Summary
פתחנו מערכת מיקרוסקופ מעקב וידאו שיעור שיכול להקליט ולכמת
Abstract
פתחנו מכשור, עיבוד תמונה, וטכניקות ניתוח נתונים לכמת את התנהגות locomotory של ג elegans כפי שהוא זוחל על פני השטח של צלחת אגרה. לצורך המחקר של בסיס הגנטי, הביוכימי והעצבי של התנהגות, ג elegans הוא אורגניזם אידיאלי כי זה גנטי צייתן, נוח למיקרוסקופיה, ומציג מספר ההתנהגויות מורכבות, כולל מוניות, למידה ו1,2 אינטראקציה חברתיות. ניתוח התנהגותי המבוסס על המעקב אחר התנועות של תולעים כפי שהם זוחלים על צלחות אגרו היה שימושי במיוחד בחקר התנהגות חושית 3, נידות 4, וphenotyping מוטציוני כללי 5. המערכת שלנו פועלת על ידי העברת מערכת המצלמה ותאורה כתולעים זוחלים על צלחת אגר נייחת, מה שמבטיח שאף גירוי מכאני מועבר לתולעת. מערכת המעקב שלנו היא קלה לשימוש וכוללת תכונת כיול אוטומטית למחצה. צ'הllenge של כל מערכות מעקב וידאו הוא שהוא מייצר כמות עצומה של נתונים שבמהותו גבוהה ממדי. עיבוד התמונה שלנו ותוכניות ניתוח נתונים להתמודד עם אתגר זה על ידי הפחתת צורת תולעים לקבוצה של רכיבים עצמאיים, שמשחזרים באופן מקיף את התנהגות התולעים כפונקציה של מידות 3-4 רק 6,7. כדוגמה לתהליך שאנו מראים כי התולעת נכנסה ויוצאת מצב היפוכה באופן ספציפי שלב.
Protocol
1. תיאור של מיקרוסקופ מעקב
- צלחת אגרה היא מואר על ידי מקור אור סיבים וצלמה עם מצלמה. מערכת זו היא רכובה על X, Y שלב תרגום.
- השלב מועבר על ידי stepper מנועים סטנדרטיים, אשר מחוברים לבקר מנוע צעד.
- הבקר והמצלמה מחוברים למחשב ונשלטו על ידי תוכניות מותאמות אישית שנכתבו בLabVIEW.
- תמונות המצלמה את פני השטח של צלחת אגרה ומזהה עצמים כהים על רקע בהיר.
- איכות התמונה היא מותאמת כך תכנית מחשב יכולה לכמת עצמים בזמן אמת. הרווח, הבהירות, ואת מהירות תריס של המצלמה יכולים להיות מותאם כדי לספק אובייקט כהה על רקע לבן.
- סימן כיול עבור תהליך הכיול האוטומטי שעל ידי חדירת המשטח אגר במכוש תולעת.
- התמונה המסוננת, ינארי המשמש את תכנית המעקב ניתן לבדוק.
- כךftware יש תכונה אוטומטי כיול המחשבת את מטריצת הכיול על ידי הזזת אובייקט מבחן מרחק קבוע.
- מרחקים בפיקסלים מכוילים לצעדים שננקטו על ידי מנוע הצעד שמטריצת הכיול.
- לאחר כיול, המערכת מוכנה ללכת ולא צריכה להיות recalibrated אלא אם הגדלתו השתנתה או שהמצלמה משנה את מיקומו.
2. הכנת צלחות מעקב וג elegans למעקב
- טבעת נחושת משמשת לכלוא את התולעים ולשמור אותם לנדוד לשולי הצלחת. הנחושת מספקת מחסום כימי מקומי ואינו משפיעה על התנועה של התולעת אחרת לתקופת הניסוי (<1 שעות). מחמם את הטבעת ראשונה על ידי הצבתו על בלוק חום או שוות ערך.
- טבעת מקום על גבי צלחת אגרה טריה (1.7% אגר Bacto, 0.25% Bacto-Peptone, 0.3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 4 המ"מ MgSO, חיץ פוספט אשלגן 25 מ"מ, 5 מיקרוגרם / מ"לכולסטרול) ולחץ כלפי מטה מעט כדי להטביע אותו למשטח אגר.
- פיק L4 במה או תולעים צעירים על צלחת אגרה מלאה בכמה חיץ NGM (0.3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 4 המ"מ MgSO, חיץ פוספט אשלגן mM 25) כדי לשטוף מהם את שאריות מזון. תן את התולעים לשחות במשך כמה דקות.
- זהירות למקם תולעת אחת לצלחת המעקב בסמוך למרכז הזירה. ולאחר מכן הנח את הלוח על גשש התולעת.
3. מעקב תולעת
- הפעל את תכנית LabVIEW ולבחור אפשרויות במידת צורך (מיקום לתמונות, סוגים של תמונות, מדידות, הגדרות מצלמה).
- באמצעות הג'ויסטיק להזיז את המיקרוסקופ עד תמונה של התולעת הוא בשדה הראיה (מסך מחשב). לחץ על "מסלול" לעסוק בתכנית המעקב.
- תכנית המחשב למעשה מודדת את התנועות של תמונות מסוננות בינאריות כמוצגת, ויכולה לבצע מדידות על התמונה בזמן אמת
- בירכתי הספינהאה מעקב שחזור של המסלול הגלובלי יכול להיות עשויים מתנועות stepper המנוע, ואילו שינויי הצורה המקומיות של התולעת שניתן לראות בפירוט.
4. ניתוח נתונים
- הפעל את הסקריפט skeletonizing (MATLAB) לparameterize צורות של התולעת. (איור 2)
- חישוב eigenmodes של נתוני skeletonized. (איור 3,4)
- צג איור 5. קראו אגדת דמות או תוצאות מייצגות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמה: כשהם מחפשים מזון, ג מעברי elegans מקדימה כדי להפוך תנועה, לעתים קרובות ביצוע ארגון מחדש (תור אומגה) לפני ההחזרה למצב התנועה קדימה. כימות המעבר הזה הוא חשוב בהבנת דפוסי האיסוף של תנועה וגם בשליטה המוטורית של התולעת. הכח לחשוף פרטים עדינים של התנהגות תנועה ניתן לראות באמצעות מכשיר המעקב שלנו.
כדוגמה אנחנו מסתכלים קדימה כדי להפוך ולהפוך להעביר מעבר על ידי לכידת תמונות ברזולוציה גבוהה של תולעים זוחלות בחופשיות על הצלחת אגרה במשך ~ 30 דקות. פועל. ניתוח eigenmode (איור 3) מאפשר לנו למדוד את השלב של התנועות הגליות של התולעת. מדידת השלב בתורו מאפשרת לנו לחשב את המהירות של התולעת וקדימה כדי להפוך מעבר (איור 4). ידי התוויית ההסתברות המשותפת של המהירות והשלב של התולעת, אנו יכולים לראות כי טרנסition בין קדימה והפך יקרה הסתברות בשלב מועדף (הציור 5a). אם מפרידים בין קדימה להפוך ולהפוך להעברת מעברים ומסתכלים על ההסתברות מותנה של השלב של התולעת כאשר הוא נכנס ויוצא אירוע היפוך, אנו רואים שיש להם הפצות שלב ברורות (איור 5 ב, ג).
איור 1. מעקב מיקרוסקופ. המדגם של תולעת זוחלת על צלחת אגרה נשאר נייח ואילו מערכת ההדמיה נעה כדי לשמור על התולעת במרכז התצוגה. מערכת ההדמיה בנויה על שלב תרגום 2D מונע על ידי מנועי stepper (3). מצלמת CCD (Basler A601f) ועדשה (25 מ"מ אורך מוקד) תמונות התולעת מלמטה (1) וקלה (סיבים אופטיים אדמונדס; דגם) מאירים אותה מלמעלה (2). בקר מנוע צעד תוצרת ניצול פשוטep בקר הלוח (SimpleStep; SSXYZ) שולט בתנועה של מערכת ההדמיה. תכנית מותאמת אישית LabVIEW (המכשירים הלאומיים, אוסטין, טקסס, ארה"ב) רוכשת ומעבדת תמונות של התולעים, ובמקביל מתקשר עם בקר המנוע כדי לשמור את התולעת במרכז השדה.
איור 2. עיבוד תמונה. (א) וורמס להעביר באמצעות שינוי עקמומיותם בזמן ובכך עבדנו את התמונות על ידי תולעת parameterizing קו האמצע שלהם. התמונות שנעשו על ידי בינארי thesholding תמונת הגוונים האפורה הגולמית (ב), ותולעים בודדים זוהו על ידי סינון אובייקטים לפי גודל (ג). המרחק בין מרכז המסה של התולעת ומרכז התמונה היה מחושב ולאחר מכן השלב התרגש את המרחקים המתאימים מחדש מרכז הווrm. מרחקי תיקון אלה שמשו כדי לחשב את מסלולו של התולעת. העקמומיות של התולעת ההיקפית שמשה לזיהוי הזנב (עקמת מרבית) והראש (מקסימום שני). (ד) תמונות אז היו גרמיות כדי לאתר את קו האמצע. (ה) עקומת התוצאה הייתה אז אז אינטרפולציה ל101 מקטעים וזווית מחושבת בין הפלחים שמשה לparameterize עקומה. לחצי כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. חישוב Eigenmode. עקומות בסיסיות של צורת התולעת חושבו באמצעות ניתוח מרכיבי עיקרון 5. כל עקומת תולעת מיוצגת על ידי סכום ליניארי של הווקטורים העצמיים (או eigenworms), שבו המשרעת של כל מרכיבים ידועה כeigenmode (מצב). אנחנו יכולים לכמת את ההתנהגות של התולעת באמצעות מדידת 3 eigenmodes הראשון של צורת התולעת לאורך זמן.
