Summary
We hebben een video-rate volgen microscoop systeem dat kan opnemen en te kwantificeren
Abstract
We hebben instrumentatie, beeldverwerking en data-analyse technieken om de motorische gedrag van C. kwantificeren elegans zoals kruipt op het oppervlak van een agarplaat. Voor de studie van de genetische, biochemische en neuronale basis van gedrag, C. elegans is een ideale organisme, omdat het genetisch handelbaar, vatbaar is voor microscopie, en toont een aantal complexe gedragingen, inclusief taxi's, leren, en sociale interactie 1,2. Gedragsanalyse gebaseerd op volgen van de bewegingen van wormen als ze kruipen op agarplaten zijn bijzonder nuttig in de studie van sensorische gedrag 3, 4 motoriek en algemene mutatie fenotypering 5. Het systeem werkt door de camera en Belichtingssysteem de wormen kruipt over een stationaire agar plaat, die garandeert dat er geen mechanische stimulus wordt doorgegeven aan de worm. Ons volgsysteem is gemakkelijk te gebruiken en omvat een semi-automatische kalibratie. Een challenge van video tracking systemen is dat het een enorme hoeveelheid gegevens die intrinsiek hoge dimensionele genereert. De beeldverwerking en programma's voor gegevensanalyse gaan met dit probleem doordat de wormen vorm in een set van onafhankelijke componenten, die volledig de wormen gedrag reconstrueren als functie van slechts 3-4 afmetingen 6,7. Als voorbeeld van de werkwijze aangetoond dat het worm binnenkomt en verlaat de omkering toestand in een fase specifieke wijze.
Protocol
1. Beschrijving van Tracking Microscoop
- Een agar plaat wordt verlicht door een lichtbron en vezel belicht met een camera. Dit systeem is gemonteerd op een X, Y translatietafel.
- De etappe wordt door standaard stappenmotoren, die zijn verbonden met een stappenmotor controller.
- De controller en de camera zijn aangesloten op de computer en gecontroleerd door aangepaste programma's geschreven in LabVIEW.
- De camerabeelden het oppervlak van een agar plaat en identificeert donkere objecten op een lichte achtergrond.
- De beeldkwaliteit wordt aangepast, zodat computerprogramma kan objecten kwantificeren in real time. De versterking, helderheid en sluitertijd van de camera kan worden aangepast aan een donker object op een witte achtergrond verschaffen.
- Een maatstreep voor de automatische kalibratie wordt gemaakt door porren de agar oppervlak met een worm pick.
- De gefilterde, binair beeld dat wordt gebruikt door het volgen programma kan worden gecontroleerd.
- De zoftware heeft een auto-calibratie functie die de kalibratie matrix berekent door het bewegen van een testobject een vaste afstand.
- Afstanden in pixels gekalibreerd is om stappen van de stappenmotor van de kalibratie matrix.
- Na de kalibratie van het systeem is klaar en hoeft niet te worden geijkt indien de vergroting gewijzigd of indien de camera wordt verplaatst.
2. Voorbereiden Tracking Platen en C. elegans voor Tracking
- Een koperen ring gebruikt om de wormen corral achter blijven en migreren naar de rand van de plaat. Het koper in een lokale chemische barrière en niet om anderszins invloed beweging van de worm voor de duur van het experiment (<1 uur). Verwarm de ring eerst door het op een warmteblok of gelijkwaardig.
- Ring plaats op een verse agar plaat (1,7% Bacto Agar, 0,25% Bacto-pepton, 0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM kaliumfosfaat buffer, 5 ug / mlcholesterol) en iets naar beneden drukken om het in te bedden in de agar oppervlak.
- Extra L4 stadium of jonge volwassen wormen op een agar plaat gevuld met een NGM buffer (0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM kaliumfosfaatbuffer) te wassen voedselresten. Laat de wormen zwemmen voor een paar minuten.
- Voorzichtig plaats een enkel worm op de tracking plaat in het midden van de ring. En plaats de plaat op de worm tracker.
3. Worm Tracking
- Voer het LabVIEW-programma en selecteer de opties indien nodig (locatie voor afbeeldingen, soorten beelden, metingen, camera-instellingen).
- Met behulp van de joystick de microscoop te verplaatsen totdat er een beeld van de worm is in het gezichtsveld (computerscherm). Druk op "track" om de tracking-programma in te schakelen.
- Het computerprogramma meet in feite de bewegingen van een binaire gefilterde zoals afgebeeld en kan metingen op het beeld om in real time
- Achteruiter volgen een reconstructie van de globale traject kan worden gemaakt van de stappenmotor bewegingen en de plaatselijke vormveranderingen van de worm te zien in detail.
4. Data-analyse
- Run skeletvorming script (MATLAB) om de worm vormen parametriseren. (Figuur 2)
- Bereken eigenmodes van de skelet gevormde gegevens. (Figuur 3,4)
- Toon Figuur 5. Lees figuur legende of representatieve resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorbeeld: Wanneer foerageren, C. elegans overgangen van vooruit naar achteruit beweging, vaak het uitvoeren van een heroriëntatie (omega beurt) voordat u terugkeert naar de voorwaartse beweging staat. Kwantificeren overgang belangrijk voor het begrijpen het scharrelen bewegingspatronen en in de worm motorbesturing. De bevoegdheid om subtiele details van de motoriek gedrag laten zien is te zien met behulp van onze tracker apparaat.
Als voorbeeld kijken we naar de vooruit naar achteruit en de overgang sturen door het vastleggen van beelden met hoge resolutie van wormen kruipen vrij op de agarplaat voor ~ 30 min te keren. loopt. De eigenmode analyse (Figuur 3) kunnen wij meten de fase van het golvende bewegingen van de worm. De fasemeting beurt kunnen we bepalen de snelheid van de worm en de overgang uit naar (figuur 4) keren. Door het uitzetten van de gezamenlijke waarschijnlijkheid van de snelheid van de worm en fase, kunnen we zien dat de transbankwezen in tussen vooruit en achteruit probabilistisch gebeuren met een preferentieel fase (figuur 5a). Als we scheiden vooruit naar achteruit en om overgangen sturen en op de voorwaardelijke waarschijnlijkheid van de fase van de worm wanneer het binnenkomt en verlaat een omkering evenement te kijken om te keren, zien we dat zij te onderscheiden fase distributies (figuur 5b, c) hebben.
Figuur 1. Tracking microscoop. Het monster van een worm kruipen op een agar plaat blijft stationair terwijl het afbeeldingsstelsel gaat de worm te houden in het centrum gezien. Beeldvormingssysteem is gebouwd op een 2D translatietafel aangedreven door stappenmotoren (3). Een CCD-camera (Basler A601f) en lens (25mm brandpuntsafstand) beelden van de worm van onderen (1) en een vezel licht (Edmunds optica; model) licht van boven (2). Een zelfgemaakte stappenmotor-controller met behulp van een eenvoudigeep controllerkaart (SimpleStep; SSXYZ) regelt de beweging van de imaging-systeem. Een aangepaste programma LabVIEW (National Instruments, Austin, TX, Verenigde Staten) en verwerkt afbeeldingen van de wormen, en tegelijkertijd de communicatie met de motor controller de worm houden in het midden van het veld.
Figuur 2. Image processing. (A) Worms verplaatsen door het veranderen van hun kromming in de tijd en dus hebben we verwerkt de worm beelden door parametrering van de hartlijn. De beelden werden gemaakt door binaire thesholding het ruwe grijstonen (b), en individuele wormen werden geïdentificeerd door filtreren objecten op grootte (c). De afstand tussen het middelpunt van de massa van de worm en het midden van het beeld werd berekend en het podium is verplaatst de juiste afstand opnieuw centreren de worm. Deze correctiefactoren afstanden zijn gebruikt om de baan van de worm berekenen. De kromming van de worm perimeter werd gebruikt om de staart (maximum kromming) en hoofd (secundaire maximum) identificeren. (D) De beelden werden vervolgens skelet gevormde op de hartlijn vinden. (E) De resulterende curve werd dan geïnterpoleerd in 101 segmenten en de berekende hoek tussen segmenten werd gebruikt om de curve te parametriseren. Klik hier om groter bedrag bekijken .
