Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

C. elegans Tracking og adfærdsmæssige måling

doi: 10.3791/4094 Published: November 17, 2012

Summary

Vi har udviklet en video-rate sporing mikroskop system, der kan registrere og kvantificere

Abstract

Vi har udviklet instrumentering, billedbehandling, og dataanalyse teknikker til at kvantificere bevægelsesadfærd af C. elegans som den gennemgår på overfladen af en agarplade. Til undersøgelse af genetiske, biokemiske og neuronal grundlag af adfærd, C. elegans er en ideel organisme, fordi det er genetisk medgørlig, modtagelig for mikroskopi, og viser en række komplekse adfærd, herunder taxier, læring og social interaktion 1,2. Adfærdsanalyse baseret på tracking bevægelser orm de kravler på agarplader har været særligt nyttige i studiet af sensorisk adfærd 3, bevægelse 4, og generelt mutational fænotypebestemmelse 5. Vores system virker ved at bevæge kamera og belysningssystemet som ormene kravler på en stationær agarplade, som sikrer ingen mekanisk stimulus overføres til ormen. Vores tracking system er let at bruge og indeholder en semi-automatisk kalibrering funktion. En challenge af alle video tracking systemer er, at det genererer en enorm mængde data, der er uløseligt høj dimensional. Vores billedbehandling og dataanalyse programmer beskæftige sig med denne udfordring ved at reducere orme form i et sæt af uafhængige komponenter, som omfattende rekonstruerer orme adfærd som en funktion af kun 3-4 dimensioner 6,7. Som et eksempel på fremgangsmåden viser vi, at ormen går ind og ud dets omvendt tilstand i en fase-specifik måde.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Beskrivelse af Tracking Microscope

  1. En agarplade belyses af en fiber lyskilde og afbildes med et kamera. Dette system er monteret på en X, Y translation stage.
  2. Scenen bevæges af standard stepmotorer, som er forbundet med en stepmotor controller.
  3. Regulatoren og kameraet er tilsluttet computeren og kontrolleret af brugerdefinerede programmer skrevet i LabVIEW.
  4. Den kamerabilleder overfladen af ​​en agarplade og identificerer mørke objekter på en lys baggrund.
  5. Billedkvaliteten justeres således, at edb-program kan kvantificere objekter i realtid. Gevinsten, lysstyrke og lukkertid på kameraet kan indstilles til at give en mørk objekt på en hvid baggrund.
  6. En stregen for den automatiske kalibrering proces er lavet ved at stikke agaroverfladen med en orm pick.
  7. Den filtrerede, binære billede, som anvendes af tracking program kan kontrolleres.
  8. Det såledesftware har en automatisk kalibrering funktion, der beregner kalibreringen matrixen ved at bevæge et testobjekt en fast afstand.
  9. Afstande i pixels er kalibreret til skridt, som den stepmotoren ved kalibreringen matrix.
  10. Efter kalibrering, er systemet klar til at gå, og behøver ikke at blive justeret, hvis forstørrelsen er ændret eller hvis kameraet flyttes.

2. Forberedelse Tracking Plader og C. elegans til sporing

  1. En kobberring anvendes til Corral orme og holde dem bevæger sig mod kanten af ​​pladen. Kobberet tilvejebringer en lokal kemisk barriere og ikke påvirker bevægelse af ormen ellers under hele forsøget (<1 time). Varm ring først ved at placere den på en varmeblok eller tilsvarende.
  2. Place ringen på en frisk agarplade (1,7% Bacto-agar, 0,25% Bacto-pepton, 0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM kaliumphosphat-puffer, 5 ug / mlkolesterol) og tryk ned lidt for at integrere det i agaroverfladen.
  3. Pick L4 trin eller unge voksne orme på en agarplade fyldes med et NGM puffer (0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM kaliumphosphatpuffer) at vaske dem af madrester. Lad ormene svømme i et par minutter.
  4. Forsigtigt én orm på sporing pladen nær centrum af ringen. Og derefter placere pladen på ormen tracker.

3. Worm Tracking

  1. Kør LabVIEW programmet og vælge indstillinger om nødvendigt (placering til billeder, typer af billeder, målinger, kameraindstillinger).
  2. Ved hjælp af joysticket flytte mikroskopet indtil et billede af ormen er i synsfeltet (computerskærmen). Tryk på "track" for at aktivere tracking program.
  3. Computerprogrammet faktisk måler bevægelser af et binært filtrerede billeder som vist, og kan foretage målinger på dette billede i realtid
  4. Aftis sporing en rekonstruktion af den samlede bane kan fremstilles af de stepmotor bevægelser, mens de lokale formændringer af ormen kan ses i detaljer.

4. Dataanalyse

  1. Kør skeletonizing script (MATLAB) at parametrisere den orme-figurer. (Figur 2)
  2. Beregn eigentilstande i skeletonized data. (Fig. 3,4)
  3. Viser figur 5. Læs figurteksten eller repræsentative resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Eksempel: Når fouragering, C. elegans overgange fra frem til at vende bevægelse, ofte udfører en nyorientering (omega omgang) før han vendte tilbage til den fremadrettede bevægelse tilstand. Kvantificering denne overgang er vigtigt at forstå fouragerende bevægelsesmønstre og også i orme-motorstyring. Beføjelsen til at afsløre subtile detaljer i bevægelse adfærd kan ses ved hjælp af vores tracker enhed.

Som et eksempel vil vi se på frem til at vende og vende at sende overgang ved at erobre billeder i høj opløsning af orme gennemsøgning frit på agarplade for ~ 30 min. kører. The eigenmode analyse (figur 3) tillader os at måle fasen af de bølgeformet bevægelser af orm. Fasemålingen på sin side gør det muligt at beregne hastigheden af orm og frem til at vende overgangen (figur 4). Ved at plotte fælles sandsynlighed for orme-hastighed og fase, kan vi se, at transition mellem frem og bak sker probabilistisk med en præferentiel fase (figur 5a). Hvis vi adskiller os til at vende og vende at sende overgange og se på den betingede sandsynlighed for fase af ormen, når den kommer ind i og forlader en vending begivenhed, ser vi, at de har forskellige fase distributioner (figur 5b, c).

Figur 1
Figur 1. Tracking mikroskop. Prøven af ​​en orm gennemsøgning på en agarplade forbliver stationær, mens den billeddannende flytter systemet til at holde ormen i centrum af visningen. Den billeddannende system er bygget på en 2D oversættelse stadie drevet af stepmotorer (3). Et CCD-kamera (Basler A601f) og linsen (25 mm brændvidde) billeder ormen nedefra (1) og en fiber lys (Edmunds optik; model) lyser den ovenfra (2). En hjemmelavet stepper motor controller anvendelse af en enklesteep controller board (SimpleStep, SSXYZ) styrer bevægelsen af ​​imaging system. Et brugerdefineret LabVIEW program (National Instruments, Austin, TX, USA) erhverver og behandler billeder af orme, samtidig kommunikerer med motorstyringen at holde ormen i midten af ​​feltet.

Figur 2
Figur 2. Billedbehandling. (A) Worms flytter ved at ændre deres krumning i tid og så vi behandlet ormen billeder ved parameterizing deres midterlinje. Billederne blev fremstillet binære ved thesholding den rå gråskalabillede (b), og individuelle orme blev identificeret ved filtrering objekter efter størrelse (c). Afstanden mellem centrum af massen af ​​snekken og midten af ​​billedet blev beregnet og derefter fase blev flyttet passende afstande til at centrere worm. Disse korrektionsfaktorer afstande blev anvendt til at beregne bane af orm. Krumningen af ​​ormen perimeter blev anvendt til at identificere halen (maksimal krumning) og hoved (sekundær maksimum). (D) Billederne blev derefter skeletonized at lokalisere midterlinien. (E) Den resulterende kurve blev derefter derefter interpoleret i 101 segmenter og den beregnede vinkel mellem segmenter blev brugt til at parametrere kurven. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. Eigenmode beregningen. Grundlæggende kurver af ormen formen er beregnet ved hjælp Princip Component Analysis 5. Hver orm kurve er repræsenteret ved en lineær sum af egenvektorer (eller eigenworms), hvor amplitude af hver komponenter er kendt som eigenmode (tilstand). Vi kan kvantificere adfærd af ormen ved at måle de første 3 eigentilstande af ormen form over tid.

Figur 4
Figur 4. Fase og hastighed. (A) Den fælles distribution af de første to tilstande for en grænse cyklus. (B) Den fase eller position på denne grænse cyklus korrelerer med fase af ormen er bølgeformet position. (C) Brug fasehastigheden ormene frem og tilbage bevægelser kan kvantificeres. (D) Den hastighed og retning langs denne grænse cykler indikerer ormen hastighed. Klik her for at se større figur .

4094fig5.jpg "alt =" Figur 5 "fo: indhold-bredde =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg "/>
Figur 5. Fase afhængig hastighed skifte. Overgangene mellem frem og bak stater ikke ske tilfældigt langs den oscillerende cyklus. De (men stadig stokastisk) ske ved bestemte faser. (A) Den fælles distribution af fasehastigheden og hastighed viser klart, at orme forlade og indtast den forreste tilstand fortrinsvis ved bestemte faser. (B) viser et plot af fasen betinget af indgangen til et omvendt arrangement. (C) viser fasen betinget af udgangen fra en omvendt arrangement. Den sorte linje er fordelingen af ​​fasevinkler uden konditionering på en exit eller indgang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Studiet af bevægelse og naturlig adfærd kræver ikke-invasive teknikker til sporing i partner med data reduktionsteknikker. Her har vi vist et brugervenligt tracking system, der optager detaljerede billeder af C. elegans adfærd som det kravler på overfladen af en agarplade. Mængden af ​​oplysninger i disse billeder er stort og high-dimensional, og så har vi også udviklet metoder til at mindske dimensionalitet af data i kun fire grundlæggende foranstaltninger. Disse foranstaltninger er omfattende og er nemme at fortolke med hensyn til orm adfærd. For dette arbejde viser vi, at orme overgang mellem frem og tilbage anfører fortrinsvis på forskellige tidspunkter i sit bølgeformet cyklus, en foranstaltning, der er svært at gøre med det blotte øje. Dette arbejde er komplementær til sporingssystemer, der er udviklet til at måle adfærd orme ved lavere forstørrelse 8,9,10 og også til systemer, der er i stand til at måle eller modulere neuronal aktivity hjælp af genetisk kodede reagenser 11,12.

Mens en enkelt organisme tracking er en kraftfuld metode til kvantificering af adfærd der er nogle begrænsninger i teknikken. Den første er, at systemet sporer kun enkelte organismer ad gangen. I forhold til faste kamera trackere som er i stand til at spore flere organismer 9,10, er gennemløbet af vores tracker lav. Men vi er i stand til at måle adfærd enkelt organisme for langt længere tid end de multi-ormen trackers, hvilket er vigtigt for kvantificere langt tidsrum adfærd, såsom sult, æglægning, og fouragering. Også trackeren kræver billeder, der klart identificerer ormen fra baggrunden. Dette udelukker os fra at studere ormen bevægelser i miljøer, der er visuelt rodet eller på anden måde for komplekse til det billedbehandlingssystemet at bortfiltrere ormen.

Dette system er fleksibel og kan anvendes til andre typer behavioral tracking. I stedet for et homogent miljø, kan ormen spores mens indsendes til rumlig og tidsmæssig sensorisk information, der ligner andre tracking systemer. For eksempel kan termisk stimulus påføres via laser stimulus 7,14, eller kemisk information kan påføres via rumlige gradienter gennem agar 3. Systemet som helhed er fleksibelt i konstruktion og kan anvendes med andre crawling systemer såsom Drosophila-larver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CCD camera Basler A601f
Lens Edmund Optics MMS series
Fiber Illumination Dolan Jenner DC-950H
Translation stage Deltron LS3-4
Stepper Motor US digital MS23C
Stepper motor drive Gecko G201
Stepper motor control SimpleStep SSXYZ
All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71-79 (1974).
  2. de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
  3. Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19, (21), 9557-9569 (1999).
  4. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (9), 3184-3191 (2005).
  5. Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118, (1), 9-21 (2002).
  6. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4, (1), e1000028 (2008).
  7. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5, (11), e13914 (2010).
  8. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115 (2004).
  9. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3, (5), e2208 (2008).
  10. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, (7), 592-598 (2011).
  11. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, (2), 147-152 (2011).
  12. Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, (2), 153-158 (2011).
  13. Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187, (2), 229-234 (2010).
  14. Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, (18), 10477-10482 (1999).
<em>C. elegans</em> Tracking og adfærdsmæssige måling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans Tracking and Behavioral Measurement. J. Vis. Exp. (69), e4094, doi:10.3791/4094 (2012).More

Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans Tracking and Behavioral Measurement. J. Vis. Exp. (69), e4094, doi:10.3791/4094 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter