Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

C. ايليجانس تتبع وقياس السلوكية

doi: 10.3791/4094 Published: November 17, 2012

Summary

وقد وضعنا المجهر تتبع نظام سعر الفيديو التي يمكن أن تسجل وتقدير

Abstract

وقد وضعنا تقنيات تحليل الأجهزة، ومعالجة الصور، والبيانات لقياس السلوك الحركي للC. ايليجانس كما يزحف على سطح لوحة أجار. لدراسة الأساس، الوراثية والكيمياء الحيوية، والخلايا العصبية للسلوك، C. ايليجانس هو كائن حي مثالي لأنه لين العريكة وراثيا، قابلة للالمجهري، ويظهر عدد من السلوكيات المعقدة، بما في ذلك سيارات الأجرة، والتعلم، والاجتماعية 1،2 التفاعل. وكانت التحليل السلوكي يعتمد على تتبع تحركات الديدان لأنها تزحف على لوحات أجار مفيدة بشكل خاص في دراسة السلوك الحسي تنقل وعام phenotyping طفرية 5. نظامنا يعمل عن طريق تحريك نظام الكاميرا والإضاءة والديدان الزاحفة على لوحة أجار ثابتة، والتي تضمن تبث أي التحفيز الميكانيكي للدودة. نظامنا تتبع سهلة الاستخدام ويتضمن ميزة معايرة نصف آلية. A تشاllenge جميع أنظمة تتبع الفيديو هو أنه يولد كمية هائلة من البيانات التي هي مرتفعة في جوهرها الأبعاد. تجهيز صورتنا وبرامج تحليل البيانات التعامل مع هذا التحدي عن طريق الحد من شكل الديدان إلى مجموعة من مكونات مستقلة، والتي إعادة بناء شاملة سلوك الديدان بوصفها وظيفة من أبعاد فقط 3-4 6،7. كمثال على عملية نظهر أن الدودة يدخل ويخرج عكس حالته بطريقة محددة المرحلة.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. وصف مجهر تتبع

  1. يضيء لوحة أجار من مصدر الضوء الألياف وتصويرها بكاميرا. هي التي شنت هذا النظام إلى، X Y مرحلة الترجمة.
  2. يتم نقل المرحلة من المحركات السائر القياسية، التي ترتبط إلى وحدة تحكم محرك السائر.
  3. وترتبط وحدة تحكم وكاميرا إلى الكمبيوتر والتي تسيطر عليها برامج مخصصة المكتوبة في ابفيف.
  4. الكاميرا الصور على سطح لوحة أجار ويحدد كائنات الظلام على خلفية الخفيفة.
  5. يتم ضبط جودة الصورة بحيث يمكن تحديد برنامج كمبيوتر الكائنات في الوقت الحقيقي. ويمكن تعديل المكسب، والسطوع، وسرعة مصراع الكاميرا لتوفير الكائن داكنة على خلفية بيضاء.
  6. يتم إجراء معايرة للعلامة عملية المعايرة التلقائية بدس سطح أجار مع اختيار دودة.
  7. ويمكن التحقق من تصفيتها، الصورة الثنائية الذي يستخدم من قبل برنامج التعقب.
  8. ماftware لديه ميزة لصناعة السيارات في معايرة يحسب مصفوفة المعايرة عن طريق تحريك كائن اختبار مسافة ثابتة.
  9. يتم معايرة مسافات بالبكسل إلى الخطوات التي اتخذتها السائر المحركات من المصفوفة المعايرة.
  10. بعد المعايرة، فإن هذا النظام على استعداد للذهاب وليس من الضروري أن يكون تعديلها ما لم يتم تغيير التكبير أو إذا أعادت الكاميرا.

2. إعداد لوحات التتبع وC. ايليجانس لتعقب

  1. ويستخدم النحاس لحلقة زريبة الديدان ومنعهم من الهجرة إلى حافة اللوحة. النحاس يوفر حاجزا الكيميائية المحلية و لا يؤثر على حركة الدودة وإلا لمدة التجربة (<1 ساعة). تسخين الحلقة الأولى عن طريق وضعها على كتلة الحرارة أو ما يعادلها.
  2. حلقة مكان على لوحة أجار الطازجة (1.7٪ Bacto آجار، 0.25٪ Bacto-ببتون، كلوريد الصوديوم 0.3٪، 1 ملم CaCl 1 ملم MgSO 25 مم العازلة الفوسفات والبوتاسيوم، 5 ميكروغرام / ملالكوليسترول) واضغط لأسفل قليلا إلى تضمين ذلك إلى السطح أجار.
  3. اختيار L4 المرحلة أو الديدان البالغة الشباب على لوحة مليئة أجار بعض العازلة NGM (0.3٪ كلوريد الصوديوم، 1 ملم CaCl 1 ملم MgSO 25 ملم العازلة فوسفات البوتاسيوم) لغسلها من بقايا الطعام. السماح للالديدان تسبح لبضع دقائق.
  4. وضع بعناية دودة واحدة على لوحة التعقب بالقرب من مركز الحلبة. ثم ضع لوحة على تعقب دودة.

3. دودة تتبع

  1. تشغيل البرنامج وحدد خيارات ابفيف إذا لزم الأمر (الموقع للصور، وأنواع من الصور، والقياسات، وإعدادات الكاميرا).
  2. باستخدام عصا التحكم نقل المجهر حتى صورة للدودة هو في مجال الرؤية (شاشة الكمبيوتر). اضغط على "المسار" للمشاركة في برنامج التعقب.
  3. برنامج الكمبيوتر يقيس الواقع حركات وصور ثنائية تمت تصفيتها كما هو موضح ويمكن إجراء قياسات على هذه الصورة في الوقت الحقيقي
  4. الخلفويمكن إجراء تتبع إيه إعادة بناء مسار الحركات العالمية من السيارات السائر، في حين يمكن رؤية التغييرات المحلية شكل من الدودة بالتفصيل.

4. تحليل البيانات

  1. تشغيل البرنامج النصي skeletonizing (MATLAB) ليعبر بالحدود الأشكال الدودة. (الشكل 2)
  2. eigenmodes حساب البيانات skeletonized. (الشكل 3،4)
  3. تظهر الشكل 5. قراءة أسطورة الرقم أو ممثل النتائج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مثال: عندما تستخدم علفا، C. ايليجانس الانتقال من الأمام عكس الحركة، وغالبا ما تؤدي إعادة توجيه (أوميغا بدوره) قبل أن تعود إلى الحالة الحركة إلى الأمام. قياس هذا التحول المهم في فهم أنماط التنقل والبحث عن الطعام أيضا في التحكم في المحركات الدودة. يمكن أن ينظر إلى السلطة للكشف عن تفاصيل خفية من السلوك الحركي باستخدام جهاز تعقب لدينا.

وكمثال على ذلك ننظر إلى الأمام عكس وعكس الانتقال إلى الأمام من خلال التقاط صور عالية الدقة من الديدان تزحف على لوحة بحرية أجار ل30 دقيقة ~. يعمل. تحليل eigenmode (الشكل 3) يسمح لنا لقياس المرحلة من حركات الموجية للدودة. قياس المرحلة بدوره يسمح لنا لحساب سرعة الدودة وإلى الأمام على عكس الانتقالية (الشكل 4). بواسطة التخطيط المشترك لاحتمال سرعة والدودة المرحلة، يمكننا أن نرى أن عبرition بين الأمام ويحدث العكس مع احتماليا مرحلة التفضيلية (الشكل 5A). إذا كنا فصل الأمام عكس وعكس لإعادة توجيه التحولات وإلقاء نظرة على الاحتمال الشرطي للمرحلة الدودة عندما تدخل ومخارج حدث عكس، ونحن نرى أن لديهم التوزيعات مرحلة متميزة (الشكل 5B، ج).

الشكل 1
الشكل 1. تتبع المجهر. عينة دودة تزحف على صفيحة أغار لا تزال ثابتة في حين أن نظام التصوير يتحرك للحفاظ على دودة في وسط الرأي. تم بناء نظام التصوير على مسرح ترجمة 2D مدفوعا المحركات السائر (3). كاميرا CCD (باسلر A601f) وعدسة (25mm البعد البؤري) الصور الدودة من أسفل (1) وعلى ضوء الألياف (أدموندز البصريات؛ نموذج) ينير عليه من فوق (2). A محلية الصنع تحكم السائر المحرك الاستفادة من أبسطEP تحكم المجلس (SimpleStep؛ SSXYZ) يتحكم في حركة نظام التصوير. برنامج مخصص ابفيف (الصكوك الوطنية، أوستن، TX، الولايات المتحدة الأمريكية) ويكتسب بمعالجة الصور من الديدان، وأثناء الاتصال في وقت واحد مع وحدة تحكم محرك للحفاظ على دودة في وسط الميدان.

الشكل 2
الشكل 2. معالجة الصور. (أ) نقل الديدان عن طريق تغيير انحناء في الوقت ولذا فإننا معالجة الصور بواسطة دودة parameterizing خط الوسط. وأدلى صور ثنائية من thesholding الخام صورة مقياس الرمادية (ب)، كما تم تحديد الديدان الفردية من خلال تصفية حسب حجم الكائنات (ج). وكانت المسافة بين مركز كتلة دودة ومركز الصورة محسوب ثم تم نقل المرحلة المسافات المناسبة لإعادة التعليم الجامعي مركزRM. واستخدمت هذه المسافات التصحيح لحساب مسار الدودة. تم استخدام انحناء محيط دودة لتحديد ذيل (انحناء كحد أقصى) ورئيس (الحد الأقصى الثانوية). (د) وبعد ذلك skeletonized الصور لتحديد خط الوسط. (ه) وبعد ذلك منحنى الناتج محرف ثم إلى 101، وكان يستخدم شرائح زاوية محسوبة بين شرائح ليعبر بالحدود المنحنى. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3
الشكل 3. Eigenmode الحساب. حسبت منحنيات الأساسية للشكل دودة باستخدام مبدأ تحليل المركبات 5. يتم تمثيل كل منحنى من دودة مبلغ الخطية من المتجهات الذاتية (أو eigenworms)، حيث ومن المعروف سعة كل المكونات كما eigenmode (واسطة). يمكننا تحديد سلوك الدودة عن طريق قياس أول 3 eigenmodes الشكل دودة مع مرور الوقت.

الشكل 4
الشكل 4. المرحلة وسرعة. (أ) توزيع مشترك بين وضعي الأول للدورة الحد. (ب) مرحلة أو موقف بشأن هذه الدورة يرتبط الحد مرحلة الموجية موقف الدودة. (ج) استخدام سرعة المرحلة الديدان إلى الأمام والخلف ويمكن كميا الحركات. (د) سرعة واتجاه على طول هذا الحد يشير دورات سرعة الدودة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

4094fig5.jpg "بديل =" الشكل 5 "FO: المحتوى العرض =" 4in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg "/>
الشكل 5. تبديل السرعة تعتمد المرحلة. التحولات بين الدول إلى الأمام وعكس لا يحدث بشكل عشوائي على طول دورة متذبذبة. انهم (ولكن لا يزال عشوائيا) يحدث في مراحل معينة. (أ) توزيع مشترك لسرعة الطور وسرعة تشير بوضوح إلى أن الديدان مغادرة ودخول الدولة إلى الأمام بشكل تفضيلي في مراحل محددة. (ب) يظهر مؤامرة للمرحلة مشروطة مدخل حدث العكس. (ج) يدل على مرحلة مشروطة خروج حدث العكس. خط أسود هو توزيع الزوايا المرحلة دون تكييف أو الخروج على المدخل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