איור 4. שלב ומהירות. () ההפצה המשותפת של שני המצבים הראשונים למחזור גבול. (ב) השלב או עמדה במחזור גבול זה תואם את השלב של העמדה הגלית של התולעת. (ג) השימוש במהירות השלב קדימה את התולעים ואחורה בתנועות ניתן לכמת. (ד) המהירות והכיוון יחד מחזורי מגבלה זו מצביעה על המהירות של התולעת. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
4094fig5.jpg "alt =" איור 5 "fo: תוכן רוחב =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg "/>
איור 5. מיתוג מהירות שלב תלוי. המעברים בין מדינות קדימה לאחור אינם קורים באופן אקראי לאורך מחזור תנודתית. הם (אבל עדיין stochastically) יקרו בשלבים מסוימים. () ההפצה המשותפת של מהירות הפאזה והמהירות עולה בבירור כי תולעים לצאת ולהיכנס למדינה קדימה מעדיפים בשלבים מסוימים. (ב) מציג עלילה של השלב המותנה בכניסה לאירוע היפוך. (ג) מציג את השלב המותנה ביציאה של אירוע היפוך. הקו השחור הוא ההפצה של זוויות מופע ללא מיזוג ביציאה או כניסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר של תנועה והתנהגות טבעית דורש טכניקות מעקב בלתי פולשניות בשותף עם טכניקות הפחתת נתונים. כאן יש לנו הפגנו קל לשימוש מערכת מעקב שמתעדת תמונות מפורטות של ג elegans התנהגות כפי שהוא זוחל על פני השטח של צלחת אגרה. כמות המידע שנמצאה בתמונות האלה היא עצומה וגבוה ממדים, וכך גם פתחנו שיטות לצמצום הממדי של הנתונים לתוך רק ארבעה צעדים בסיסיים. צעדים אלו הם מקיפים וקלים לפרש ביחס להתנהגות תולעת. עבור עבודה זו אנו מראים מעבר תולעים שבין קדימה ואחורה קובע מועדף בנקודות שונות במחזור הגלי שלו, אמצעי שקשה לעשות על ידי עין. עבודה זו היא משלימה את מערכות מעקב שפותחו כדי למדוד התנהגות של תולעים בהגדלה נמוכה 8,9,10, וגם במערכות שמסוגלות למדוד או לווסת acti העצביvity באמצעות ריאגנטים מקודדים גנטי 11,12.
בעוד מעקב אורגניזם יחיד הוא שיטה רבה עצמה לכימות של התנהגות יש כמה מגבלות על הטכניקה. הראשון הוא העובדה שהמערכת עוקבת רק אורגניזמים בודדים בכל פעם. בהשוואה לעוקבת מצלמה קבועה אשר מסוגל לעקוב אחר מספר רבים של אורגניזמים 9,10, התפוקה של הגשש שלנו היא נמוכה. עם זאת, אנו יכולים למדוד התנהגות של אורגניזם יחיד לתקופות זמן ארוכים יותר בהרבה מאשר הגששים המרובים התולעת, שהנם חשוב לכמת התנהגויות סולם זמן ארוכות כגון רעב, הטלת ביצים, וחיפוש אחר מזון. גם הגשש דורש תמונות אשר מזהות בבירור את התולעת מהרקע. זה מונע מאתנו מביט בתנועות תולעת בסביבות שתסערנה חזותיים או אחר מורכבת מדי עבור מערכת עיבוד התמונה כדי לסנן את התולעת.
מערכת זו היא גמישה וניתן להשתמש בו עבור סוגים אחרים של behaviמעקב אוראלי. במקום סביבה הומוגנית, התולעת יכולה להיות במעקב בזמן שהוגש למידע חושי מרחב ובזמן, בדומה למערכות מעקב אחרות. לדוגמה, גירוי תרמי ניתן ליישם באמצעות ליזר גירוי 7,14, או מידע כימי יכול להיות מיושם באמצעות גרדיאנטים מרחביים באמצעות אגר 3. המערכת כולה היא גמישה בעיצוב וניתן להשתמש עם מערכות זחילה אחרות כגון זחלי דרוזופילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
- de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
- Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028 (2008).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914 (2010).
- Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115 (2004).
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
- Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
- Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).
