Summary
我们已经开发出一种视频率跟踪显微镜系统，可以记录和量化
Abstract
我们已经开发出了仪表，图像处理和数据分析技术量化的运动器官行为C.线虫 ，因为它的琼脂平板的表面上爬行。为了进行这项研究的遗传，生化和神经行为的基础上，C.线虫是一种理想的生物，因为它是转基因温顺，服从显微镜的，并显示了一些复杂的行为，包括的士，学习，社会交往1,2。行为分析基于跟踪的蠕虫的变动，因为它们的琼脂平皿上抓取的感官行为3，运动4，和一般的突变表型5的研究中是特别有用的。我们的系统的工作原理，通过移动摄像机和照明系统作为蠕虫抓取在一个固定的琼脂平板上，以确保没有机械的刺激传递到蜗杆。我们的跟踪系统是容易使用的，并包括一个半自动的校准功能。阿查llenge的所有视频跟踪系统，它会产生一个巨大的数据量，在本质上是高维。我们的图像处理和数据分析程序，应对这一挑战，减少蠕虫形状为一组独立的组件，全面重建的蠕虫行为的函数只有3-4尺寸6,7。的过程中作为一个例子，我们表明，蠕虫在一个阶段的特定的方式进入和离开它的反转状态。
Protocol
1。跟踪显微镜的说明
- 纤维光源照亮的琼脂板和具有摄像机成像。被安装到该系统的X，Y翻译阶段。
- 的阶段被移动由步进电机的标准，它被连接到一个步进电机控制器。
- 该控制器和相机连接到计算机，并且由自定义程序LabVIEW中编写的控制。
- 摄像机图像的琼脂板的表面，并确定在浅色背景上的暗的物体。
- 的图像质量被调整，使得计算机程序可以量化对象实时。的增益，亮度和相机的快门速度，可以进行调整，以在白色背景上提供一个黑暗的物体。
- 校准标志的自动校准过程是由带虫挑戳在琼脂表面。
- 经滤波的，二进制图象，这是所使用的跟踪程序可以被检查。
- 在这样ftware具有自动校准功能，计算校验矩阵测试对象移动一个固定的距离。
- 以像素为单位的距离校准的校验矩阵由步进电机所采取的步骤。
- 在校准之后，系统已经准备就绪，并不需要进行重新校准，除非倍率改变时或当相机被重新定位。
2。准备跟踪板和 C。 线虫进行跟踪
- 使用一个铜圈，畜栏蠕虫，让他们迁移到边缘板。的铜提供了一个本地的化学屏障和蠕虫的移动不会影响其他的实验的持续时间（<1小时）。第一，通过将其放置在加热块或相当于加热环。
- 将环到新鲜的琼脂平板（1.7％Bacto琼脂，0.25％Bacto-胰蛋白胨，0.3％的NaCl，1mM的的CaCl 2，1mM的用MgSO 4，25mM磷酸钾缓冲液，5微克/毫升胆固醇），然后按略有下降，将它嵌入到琼脂表面。
- 挑选L4阶段或年轻的成年蠕虫到填充有一些NGM缓冲液（0.3％的NaCl，1mM的的CaCl 2，1mM的用MgSO 4，25mM磷酸钾缓冲液）洗他们的食物残渣的琼脂板。让蠕虫几分钟游泳。
- 跟踪板中心附近的环上，小心地将一只虫。然后将板到蠕虫跟踪。
3。蠕虫跟踪
- 运行LabVIEW程序，并选择相应的选项，如果需要的话（图像位置，图像，测量，相机设置的类型）。
- 使用操纵杆移动到影像的蠕虫病毒在显微镜的视场（电脑屏幕）。按“轨道”，从事跟踪程序。
- 该计算机程序的实际测量，一个二进制滤波图像的运动，如图所示，并可以使此图像上的测量的实时
- 船尾呃跟踪重建全球轨迹可以由步进电机的动作，而可以看出，在详细的局部形状变化的蠕虫。
4。数据分析
- 运行skeletonizing脚本（MATLAB）参数蠕虫的形状。 （ 图2）
- 计算本征模的镂空数据。 （ 图3,4）
- 显示图5。图例或有代表性的结果。
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Representative Results
例如：觅食时，C.线虫转换从正向，逆向运动，经常进行重新定位（欧米茄反过来），然后返回向前运动状态。 ，量化这种转变是很重要的，理解的觅食的运动模式，也该蠕虫的电机控制。使用我们的追踪装置的运动行为，揭示微妙的细节可以看出。
作为一个例子，我们在前进，以扭转和扭转转发〜30分钟的琼脂平板上自由爬行的蠕虫捕捉高清晰度的图像过渡。运行。本征模分析（ 图3），使我们能够测量相位的波动运动的蠕虫病毒。反过来的相位测量，使我们能够计算的蠕虫和扭转过渡（ 图4）的向前的速度。通过绘制蠕虫的速度和相位的联合概率，我们可以看到，反式银行足球比赛之间的正向和反向的发生概率与优惠相（ 图5a）。如果我们分开，以扭转和扭转转发过渡阶段的蠕虫病毒，当它进入和退出的逆转事件的条件概率看，我们可以看到，他们有不同的相位分布（ 图5b，C）。
图1。跟踪显微镜。爬行的琼脂平板上的蜗杆的样本保持静止，而成像系统移动到保持在视图的中心蠕虫。该成像系统是建立在一个2D翻译阶段由步进电机（3）驱动。的CCD照相机（巴斯勒A601f）和透镜（25毫米焦距）图像的蠕虫从下面的纤维（1）和光（兹光学模型）照射从上述（2）。利用最简单的自制的步进电机控制器EP控制器板（SimpleStep; SSXYZ）控制的摄像系统的运动。一个自定义的LabVIEW程序（美国国家仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州，美国）的图像采集和处理的蠕虫病毒，同时与电机控制器通信蠕虫在该领域的中心。
图2的图像处理。 （一）蠕虫移动，通过改变其曲率的时间，所以我们处理该蠕虫通过参数化的中心线的图像。通过thesholding的原始灰度图像（b）的二进制图像，通过过滤对象的大小（三）和蠕虫个人被确定。蠕虫的质量和的图像的中心的中心之间的距离被计算，然后在舞台提出适当的距离重新置禾RM。这些修正的距离被用来计算弹道的蠕虫病毒。蜗杆周边的曲率被用来确定最大的尾部（曲率）和头部（二次最大）。 （d）该图像，然后镂空定位中心线。 （E）所得到的曲线然后再插值到101段和段之间的夹角的计算被用于参数化的曲线。 点击此处查看大图 。
图3，本征模计算。已用主成分分析计算的蠕虫形状的基本曲线。每个蜗杆曲线所表示的线性和的本征值的（或eigenworms），其中被称为本征模（模式）的每个组件的振幅。通过测量的前三本征模的蜗杆形状随着时间的推移，我们可以量化的蠕虫的行为。
图4相和速度。 （一）前两种模式的极限环的联合分布。 （b）本阶段或在此极限环的位置与蠕虫的波动状况的阶段。 （c）使用的相速度的蠕虫向前和向后的运动可以被量化。 （四）极限环的速度和方向沿着这表明蠕虫病毒的速度。 点击此处查看大图 。
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图5相依赖速度切换。正向和反向状态之间的转换不沿振荡周期随机发生。他们（但仍然是随机的）发生在特定的阶段。 （一）的联合分布的相速度和速度清楚地表明，蠕虫病毒离开，并进入转发状态，优先在特定阶段。 （b）所示的逆转事件的入口条件相的阴谋。 （c）示出的相位上的出口空调逆转事件。黑线是没有空调的出口或入口的分布相位角。
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Discussion
非侵入性的运动和自然行为的研究需要跟踪技术的合作伙伴，数据压缩技术。在这里，我们已经演示了一个易于使用的跟踪系统，记录详细的图像C.线虫的行为，因为它抓取的琼脂平板的表面上的。在这些图像中包含的信息量是巨大的，高维的，所以我们也开发的方法进行降维的数据导入到只有四个基本措施。这些措施是全面的，是很容易解释的蠕虫行为。对于这项工作，我们向前和向后规定优先于不同的点，其波动周期，一项措施，是很难做到的眼睛，蠕虫之间的过渡。这项工作是互补的跟踪系统，已经开发了测量的蠕虫的行为，在低倍率8,9,10，也都能够进行测量的系统，或调节神经元的激活VITY使用基因编码试剂，11,12。
虽然单一的有机体跟踪量化的行为是一个功能强大的方法有一定的局限性的技术。第一项是一个事实，即该系统跟踪一次只有单一的生物体。在固定摄像机跟踪能够追踪多种生物9,10相比，我们跟踪的吞吐量是低的。但是，我们能够测量单个生物体的行为更长的时间比多蠕虫跟踪，这是非常重要的量化长时间尺度的行为，如饥饿，鸡蛋铺设和觅食。此外，跟踪需要清楚地识别蠕虫从背景图像。这令我们在视觉上凌乱的环境，或以其他方式太复杂的图像处理系统，筛选出蠕虫研究蠕虫的运动。
此系统是灵活的，并可以用于其它类型的behavi口服跟踪。而不是一个同质性的环境中，该蠕虫可以同时跟踪提交的时间和空间的感觉信息，与其他跟踪系统。例如，热刺激可以被应用于通过激光刺激7,14，或化学信息可以应用于通过琼脂3通过的空间梯度。作为一个整体的系统在设计上是灵活的，并且可以用于与其他抓取系统，诸如果蝇幼虫。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
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