دراسة للتنقل والسلوك الطبيعي يتطلب تقنيات غير الغازية تتبع في شراكة مع تقنيات للحد من البيانات. هنا قد أثبتنا وسيلة سهلة لاستخدام نظام التتبع الذي يسجل صورا تفصيلية للC. ايليجانس السلوك لأنه يزحف على سطح لوحة أجار. كمية المعلومات الواردة في هذه الصور هو واسعة وعالية الأبعاد، وهكذا قمنا بتطوير وسائل للحد من الأبعاد من البيانات إلى أربعة فقط اجراءات جذرية. هذه التدابير هي شاملة وسهلة لتفسير السلوك فيما يتعلق دودة. لهذا العمل الذي نقوم تبين أن الانتقال بين الديدان إلى الأمام وإلى الخلف تنص تفضيلي عند نقاط مختلفة في دورة الموجية لها، وهو الإجراء الذي من الصعب القيام به من خلال العين. هذا العمل هو مكمل لتتبع الأنظمة التي وضعت لقياس سلوك الديدان في أقل التكبير 8،9،10، وأيضا على الأنظمة التي هي قادرة على قياس أو تعدل موارد الوراثية الحيوانية العصبيةvity باستخدام الكواشف المشفرة وراثيا 11،12.

في حين تتبع الكائن هو واحد وسيلة قوية لالكمي للسلوك هناك بعض القيود لهذه التقنية. الأول هو أن يتتبع النظام الكائنات احد فقط في كل مرة. بالمقارنة مع الكاميرا بتتبع الثابتة والتي هي قادرة على تتبع الكائنات متعددة 9،10، ومرت من تعقب لدينا منخفضة. ومع ذلك، ونحن قادرون على قياس سلوك الكائن الحي واحد لفترات أطول بكثير من الوقت من بتتبع دودة متعددة، وهو أمر مهم لتحديد النطاق الزمني الطويل السلوكيات مثل الجوع، ووضع البيض، وتستخدم علفا. كما يتطلب تعقب الصور التي تحدد بوضوح دودة من الخلفية. هذا يمنع من دراسة الحركات لنا دودة في البيئات التي يتم تشوش البصر أو معقدة للغاية إلا للصورة نظام المعالجة لتصفية الدودة.

هذا النظام هو مرن، ويمكن أن تستخدم لأنواع أخرى من behaviعن طريق الفم تتبع. بدلا من بيئة متجانسة، ويمكن تتبع دودة بينما يقدم إلى المعلومات الحسية المكانية والزمانية، على غرار نظم تتبع الأخرى. على سبيل المثال، يمكن تطبيق التحفيز الحراري عن طريق تحفيز الليزر 7،14، أو يمكن تطبيق المعلومات الكيميائية عن طريق التدرجات المكانية من خلال أجار 3. النظام ككل هو مرونة في التصميم، ويمكن استخدامها مع أنظمة أخرى مثل الزحف يرقات ذبابة الفاكهة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CCD camera Basler A601f
Lens Edmund Optics MMS series
Fiber Illumination Dolan Jenner DC-950H
Translation stage Deltron LS3-4
Stepper Motor US digital MS23C
Stepper motor drive Gecko G201
Stepper motor control SimpleStep SSXYZ
All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71-79 (1974).
  2. de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
  3. Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19, (21), 9557-9569 (1999).
  4. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (9), 3184-3191 (2005).
  5. Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118, (1), 9-21 (2002).
  6. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4, (1), e1000028 (2008).
  7. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5, (11), e13914 (2010).
  8. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115 (2004).
  9. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3, (5), e2208 (2008).
  10. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, (7), 592-598 (2011).
  11. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, (2), 147-152 (2011).
  12. Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, (2), 153-158 (2011).
  13. Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187, (2), 229-234 (2010).
  14. Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, (18), 10477-10482 (1999).
<em>C. ايليجانس</em> تتبع وقياس السلوكية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans Tracking and Behavioral Measurement. J. Vis. Exp. (69), e4094, doi:10.3791/4094 (2012).More

Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans Tracking and Behavioral Measurement. J. Vis. Exp. (69), e4094, doi:10.3791/4094 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter