Summary
Vi har utviklet en video-rate sporing mikroskop som kan ta opp og kvantifisere
Abstract
Vi har utviklet instrumentering, bildebehandling, og dataanalyse teknikker for å kvantifisere motorisk atferd C. elegans som det kryper på overflaten av en agarplate. For studiet av den genetiske, biokjemiske og neuronal grunnlag av atferd, C. elegans er en ideell organisme fordi det er genetisk medgjørlig, mottagelig for mikroskopi, og viser en rekke komplekse atferd, inkludert drosjer, læring og sosialt samspill 1,2. Atferdsanalyse basert på sporing bevegelser ormer som de gjennomgå på agarplater har vært spesielt nyttig i studiet av sensorisk atferd 3, bevegelse 4, og generell mutational fenotyping 5. Vårt system fungerer ved å flytte kameraet og belysningssystemet som ormer kryper på en stillestående agarskål, som sikrer at ingen mekaniske stimulusen overføres til ormen. Vårt system for sporing er lett å bruke og har en semi-automatisk kalibrering. En challenge av alle video sporing systemer er at den genererer en enorm mengde data som er egentlig høy dimensjonal. Vår bildebehandling og dataanalyse programmer håndtere denne utfordringen ved å redusere ormer form i et sett av uavhengige komponenter, som omfattende rekonstruere ormer atferd som en funksjon av bare 3-4 dimensjoner 6,7. Som et eksempel på prosessen viser vi at ormen entrer og utganger dens reversering tilstand i en fase spesifikk måte.
Protocol
1. Beskrivelse av Spore mikroskop
- En agarplate belyses av en fiber lyskilde og avbildes med et kamera. Dette systemet er montert til en X, Y oversettelse scenen.
- Scenen beveges ved standard trinnmotorer, som er koblet til en Stegmotorstyrning.
- Kontrolleren og kameraet er koblet til datamaskinen og styres av tilpassede programmer skrevet i LabVIEW.
- Kamerabildene overflaten av en agarplate og identifiserer mørke objekter på en lys bakgrunn.
- Bildekvaliteten er justert slik at dataprogram kan kvantifisere objekter i sanntid. Gevinsten, lysstyrke og lukkerhastighet på kameraet kan justeres for å gi en mørk gjenstand på en hvit bakgrunn.
- En kalibrering mark for automatisk kalibrering prosessen er laget av poking agaroverflaten med en orm hakke.
- Den filtrerte, binære bildet som brukes av sporingsprogram kan kontrolleres.
- Den såftware har en automatisk kalibrering funksjon som beregner kalibreringsmatrisen ved å flytte en test objekt en bestemt avstand.
- Avstander i piksler er kalibrert til skritt tatt av stepper motor ved kalibrering matrise.
- Etter kalibrering er systemet klart til å gå og trenger ikke å kalibreres mindre forstørrelse endres eller hvis kameraet er reposisjonert.
2. Forbereder Spore Plater og C. elegans for sporing
- En kobber ring brukes for å samle de ormer og holde dem fra å migrere til kanten av platen. Den kobber gir en lokal kjemisk barriere, og påvirker ikke bevegelsen av ormen ellers for varigheten av eksperimentet (<1 t). Varm ringen først ved å plassere den på en varme blokk eller tilsvarende.
- Plass ring på en fersk agarskål (1,7% Bacto agar, 0,25% Bacto-pepton, 0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM kaliumfosfatbuffer, 5 ug / mlkolesterol) og trykk ned litt for å legge det inn i agaroverflaten.
- Pick L4 stadium eller unge voksne ormer på en agarplate fylt med noen NGM buffer (0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM kaliumfosfatbuffer) å vaske dem matrest. La ormer svømme i noen minutter.
- Forsiktig plassere et enkelt orm på sporing tallerkenen nær sentrum av ringen. Og deretter plassere platen på ormen tracker.