Figuur 3. Eigenmode berekening. Fundamentele curven van de worm vorm zijn berekend met behulp van principale componenten analyse 5. Elke curve worm wordt weergegeven door een lineaire som van de eigenvectoren (of eigenworms), waarbij de amplitude van elke componenten bekend als de eigenmode (modus). We kunnen kwantificeren het gedrag van de worm door het meten van de eerste 3 eigenmodes van de worm de loop der tijd.
Figuur 4. Fase en snelheid. (A) De gezamenlijke verdeling van de eerste twee functies voor een limiet cyclus. (B) de fase of positie op deze limit cycle correleert met de fase van golvend de worm positie. (C) De fasesnelheid de wormen heen en weer bewegen kan worden gekwantificeerd. (D) De snelheid en richting langs deze grens cycli geeft de worm de snelheid. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
4094fig5.jpg "alt =" Figuur 5 "fo: inhoud-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg "/>
Figuur 5. Fase afhankelijk aanslagomschakeling. De overgangen tussen vooruit en achteruit staten niet willekeurig gebeuren langs de oscillerende cyclus. Zij (maar nog steeds stochastisch) gebeuren op specifieke fasen. (A) De gezamenlijke verdeling van de fase snelheid en de snelheid geeft duidelijk aan dat wormen bij voorkeur verlaten en de voorwaartse stand op specifieke fasen. (B) toont een grafiek van de fase voorwaarde de ingang van een omkering event. (C) toont de fase voorwaarde de uitgang van een omkering event. De zwarte lijn is de verdeling van fasehoeken zonder conditionering op een uitgang of ingang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De studie van de motoriek en natuurlijk gedrag vereist niet-invasieve tracking technieken in de partnerlanden met datareductie technieken. Hier hebben we aangetoond een makkelijk te volgen systeem dat gedetailleerde beelden van C. registreert gebruiken elegans gedrag kruipt op het oppervlak van een agarplaat. De hoeveelheid informatie in deze beelden is groot en hoog-dimensionale, en daarom hebben we ook methoden ontwikkeld om de dimensionaliteit van de data te reduceren tot slechts vier fundamentele maatregelen. Deze maatregelen zijn uitgebreide en gemakkelijk te interpreteren met betrekking tot de worm gedrag. Voor dit werk wordt aangetoond dat wormen overgang tussen voorwaarts en achterwaarts bepaald voorkeur op verschillende punten in de golvende cyclus, een maatregel die moeilijk te doen met het blote oog. Dit werk is complementair aan volgsystemen die zijn ontwikkeld om het gedrag van wormen meten bij lagere vergroting 8,9,10 en ook voor systemen die kunnen meten of moduleren neuronale activiteit met behulp van genetisch gecodeerd reagentia 11,12.
Terwijl enkel organisme tracking is een krachtige methode voor de kwantificering van het gedrag zijn er een aantal beperkingen aan de techniek. De eerste is dat het systeem slechts enkele organismen tegelijk tracks. In vergelijking met vaste camera trackers die kunnen verschillende organismen 9,10 volgen, de doorvoer van onze tracker is laag. Maar we zijn in staat om het gedrag van enkel organisme te meten voor een veel langere tijd dan de multi-worm trackers, wat belangrijk is voor kwantificeren lange tijdschaal gedrag, zoals honger, ei-leggen, en foerageergebied. Ook de tracker vereist beelden die duidelijk de worm identificeren van de achtergrond. Dit sluit ons uit het bestuderen van worm bewegingen in omgevingen die visueel rommelig of anderszins te complex voor het beeldverwerkingssysteem om te filteren op de worm.
Dit systeem is flexibel en kan worden gebruikt voor andere soorten behaviorale tracking. In plaats van een homogene omgeving, kan de worm worden bijgehouden terwijl aan ruimtelijke en temporele sensorische informatie, vergelijkbaar met andere volgsystemen. Bijvoorbeeld kan thermische stimulus worden toegepast via laser stimulus 7,14 of chemische informatie kan worden aangebracht via ruimtelijke gradiënten door de agar 3. Het systeem als geheel flexibel ontwerp en kan worden gebruikt met andere systemen zoals crawling Drosophila larven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
- de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
- Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028 (2008).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914 (2010).
- Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115 (2004).
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
- Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
- Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).
