Summary
私たちは、記録し、定量化することができるビデオレートトラッキング顕微鏡システムを開発した
Abstract
我々は、Cの運動器官の挙動を定量化する計測機器、画像処理、データ解析技術を開発しましたエレガンスそれは寒天プレートの表面にはクロールのように。行動、Cの遺伝的、生化学的、および神経基盤の研究のためそれは顕微鏡に従順で、遺伝的に扱いやすい、タクシー、学習、社会的相互作用1,2含む複雑な行動の数を示していますのでelegansは理想的な生物である。彼らは寒天プレート上でクロールのようにワームの動きを追跡に基づいた行動分析は、感覚行動3、移動4、および一般的な変異表現型5の研究に特に有用であった。我々のシステムは、ワームは、機械的な刺激がワームには送信されません確実に静止寒天プレート上にクロールしているように、カメラと照明システムの設置場所を移動することによって動作します。私たちの追跡システムは使いやすいですし、半自動校正機能を備えています。茶すべてのビデオトラッキングシステムのllengeは、それが本質的に高い次元で大量のデータを生成することです。当社の画像処理やデータ解析プログラムでは、総合的に唯一の3から4次元6,7の関数としてワームの挙動を再現する独立したコンポーネントのセットにワームの形状を減らすことで、この課題に対処する。プロセスの例として、我々はこのワームは、位相特異的な方法で、その反転状態に出入りすることを示している。
Protocol
1。トラッキング顕微鏡の説明
- 寒天プレートは、ファイバ光源により照明とカメラで撮像される。このシステムは、X、Y移動ステージに取り付けられている。
- ステージは、ステッパ·モータ·コントローラに接続されている標準のステッパモータによって移動されています。
- コントローラとカメラがパソコンに接続されており、LabVIEWで記述されたカスタムプログラムによって制御されます。
- カメラが画像寒天プレートの表面をと明るい背景に暗いオブジェクトを識別します。
- 画質は、コンピュータプログラムがリアルタイムでオブジェクトを定量化することができるように調整される。ゲイン、明るさ、カメラのシャッタースピードは、白い背景上の暗い被写体を提供するように調整することができます。
- 自動キャリブレーション·プロセスのためのキャリブレーションマークがワームピックで寒天表面をつつくことによって作られています。
- 追跡プログラムによって使用され、濾過し、バイナリイメージを確認することができます。
- そうftwareテスト·オブジェクトの一定の距離を移動することによってキャリブレーション行列を計算し、自動キャリブレーション機能を持っています。
- ピクセル単位の距離は、キャリブレーション行列によってステッピングモータによりとられた措置にキャリブレーションされます。
- キャリブレーションした後、システムは行く準備ができていると倍率が変更されない限り、または、カメラの位置が変更されている場合は再校正する必要はありません。
2。トラッキングプレートと C の準備トラッキングのためのエレガンス
- 銅リングがワームを囲い、プレートの端に移行するからそれらを維持するために使用されます。銅は、局所的な化学的バリアーを提供し、実験（<1時間）の持続時間のためにそうでなければ、ワームの動きに影響を与えません。ヒートブロックまたは同等の上でそれを置くことによって、最初のリングを加熱する。
- 新鮮な寒天プレート上に置きリング（1.7％バクト寒天、0.25％バクトペプトン、0.3％のNaCl、1mMのCaCl 2、1mMのMgSO 4を 、25 mMリン酸カリウム緩衝液、5μg/ mlのコレステロール）と寒天表面に埋め込むこと少し下に押します。
- 食品残渣のそれらを洗浄するために、いくつかのNGMバッファー（0.3％のNaCl、1mMのCaCl 2、1mMのMgSO 4を 、25 mMリン酸カリウム緩衝液）を充填した寒天プレート上にL4の段階や若い成虫を選んでください。ワームは数分間泳ごう。
- 慎重にリングの中央付近追跡プレートの上に単一のワームを置く。その後ワームトラッカー上にプレートを置きます。
3。ワームトラッキング
- LabVIEWプログラムを実行し、必要に応じて（イメージの場所、画像、計測、カメラ設定の種類）オプションを選択します。
- ワームの像が視野（コンピュータ画面）になるまで、ジョイスティックを使用すると、顕微鏡を移動します。追跡プログラムを係合するように "トラック"を押してください。
- コンピュータプログラムは、実際には図のようにバイナリフィルタリングされた画像の動きを計測し、リアルタイムで、この画像上で測定を行うことができます
- アフトワームの局所的な形状の変化を詳細に見ることができる一方で、グローバル軌道の再構築を追跡ERは、ステッピングモータの動きから作ることができる。
4。データ解析
- ワームの形状をパラメータ化するskeletonizingスクリプト（MATLAB）を実行します。 （ 図2）
- スケルトンデータの固有モードを計算します。 （ 図3,4）
- 図5を表示します 。図の凡例または代表的な結果をお読みください。
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Representative Results
例：採餌、C. elegansの前方からの遷移が頻繁に前進運動の状態に戻る前に再配向を（オメガターン）を行うと、動きを逆転させる。この移行を定量化する動きの採餌パターンを理解する上で、また、ワームのモータ制御に重要である。歩行動作の微妙な詳細を明らかにする力は私たちのトラッカーデバイスを使用して見ることができます。
例として、我々は逆にして、約30分間寒天プレート上に自由にクロールワームの高解像度の画像をキャプチャすることにより、転移を転送するために逆に楽しみに見てください。実行されます。固有モード解析（ 図3）は、私たちがワームの波動運動の位相を測定することができます。順に位相測定は、私たちはワームと遷移します （ 図4）を逆に前方の速度を計算することができます。ワームの速度と位相の同時確率をプロットすることにより、我々はそのトランス見ることができます順方向および逆方向の優遇相（ 図5a）との間に起こる確率ition。我々は逆にして、トランジションを転送し、それが反転イベントを出入りするワームの位相の条件付き確率を見て逆に楽しみに分割すると、我々は、彼らが異なる位相分布（ 図5b、c）を持っていることがわかります。