3. Worm Tracking
- Kjør LabVIEW programmet og velge alternativer hvis nødvendig (plassering for bilder, type bilder, målinger, kamerainnstillinger).
- Med joysticken flytte mikroskopet til et bilde av ormen er i synsfeltet (dataskjermen). Trykk på "spor" å engasjere sporing program.
- Dataprogrammet måler faktisk bevegelsene av et binært filtrert bilder som vist og kan gjøre målinger på dette bildet i sanntid
- Aktereh sporing en rekonstruksjon av det globale trajektorie kan gjøres fra stepper motoriske bevegelser, mens de lokale formen endringer av ormen kan sees i detalj.
4. Dataanalyse
- Kjør skeletonizing script (MATLAB) for å parameterisere ormen former. (Figur 2)
- Beregn eigenmodes av skeletonized data. (Figur 3,4)
- Vis Figur 5. Les figur legende eller representative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempel: Når beite, C. elegans overganger fra forover for å reversere bevegelse, ofte utfører en nyorientering (omega turn) før retur til bevegelse fremover staten. Tallfesting denne overgangen er viktig for å forstå de foraging bevegelsesmønstre og også i ormen motorstyring. Makt til å avsløre subtile detaljer om bevegelse atferd kan sees ved hjelp av vår bane enhet.
Som et eksempel ser vi på frem til å reversere og reversere å videresende overgang ved å fange høyoppløselige bilder av ormer kravlesøk fritt på agar plate for ~ 30 min. kjører. Eigenmode analyse (figur 3) tillater oss å måle fase av undulatory bevegelser av ormen. Fasemålingen igjen tillater oss å beregne hastigheten av ormen og den fremre reversere overgang (figur 4). Ved å plotte felles sannsynligheten for ormen hastighet og fase, kan vi se at det transeuropeiskeition mellom forover og bakover skje probabilistically med fortrinnsrett fase (figur 5a). Hvis vi skille frem til å reversere og reversere å videresende overganger og se på den betingede sannsynligheten for den fasen av ormen når den går inn og ut av en reversering hendelse, ser vi at de har forskjellige fase distribusjoner (figur 5b, c).
Figur 1. Sporing mikroskop. Utvalget av en orm kravlesøk på en agarplate forblir stasjonær mens det bildedannende system beveger holde ormen i sentrum av visningen. Den imaging system er bygget på en 2D oversettelse scene drevet av stepper motorer (3). Et CCD-kamera (Basler A601f) og linsen (25mm brennvidde) bilder ormen nedenfra (1) og en fiber lys (Edmunds optikk; modell) lyser det ovenfra (2). En hjemmelaget Stegmotorstyrning utnytte en enklesteep kontrollerkort (SimpleStep, SSXYZ) styrer bevegelsen av imaging system. En tilpasset LabVIEW program (National Instruments, Austin, TX, USA) kjøper og behandler bilder av ormer, samtidig kommuniserer med motorstyreren å holde ormen i sentrum av feltet.
Figur 2. Bildebehandling. (A) Worms flytte ved å endre sin krumning i tid og så vi behandlet ormen bilder ved parameterizing sin midtlinje. Bildene ble gjort binær ved thesholding rå gråtoner bilde (b), og individuelle ormer ble identifisert ved å filtrere objekter etter størrelse (c). Avstanden mellom midten av massen av ormen og sentrum av bildet ble beregnet og deretter scenen ble flyttet passende avstander for å sentrere worm. Disse korreksjon avstander ble brukt til å beregne banen til ormen. Krumningen av ormen omkretsen ble brukt til å identifisere halen (maksimal krumning) og et hode (sekundær maksimum). (D) De bildene ble deretter skeletonized å lokalisere midtlinjen. (E) Den resulterende kurve ble deretter interpolert inn 101 segmenter og den beregnede vinkel mellom segmenter ble anvendt å parameterisere kurven. Klikk her for å vise større figur .
Figur 3. Eigenmode beregning. Grunnleggende kurver av ormen form er beregnet ved hjelp Prinsipp Component Analysis 5. Hver orm kurve er representert ved en lineær sum av egenvektorene (eller eigenworms), der amplitude av hver komponentene kalles eigenmode (modus). Vi kan kvantifisere atferd av ormen ved å måle de første 3 eigenmodes av ormen form over tid.
Figur 4. Fase og hastighet. (A) Den felles distribusjonen av de første to moduser for en grense syklus. (B) fase eller posisjon på denne rammen syklusen korrelerer med fasen av ormen undulatory posisjon. (C) Bruk av fasehastighet ormer forover og bakover bevegelser kan kvantifiseres. (D) fart og retning langs denne grensen sykluser indikerer ormen hastighet. Klikk her for å se større figur .
4094fig5.jpg "alt =" Figur 5 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg "/>
Figur 5. Fase avhengig hastighet veksling. Overgangene mellom forover og bakover land ikke skje tilfeldig langs oscillatory syklus. De (men fortsatt stokastisk) skje på bestemte faser. (A) Den felles fordeling av fasehastighet og hastighet indikerer klart at ormer forlate og angi frem staten preferensielt på bestemte faser. (B) viser et plott av fase betinget av inngangen til en reversering hendelsen. (C) viser fasen betinget av avkjørselen en reversering hendelsen. Den svarte linjen er fordelingen av fasevinkler uten condition på en avkjørsel eller inngang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet av bevegelse og naturlig atferd krever ikke-invasive sporing teknikker i partner med data reduksjon teknikker. Her har vi demonstrert en enkel å bruke tracking system som registrerer detaljerte bilder av C. elegans oppførsel som det kryper på overflaten av en agarplate. Mengden av informasjon som finnes i disse bildene er stort og høyt-dimensjonal, og så har vi også utviklet metoder for å redusere dimensjonalitet av dataene i bare fire grunnleggende tiltak. Disse tiltakene er omfattende og er enkle å tolke med hensyn til ormen atferd. For dette arbeidet viser vi at ormer overgangen mellom forover og bakover sier fortrinnsvis på forskjellige punkter i sin undulatory syklus, et mål som er vanskelig å gjøre med øyet. Dette arbeidet er komplementær til sporing systemer som er utviklet for å måle atferd av ormer ved lavere forstørrelse 8,9,10 og også for anlegg som er i stand til å måle eller modulere neuronal aktiviteten med genetisk kodet reagenser 11,12.
Mens én organisme sporing er en kraftig metode for kvantifisering av atferd er det noen begrensninger i teknikken. Den første er det faktum at systemet sporer bare enkle organismer gangen. I forhold til faste kamera trackere som er i stand til å spore flere organismer 9,10, er gjennomstrømningen av tracker våre lave. Men er vi i stand til å måle atferd enkelt organisme for langt lengre perioder enn de multi-ormen trackere, noe som er viktig for kvantifisere lang tidsskala atferd som sult, egglegging, og foraging. Også tracker krever bilder som tydelig identifiserer ormen fra bakgrunnen. Dette utelukker oss fra å studere ormen bevegelser i miljøer som er visuelt rotete eller på annen måte for komplisert for bildebehandlingssystem å filtrere ut ormen.
Dette systemet er fleksibelt og kan anvendes for andre typer av adferdoral sporing. I stedet for et homogent miljø, kan ormen spores mens sendes til romlig og tidsmessig sensorisk informasjon, i likhet med andre sporingssystemer. For eksempel, kan termisk stimulus brukes via laser stimulans 7,14, eller kjemisk informasjon kan påføres via romlige gradienter gjennom agar 3. Systemet som helhet er fleksibelt i konstruksjon og kan brukes sammen med andre systemer som gjennomsøkingsfunksjoner Drosophila larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
- de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
- Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028 (2008).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914 (2010).
- Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115 (2004).
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
- Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
- Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).
