Summary
Vi har utvecklat en video-rate system spårning mikroskop som kan spela in och kvantifiera
Abstract
Vi har utvecklat instrument, bildbehandling och data analysmetoder för att kvantifiera motoriskt beteende C. elegans som kryper på ytan av en agarplatta. För studien av den genetiska, biokemiska, och neuronal grund av beteende, C. elegans är en idealisk organism eftersom det är genetiskt foglig, mottaglig för mikroskopi, och visar ett antal komplicerade beteenden, däribland taxibilar, lärande och social interaktion 1,2. Beteendeanalys utifrån spåra rörelser maskar som de kryper på agarplattor har varit särskilt användbar i studiet av sensoriska beteende 3, förflyttning 4, och allmänna mutationsstatus fenotypning 5. Vårt system fungerar genom att flytta kameran och belysning system som maskarna kryper på en stationär agarplatta, som garanterar ingen mekanisk stimulans överförs till masken. Vårt system för spårning är lätt att använda och innehåller en semi-automatisk kalibrering funktionen. En challenge av alla system video tracking är att den genererar en enorm mängd data som i sig är hög dimensionell. Vår bildbehandling och program för dataanalys itu med denna utmaning genom att minska maskar formen till en uppsättning av oberoende komponenter, som övergripande rekonstruera maskar beteende som en funktion av endast 3-4 dimensioner 6,7. Som ett exempel på den process vi visar att masken går in och går ut den återföring tillstånd i en fas specifikt sätt.
Protocol
1. Beskrivning av Tracking Mikroskop
- En agarplatta belyses av en fiber-ljuskälla och avbildas med en kamera. Detta system är monterat till en X, Y-översättning skede.
- Scenen förflyttas medelst vanlig stegmotorer, vilka är anslutna till en stegmotorer.
- Regulatorn och kameran är ansluten till datorn och kontrolleras av anpassade program skrivna i LabVIEW.
- Kamerabilderna ytan av en agarplatta och identifierar mörka föremål på en ljus bakgrund.
- Bildkvaliteten justeras så att datorprogram kan kvantifiera objekt i realtid. Förstärkningen, ljusstyrka och slutartid på kameran kan justeras för att ge ett mörkt föremål på en vit bakgrund.
- En märket för automatisk kalibreringen görs genom att peta agarytan med en mask plocka.
- Den filtrerade, binära bild som används av programmet för att spåra kan kontrolleras.
- Den såftware har en automatisk kalibrering funktion som beräknar kalibreringsmatrisen genom att flytta ett testobjekt ett fast avstånd.
- Avstånd i pixlar är kalibrerad för åtgärder som vidtagits av stegmotorn vid kalibreringsmatrisen.
- Efter kalibreringen är systemet redo att gå och behöver inte kalibreras om förstoringen ändras eller om kameran flyttas.
2. Förbereda Spårning Plattor och C. elegans för spårning
- En koppar ringen används för att Corral maskar och hålla dem från att migrera till kanten av plattan. Kopparn ger en lokal kemisk barriär och påverkar inte rörelse av masken annars för experimentets varaktighet (<1 timme). Värm ringen först genom att placera den på ett värmeblock eller motsvarande.
- Placera ringen på en färsk agarplatta (1,7% Bacto Agar, 0,25% Bacto-pepton, 0,3% NaCl, 1 mM CaCla 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM kaliumfosfatbuffert, 5 | ig / mlkolesterol) och tryck ned något för att bädda in den agarytan.
- Pick L4 steget eller unga vuxna maskar på en agarplatta fylld med några NGM buffert (0,3% NaCl, 1 mM CaCla 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM kaliumfosfatbuffert) att tvätta dem av matrester. Låt maskar simma ett par minuter.
- Placera försiktigt en enda mask på spårning plattan nära centrum av ringen. Och sedan placera plattan på masken tracker.
3. Worm Spårning
- Kör LabVIEW-programmet och välja alternativ om det behövs (plats för bilder, typer av bilder, mätningar, kamerainställningar).
- Med styrspaken flytta mikroskopet tills en bild av masken är i synfältet (datorskärm). Tryck på "spår" för att aktivera programmet för att spåra.
- Datorprogrammet mäter faktiskt rörelser en filtrerad binära bilder som visas och kan göra mätningar på denna bilden i realtid
- After spårning en rekonstruktion av den globala banan kan göras från stegmotorn rörelserna, medan de lokala formförändringar av masken kan ses i detalj.
4. Dataanalys
- Kör skeletonizing skript (MATLAB) för inställning av maskens former. (Figur 2)
- Beräkna egenmoder av skeletonized uppgifterna. (Fig. 3,4)
- Visa Figur 5. Läs siffra legend eller resultat representativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exempel: När födosök, C. elegans övergångar från fram till back rörelse, ofta utföra en omorientering (omega sväng) innan han återvände till framåt staten. Kvantifiera denna övergång är viktig för att förstå de söker föda rörelsemönster och även i maskens motorstyrning. Befogenhet att avslöja subtila detaljer i rörelseorganen beteende kan ses med hjälp av vår tracker enhet.
Som exempel tittar vi på fram till back och bakåt vidarebefordra övergången genom att fånga högupplösta bilder av maskar kryper fritt på agarplattan för ~ 30 minuter. körs. Den eigenmode analys (Figur 3) kan vi mäta fasen av undulatory rörelser masken. Fasmätningen i sin tur tillåter oss att beräkna hastigheten hos masken och fram till back övergång (figur 4). Genom att rita gemensamma sannolikheten för maskens hastighet och fas, kan vi se att det transeuropeiska transportnätetition mellan framåt och bakåt hända probabilistiskt med en förmånlig fas (figur 5a). Om vi separerar fram till back och bakåt vidarebefordra övergångar och titta på den villkorliga sannolikheten för fas masken när det kommer och går en återföring händelse ser vi att de har olika fas distributioner (figur 5b, c).
Figur 1. Tracking mikroskop. Provet av en mask krypa på en agarplatta förblir stationär medan den avbildande flyttar systemet till att hålla masken i centrum av vyn. Det bildgivande systemet bygger på en 2D översättning steg drivs av stegmotorer (3). En CCD-kamera (Basler A601f) och objektiv (25 mm brännvidd) bilder masken underifrån (1) och en fiber ljus (Edmunds optik, modell) belyser den från ovan (2). En hemmagjord stegmotorer använder en enklasteep styrkort (SimpleStep, SSXYZ) styr rörelsen hos avbildningssystemet. En anpassad LabVIEW program (National Instruments, Austin, TX, USA) förvärvar och bearbetar bilder av maskar, samtidigt kommunicerar med motorstyrningen för att hålla masken i mitten av fältet.
Figur 2. Bildbehandling. (A) Worms flytta genom att ändra deras krökning i tid och så vi behandlade masken bilder genom parameterinställning sin mittlinje. Bilderna gjordes binär genom thesholding den råa gråskalebild (b) och enskilda maskar identifierades genom att filtrera objekt genom storlek (c). Avståndet mellan centrum av massan av masken och centrum av bilden beräknades och sedan scenen flyttades lämpliga avstånden till återcentrera worm. Dessa korrektionsfaktorer avstånd användes för att beräkna banan för masken. Krökningen av masken omkrets användes för att identifiera svansen (maximal krökning) och huvudet (sekundär maximal). (D) Bilderna därefter skeletonized att lokalisera mittlinjen. (E) Den resulterande kurvan sedan sedan interpoleras i 101 segment och den beräknade vinkeln mellan segmenten användes för inställning av kurvan. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Eigenmode beräkning. Grundläggande kurvor masken formen har beräknats med Analys huvudkomponenten 5. Varje mask kurva representeras av en linjär summa av egenvektorer (eller eigenworms), där amplitud av varje komponenter kallas eigenmode (läge). Vi kan kvantifiera beteendet av masken genom att mäta de första 3 egenmoder av masken form över tiden.
Figur 4. Fas och hastighet. (A) gemensam distribution av de första två lägen för en gräns cykel. (B) fas eller position på denna gräns cykel korrelerar med fas maskens vågformiga ställning. (C) Med fashastighet maskarna framåt och bakåt rörelser kan kvantifieras. (D) hastighet och riktning längs denna gräns cykler visar maskens hastighet. Klicka här för att se större bild .
4094fig5.jpg "alt =" Bild 5 "fo: content-width =" 4I "FO: src =" / files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg "/>
Figur 5. Fas beroende hastighet växling. Övergångarna mellan framåt och bakåt stater sker inte slumpmässigt längs oscillerande cykeln. De (men fortfarande stokastiskt) sker vid specifika faser. (A) gemensam distribution av fas hastighet och snabbhet visar tydligt att maskar lämna och gå framåt tillstånd företrädesvis vid specifika faser. (B) visar ett diagram över fas villkorat av ingången till en återföring händelse. (C) visar den fas under förutsättning utgången av en återföring händelse. Den svarta linjen är distribution av fasvinklar utan konditionering på en utgång eller ingång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet av förflyttning och naturliga beteende kräver icke-invasiva spårning tekniker i partner med tekniker datareduktion. Här har vi visat ett lättanvänt tracking system som registrerar detaljerade bilder av C. elegans beteende som det kryper på ytan av en agarplatta. Den mängd information som finns i dessa bilder är omfattande och hög-dimensionell, och så har vi även utvecklat metoder för att minska dimensionerna av data till endast fyra grundläggande åtgärder. Dessa åtgärder är omfattande och är lätta att tolka med hänsyn till masken beteende. För detta arbete visar vi att maskar övergången mellan framåt och bakåt anger företrädesvis vid olika punkter i sin vågformiga cykel, en åtgärd som är svår att göra genom ögat. Detta arbete är ett komplement till tracking system som har utvecklats för att mäta beteende maskar vid lägre förstoring 8,9,10, och även system som kan mäta eller modulera neuronal aktivitet med genetiskt kodade reagenser 11,12.
Medan enda organism spårning är en kraftfull metod för kvantifiering av beteende finns det vissa begränsningar i tekniken. Den första är det faktum att systemet spårar bara enstaka organismer vid en tidpunkt. I jämförelse med fast kamera trackers som kan spåra flera organismer 9,10, är genomströmningen av vår tracker låg. Men kan vi mäta beteende enda organism för långt längre tidsperioder än de multi-masken trackers, vilket är viktigt för kvantifiera långa beteenden tidsskala som hunger, äggläggning och föda. Även trackern kräver bilder som tydligt identifierar masken från bakgrunden. Detta utesluter oss från att studera mask rörelser i miljöer som visuellt är belamrad eller på annat sätt för komplex för bildbehandling för att filtrera bort masken.
Detta system är flexibelt och kan användas för andra typer av behavioralt spårning. I stället för en homogen miljö, kan masken spåras medan överlämnas till rumsliga och tidsmässiga sensorisk information, liknar andra spårningssystem. Till exempel, kan termisk stimulans appliceras via laser stimulus 7,14, eller kemisk information kan appliceras via rumsliga gradienter genom ägarn 3. Systemet som helhet är flexibel i design och kan användas med andra krypande system såsom Drosophila larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
- de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
- Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028 (2008).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914 (2010).
- Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115 (2004).
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
- Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
- Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).
