes, mezclar suavemente y cultura para 6-8 horas después de que reemplazar el medio de transfección con 5 ml de medio de cultivo.
- Día 4: recoger los sobrenadantes (ca. 70 ml en total), pasar a través de un filtro de 0,22 micras y transferencia en 2 tubos de centrífuga de polialómero (35 x 89 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando un rotor basculante. Desechar el sobrenadante, añadir 6 ml de PBS a cada tubo e incubar en hielo durante 1 hr. Resuspender el precipitado y transferirlo en un tubo de centrífuga de polialómero (14 x 95 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando un rotor basculante. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 50 l de PBS, hacer 5 ml de alícuotas y se almacena a -80 ° C. Título viral estará en el rango de 10 -10 8 9 ufc / ml. (Nota: los virus son muy sensibles a la temperatura y el almacenamiento avoIdentificación del re-congelación, mantener en hielo seco durante el transporte y descongelar poco antes de su uso.)
2. Inyección estereotáxica
- Anestesiar a un ratón 6-10 semanas de edad con isoflurano y colocar el animal en posición prona en un marco estereotáxico (Figura 2A) con las barras de soporte del oído y el paladar para fijar correctamente la cabeza. El animal se mantiene caliente en una almohadilla térmica a 37 ° C y bajo la administración de isoflurano constante.
- Inyectar por vía subcutánea 100 l de solución de trabajo buprenorfina como preventivo analgésico, afeitar una banda de piel de la cabeza del ratón, y desinfectar, como se describe en 1,4. El uso de un bisturí, hacer una ca. 1,5 cm de largo incisión longitudinal en la piel de la cabeza exponer el cráneo a nivel de la sutura sagital. Retirar la piel y limpie suavemente la superficie del hueso con un bastoncillo de algodón estéril.
- La mitad de llenar un vaso capilar (especificaciones de 1,2) con aceite de parafina y montarlo en la bomba de inyección de insertarel capilar hasta que el segundo anillo (Figura 2B). Mueva el soporte capilar en el eje x, y y z hasta que la punta del capilar se coloca en el bregma, el punto de conjunción entre las suturas sagital y lateral (figura 2C) (a ser determinado con la ayuda de un microscopio binocular), y re-conjunto x, y, y z valores a 0.
- Mueva el capilar por ± 1,6 mm en el eje medio-lateral (x) y -1,9 mm en el eje anterior-posterior (y) y marcar el hueso usando un lápiz marcador quirúrgico. Hacer un agujero de aprox. 0,5 mm de diámetro en el cráneo utilizando un perforador eléctrico teniendo cuidado de no dañar el cerebro.
- Poner una gotita de 5 l de suspensión viral (1 parte alícuota) en un trozo de Parafilm colocan en las barras del oído y sumergir la punta del capilar en la gotita. Suck ca. 3,5 l de suspensión viral usando un inyector nanoliter fijada en 55 nl / seg. Ejecutar este paso rápidamente a medida que la gotita se evapore.
- Mueva el capilar al sitio of inyección y moverlo hacia abajo hasta que la punta toca la superficie pial. Cambiar el valor del eje dorso-ventral (z) a 0. En este punto, penetrar en el tejido con el capilar de -1,9 mm y suelte 1,5 l de suspensión viral a una velocidad de 4 nl / s. Espere 2-3 minutos para minimizar el flujo de retorno de la cubeta de suspensión viral de la pista capilar y luego retraer el capilar. Una segunda inyección se puede realizar en el hemisferio contralateral.
- Suturar la piel, desinfectar, y permitir que el animal se recupere de la anestesia como se describe anteriormente en el útero para electroporación (1,8).
Figura 2. Inyección estereotáxica viral. (A y B) Representación esquemática de los componentes necesarios para realizar la inyección estereotáxica (A) y un soporte desmontado capilar que muestra la inserción de un capillary hasta que el segundo anillo (B). (C) Imagen de la cabeza de ratón inmovilizado por las barras para los oídos y el apoyo paladar con la piel cortada para exponer el cráneo (a la izquierda). La ampliación del cuadro de puntos (derecha) muestra las suturas laterales y sagital, el bregma, y el sitio de la inyección (círculo).
3. Procesamiento de la muestra
- Uno a tres semanas después de la infección, perfundir el ratón con ca. 100 ml de 4% de PFA, diseccionar el cerebro y posfijo de toda la noche en 4% de PFA. Eventualmente, BrdU y / o el tamoxifeno se puede administrar antes de sacrificio de acuerdo a diferentes paradigmas para investigar la cinética del ciclo celular y para detener la expresión de los transgenes virales flanqueado por sitios loxP, respectivamente 9.
- Entonces, el cerebro pueden ser procesados para inmunotinción usando varios marcadores de células madre y progenitoras y las neuronas (por ejemplo, Sox2, GFAP, nestina, Tbr2, doublecortin, etc).
Representative Results
- En general, en el útero de la electroporación produce 60-80% de los embriones electroporated muestran una fuerte expresión del gen informador en una amplia zona de la corteza lateral (Figura 3A). Las proteínas fluorescentes se puede detectar fácilmente en embriones de todo el montaje tan pronto como 3-6 horas después de la cirugía con la señal que dura más de una semana. Dentro de la zona específica, de aproximadamente 30-50% de las células normalmente expresan el transgén (s) con la proporción de células que co-expresan dos (o más) co-electroporadas transgenes siendo normalmente por encima de 90% (Figura 3B, a la izquierda) 6,8 , 15. Mientras que un nivel mínimo de apoptosis (ca. 2.0-2.5%) se observó después de aproximadamente 2 horas de la electroporación, este valor se vuelva a los niveles fisiológicos (ca. 0.5-1.0%) después de aproximadamente 6 horas (FC, datos no publicados). La proporción de embriones o ratones embarazadas morir debido a la cirugía es típicamente insignificante (<5%). Co-electroporación con cdk4/cyclinD1 bajo estas condiciones seguido por 48 horas de desarrollo provoca un aumento en la expansión de células progenitoras neurales en un 30% (Figura 3B, a la derecha, y C) 15.
Figura 3. Expansión de progenitores neurales por cdk4/cyclinD1 sobreexpresión. (A) Imagen de fluorescencia de una sección a través de la corteza lateral de un embrión de ratón 24 horas después de la electroporación con GFP y RFP plásmidos en el día embrionario 13. (B) las imágenes fluorescentes como en una 48 horas después de co-electroporación con plásmidos cdk4/GFP y cyclinD1/RFP y inmunomarcación para el marcador progenitor basal Tbr2. Reporteros fluorescentes con DAPI counterstainig (izquierda) y Tbr2 (derecha) se muestran. Líneas indica la superficie apical de la zona ventricular (VZ; línea blanca) y los límites de la zona subventricular (SVZ; amarillas líneas discontinuas). Tenga en cuenta el aumento de thickness de la SVZ en la porción electroporado de la corteza (puntas de flecha blanca) debido a un aumento de la generación y la expansión de progenitores basales después de la sobreexpresión de cdk4/cyclinD1. (C) Cuantificación del efecto se muestra en B. Bares = SD, p <0,05, n = 3. Gráfico de barras en C se toma de Lange et al., 2009 15.
- Después de la inyección estereotáxica viral, ca. 80% de los ratones operados por mostrar una fuerte expresión de los transgenes en toda la circunvolución dentada conjunto. La expresión constitutiva de GFP se puede detectar fácilmente en las secciones 40 micras tan pronto como 4 días después de la cirugía. A lo largo del eje rostral a caudal de la circunvolución dentada, alrededor del 10-30% de las células (equivalente a un total de ca. 10,000-30,000 células) normalmente expresan el transgén (s) (Figura 4A) 9. La proporción de ratones que mueren debido a la cirugía es insignificante (<5%). Tres semanas sobreexpresión de cdk4/cyclinD1 bajo estas condiciones provoca un aumento de NSC en más de dospliegues (Figura 4B), mientras que la disminución de la neurogénesis en un 70% (Figura 4C) 9.
Figura 4. Efectos de la infección viral. (A) reconstrucción en 3D de 7 imágenes de fluorescencia tomadas de 40 m de espesor de serie de secciones coronales (1 recoger cada 6) a lo largo del eje rostral a caudal del hipocampo. GFP + células infectadas (verde) y la tinción nuclear con DAPI (azul) de la circunvolución dentada se muestran (arriba). Imágenes de campo claro de las secciones coronales correspondientes a los mostrados en A (centro) y la representación en 3D (abajo) de todo el hemisferio cerebral con el hipocampo resaltados en verde pseudocolor (modificado a partir del Atlas Allen Brain; www.brain-map.org ) . Las flechas blancas señalan el sitio de la inyección. Lateral (L), rostral (R), y dorsal (D) ejes (x, y, y z estereotáxica coordenadas) se indican (a la derecha). (B y C) Proporción de nestin + NSC (B) y DCX + neuronas recién nacidas (C) dentro de la población de GFP + células infectadas por 3 semanas después de la inyección estereotáxica de las buenas prácticas agrarias (blanco) o cdk4/cyclinD1/GFP virus (negro). Barras = SD, p <0,005, n = 3. Los gráficos en B y C tomado de la Artegiani et al., 2011.
Discussion
Un paso crítico para la electroporación en el útero es la calidad y pureza del ADN desde su migración direccional durante la entrega de los campos eléctricos depende de su carga. Los protocolos de purificación de ADN que no incluyen la eliminación de nuevas moléculas cargadas, tales como las endotoxinas, puede conducir al enmascaramiento de los cargos de ADN naturales negativos que conducen a una mala dispensación. Claramente, tocando las paredes del útero con los electrodos tan cerca como sea posible del área a ser objeto mejorará la eficiencia de la electroporación. Igualmente importante es la calidad de los electrodos utilizados ya que esto es fundamental para la entrega de los campos eléctricos óptimos. Los micro-arañazos ni siquiera es visible por el ojo y / o residuos orgánicos, tales como trazas de suero, lípidos, y así sucesivamente, inevitablemente se acumulan con el tiempo conduce a electrodos perder sus propiedades. Electropes viejos y / o sucios son la causa más probable de una repentina caída en la eficiencia de la electroporación y, por lo tanto, debe ser replaced tan pronto como esta se nota. Aunque es relativamente simple, la electroporación in utero por lo general requiere de varias semanas de entrenamiento con el fin de lograr de manera satisfactoria y resultados reproducibles. Esta técnica es muy versátil ya que se puede aplicar, virtualmente, a cualquier órgano y tejido del embrión en desarrollo. Ciertamente, los órganos que contienen una cavidad, tal como el cerebro, son particularmente fáciles de orientar y permitir una alta proporción de células transfectadas debido a la facilidad de inyectar un volumen relativamente grande de ADN.
Un problema común encontrado en el establecimiento de inyección estereotáxica viral es tener pocas células infectadas y / o para dirigirse a áreas no deseadas. El primer problema se asoció principalmente con la inyección de bajo título de virus. Células 293T con menor número de pases en cultivo crecen más rápido y dar lugar a mayores títulos virales. El uso de células mayores de ca. 20 pasajes no se recomienda y medio de transfección con una eficiencia inferior al 80% no se asegurará un buenproducción viral. La resuspensión del sedimento viral es también crítico, la suspensión viral tiene que aparecer grupos homogéneos y viral que podría ocluir el capilar tienen que ser evitados. Los virus son muy sensibles a la temperatura desciende y el almacenamiento a largo plazo. Por estas razones, las alícuotas necesitan ser permanentemente almacenados a -80 ° C y no se puede volver a congelar. Incluso en estas condiciones, una disminución en la infectividad se puede observar después de 6-12 meses de almacenamiento. En las fases de aprendizaje, sugerimos probar el título viral de cada preparación viral y volver a hacerlo después de un almacenamiento a largo plazo. La presencia de células infectadas en zonas no deseadas del cerebro puede depender de un posicionamiento óptimo de la cabeza del ratón en el marco estereotáxico, que requiere algo de práctica. Además, es fundamental para no dañar la superficie del cerebro, mientras que la apertura del agujero en el cráneo, porque de lo contrario no será posible restablecer el 0 correctamente en la superficie pial, resultando en la inyección impreciso. Las coordenadasque se proporciona en este protocolo se refiere a las mujeres C57/BL6 6-10 semanas de edad y se sugiere que la optimización de cepa diferente / edad / sexo. La adquisición de esta técnica puede requerir más tiempo que en el útero de la electroporación debido a las fases más largos necesarios para preparar los virus y analizar las muestras. Es muy recomendable que los virus sólo se utilizan después de la cirugía del ratón y la inyección estereotáxica se han convertido en fiable y reproducible. El primer paso para lograr esto es inyectar células permeantes colorantes de ADN, tales como Hoechst 33342, en los ratones sacrificados y analizar los cerebros inmediatamente.
En la electroporación in utero y la inyección estereotáxica viral son dos potentes sistemas a aguda y tejidos específicamente manipular la expresión de genes en el SNC durante el desarrollo de los mamíferos y la edad adulta. A pesar de su limitación en la selección de sólo una subpoblación de células, estos sistemas proporcionan una velocidad sin precedentes y facilidad en comparación con métodos más convencionales, in particular, la generación laborioso y tiempo de ratones transgénicos. Sin embargo, a pesar de esta similitud, existen varias diferencias entre las dos técnicas que son dignas de mención. En primer lugar, con respecto a la focalización de los diferentes tipos de células, la electroporación in utero inicialmente conduce a la transfección de células madre adecuadas (también llamadas células gliales radiales) porque estas son las únicas células que delimitan el ventrículo donde se inyecta el ADN. Como resultado de divisiones celulares, los plásmidos que posteriormente será heredado de células diana, madre madre a su progenitor y / o células neuronales hija que conducen a la redistribución de las células transfectadas en toda la corteza como una función del tiempo. En contraste, el uso de los lentivirus VIH en el cerebro adulto conduce a la infección simultánea de cualquier tipo de células incluyendo las células madre, progenitoras, las neuronas maduras, así como células gliales. De nota, con respecto al uso de lentivirus VIH en comparación con los retrovirus más comúnmente utilizados es el hecholentiviral que la integración se produciría independientemente del estado mitótico de las células, permitiendo así que el objetivo también de adultos, las células madre latentes.
En segundo lugar, otra diferencia importante entre la electroporación y la infección viral es que una expresión transitoria, episomal se consigue por el anterior en lugar de la integración irreversible de ADN en el genoma de las células infectadas obtenidos por este último. Como resultado de divisiones celulares consecutivas, la dilución de los plásmidos electroporados, y la degradación de la proteína CyclinD1 ectópico, se produciría en cada ciclo celular. Por lo tanto, la expansión de NSC durante el desarrollo embrionario se demostró que sólo duran aproximadamente dos días 15 mientras que en el cerebro adulto este efecto se encontró que dura varios meses (resultados no publicados).
En tercer lugar, ya que i) cdk4/cyclinD1 tiene un efecto más fuerte en las células con un G1 más y ii) cometidos progenitores neurales durante el desarrollo de un ciclo celular más largoque las células madre mientras que lo contrario ocurre durante la edad adulta, nuestros dos manipulaciones se encuentra a desencadenar la expansión, sobre todo, de los progenitores neurales durante el desarrollo de las células madre y en la edad adulta. En cualquiera de los casos un aumento en neuronas se ha logrado por ambos métodos.
Cuarta inyección, viral se puede realizar fácilmente, fiable y reproducible, en muchas regiones diferentes del cerebro adulto, simplemente cambiando las coordenadas estereotáxica. En contraste, la orientación precisa de determinadas regiones del sistema nervioso central, tales como tallo cerebral, formación del hipocampo o la médula espinal, por electroporación en el útero podría ser más difícil de lograr reproducible. Además, mientras que la inyección estereotáxica se puede realizar en ratones de cualquier edad, un rendimiento óptimo de la electroporación en el útero está limitada de aproximadamente E11 a E16. Etapas previas a E11 requeriría o bien el uso de un microscopio de retrodispersión de ultrasonidos 18,19 o un culto embrión enteroure sistema de 17,20.
Recientemente, un creciente interés en la biología celular básica de células madre somáticas se ha promovido porque su estudio y manipulación se cree que es fundamental para el desarrollo de nuevas terapias basadas en células regenerativas. En particular, para la sobreexpresión de cdk4/cyclinD1, nuestro protocolo proporciona los medios para aumentar transitoriamente la expansión de NSC en vivo (Figura 3B y C y 4B y C) con el fin de aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro adulto. Creemos que estos manipulación puede ser importante en un número de contextos diferentes para comprender mejor el papel de NSC en el desarrollo del cerebro, la evolución y la homeostasis así como su contribución a la función cognitiva o la recuperación de la degeneración neural o lesión.
Disclosures
BA y FC ha presentado una solicitud de patente que describe la expansión condicional de las células madre adultas somáticas por cdk4/cyclinD1 virus (EP 10160288.6).
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Centro de terapias regenerativas, la Facultad de Medicina de la TU Dresden y la DFG Collaborative Research Center SFB655 (A20 subproyecto). BA fue apoyado por una beca del programa DIGS-BB, de Dresde. Agradecemos a los Dres. Noriko Osumi, Nomura Tadashi, Lie Dieter Chichung y Ravi Jagasia de valiosos consejos durante la creación de la electroporación in utero y la inyección estereotáxica viral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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References
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