図1：トラッキング顕微鏡。イメージングシステムは、ビューの中心にワームを維持するために移動しながら寒天プレート上でクロールワームのサンプルは静止したままである。撮像システムは、ステッパ·モータ（3）により駆動される2次元移動ステージ上に構築されています。 CCDカメラ（Basler社A601f）とレンズ（焦点距離25ミリメートル）画像の下からワーム（1）とファイバーライト（エド光学、モデル）は、上記（2）から、それを照らす。最も簡単に利用自家製ステッパモータコントローラEPコントローラボード（SimpleStep; SSXYZ）は、撮像系の動きを制御します。同時にフィールドの中心にワームを保つためにモータコントローラとの通信中にカスタムLabVIEWプログラム（ナショナルインスツルメンツ、オースティン、テキサス州、アメリカ）は、ワームの画像を取得して処理します。
図2画像処理。 （a）は、ワームは、時間内に彼らの曲率を変えることにより移動し、私たちはそれらの中心線をパラメータ化することで、ワームの画像を処理しました。画像は生のグレースケール画像（b）をthesholdingてバイナリを作ったし、個々のワームはサイズ（c）によってオブジェクトをフィルタリングすることによって同定された。ワームの質量の中心と画像の中心間の距離が再中心WOへの適切な距離を算出した後、ステージが移動しましたrmです。これらの補正距離はワームの軌道を計算するために使用した。ワームの境界の曲率が尾（最大曲率）とヘッド（セカンダリ最大）を識別するために使用されていました。 （d）の画像は、センターラインを見つけるために白骨た。 （e）の結果の曲線は、その後、その後101セグメントに補間され、セグメント間の計算された角度が曲線をパラメータ化するために使用されていました。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3固有モードの計算。ワーム形状の基本的な曲線は、主成分分析5を用いて計算しています。ここで、各ワーム曲線は、固有ベクトルの線形和（またはeigenworms）で表され各成分の振幅は、固有モード（モード）として知られています。我々は時間をかけて、ワームの形状の第3固有モードを測定することにより、ワームの挙動を定量化することができる。
図4：位相と速度。リミットサイクルの最初の2つのモードの（a）の同時分布。 （b）このリミットサイクル上の段階や位置は、ワームの波動の位置の位相と相関している。 （c）はワームフォワード位相速度を用い、後方の動きを定量化することができる。 （d）このリミットサイクルに沿った速度と方向は、ワームの速度を示します。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図5位相依存速度の切り替え。順方向および逆方向の状態間の遷移は、振動周期に沿ってランダムに起こるものではない。彼らは（それでも確率的に）特定のフェーズで起こる。 （a）は位相速度と速度の同時分布は明らかにワームは特定の段階で優先的に前方の状態のままにして入力することを示しています。 （b）の反転イベントへの入場を条件と位相のプロットを示す。 （c）の反転イベントの終了時に条件付けフェーズを示しています。黒い線は出口または入口にエアコン無しの位相角の分布である。
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Discussion
運動や自然な行動の研究では、データ削減技術を持つパートナーで非侵襲追跡技術を必要とします。ここでは、Cの詳細な画像を記録·トラッキング·システムを使用して簡単に実証されているそれは寒天プレートの表面にクロールとしてelegansは動作。これらの画像に含まれる情報の量が膨大かつ高次元であるので、我々はまた、4つだけ根本的な対策にデータの次元数を削減するための方法を開発した。これらの措置は、包括的であり、ワームの動作に関して解釈するのは簡単です。この仕事のために我々は、その波動サイクル、肉眼で行うことは困難である測定のさまざまなポイントで優先的に前方と後方の状態の間、そのワームの遷移を示しています。この作品は、測定することができますまたは神経ACTIを調節するシステムにも低倍率8,9,10時の虫の挙動を測定するために開発されたシステムを追跡するに相補的であり、遺伝的にコードされた試薬の11,12を使用して VITY。
単一生物の追跡は動作の定量化のための強力な方法であるが技術にはいくつかの制限があります。第一は、システムが一度に1つの生物を追跡しているという事実です。複数の生物9,10を追跡することができます固定カメラトラッカーと比較して、私たちのトラッカーのスループットが低下しています。しかし、我々はそのような飢餓、産卵し、餌として長い時間スケールの挙動を定量化するために重要であるマルチワームトラッカー、より時間がはるかに長い期間のための単一の生物の挙動を測定することができます。またトラッカーは明らかに背景からワームを識別する画像を必要とします。これは、ワームを除外する画像処理システムのための視覚的に雑然と、あるいは複雑すぎている環境でワームの動きを勉強してから私たちを排除している。
このシステムは柔軟性があり、behavi他の種類のために使用することができる経口追跡。代わりに、同種の環境の他のトラッキング·システムに似て空間的、時間的な感覚情報に提出しながら、ワームを追跡することができます。例えば、熱刺激を寒天3を介して、空間勾配を介して適用することができるレーザー刺激7,14、または化学的情報を介して適用することができます。システム全体としては、デザインに柔軟性があり、そのようなショウジョウバエの幼虫のような他のクローリングシステムで使用することができます。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
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