Summary
Wir haben ein Video-Rate Tracking Mikroskop-System aufzeichnen und quantifizieren können entwickelt
Abstract
Wir haben Instrumente, Bildverarbeitung und Datenanalyse-Techniken entwickelt, um die motorischen Verhalten von C. Quantifizierung elegans, wie es auf der Oberfläche einer Agarplatte kriecht. Für die Untersuchung der genetischen, biochemischen und neuronalen Grundlagen von Verhalten, C. elegans ist ein idealer Organismus, da sie genetisch gefügig, zugänglich Mikroskopie ist, und zeigt eine Reihe von komplexen Verhaltensweisen, einschließlich Taxis, Lernen und soziale Interaktion 1,2. Verhaltensanalyse auf das Verfolgen der Bewegungen der Würmer wie sie kriechen auf Agarplatten Basis haben sich als besonders nützlich bei der Untersuchung von sensorischen Verhalten 3, Fortbewegung 4 und 5 allgemein Mutations Phänotypisierung. Unser System funktioniert, indem die Kamera und Beleuchtungssystem die Würmer kriecht auf einer stationären Agarplatte, die keine mechanischen Reiz auf die Schnecke übertragen wird gewährleistet. Unser Tracking-System ist einfach zu bedienen und enthält eine semi-automatische Kalibrierung. Ein challenge aller Video-Tracking-Systeme ist, dass es eine enorme Menge an Daten, die intrinsisch hohe Dimensionsstabilität ist, erzeugt. Unsere Bildverarbeitung und Datenanalyse-Programme befassen sich mit dieser Herausforderung, indem die Würmer Form in einer Reihe von unabhängigen Komponenten, die umfassend rekonstruieren die Würmer Verhalten als Funktion von nur 3-4 Abmessungen 6,7. Als ein Beispiel für den Prozess gezeigt, dass die Schnecke und Auswurf aus deren Umkehrung Zustand in einer Phase spezifischen Weise.
Protocol
Ein. Beschreibung von Tracking-Mikroskop
- Eine Agarplatte wird durch eine Faser-Lichtquelle beleuchtet und abgebildet mit einer Kamera. Dieses System wird auf einen X, Y Translationstisch montiert ist.
- Die Stufe wird durch Standard-Schrittmotoren, die mit einem Schrittmotor-Controller verbunden bewegt werden.
- Der Controller und die Kamera mit dem Computer verbunden ist und durch individuelle Programme in LabVIEW geschrieben.
- Die Kamera Bilder der Oberfläche einer Agarplatte und identifiziert dunkle Objekte auf einem hellen Hintergrund.
- Die Bildqualität wird so eingestellt, dass Computerprogramm kann Objekte in Echtzeit zu quantifizieren. Die Verstärkung, der Helligkeit und Verschlußzeit der Kamera eingestellt werden, um einen dunklen Objekts auf einem weißen Hintergrund zu liefern.
- A Eichmarke für die automatische Kalibrierung wird durch Stossen die Agar-Oberfläche mit einem Wurm Pick gemacht.
- Die gefilterten binären Bildes, das durch den Tracking-Programm verwendet wird, kann geprüft werden.
- Die software hat eine Auto-Kalibrierung Funktion, die Kalibriermatrix berechnet, indem ein Testobjekt einen festen Abstand.
- Abstände in Pixeln zu den Schritten von dem Schrittmotor durch die Kalibrierungsmatrix genommen kalibriert.
- Nach der Kalibrierung ist das System bereit zu gehen und muss nicht neu kalibriert werden, wenn die Vergrößerung verändert wird oder wenn die Kamera neu positioniert.
2. Vorbereiten Spurplatten und C. elegans für Tracking
- Ein Kupfer-Ring wird verwendet, um die Würmer corral und halten sie von der Migration auf die Kante der Platte. Das Kupfer stellt eine lokale chemische Barriere und beeinflusst nicht die Bewegung der Schnecke sonst für die Dauer des Experiments (<1 h). Heizen Sie den Ring zuerst, indem sie auf einem Heizblock oder gleichwertig.
- Muffel auf eine frische Agarplatte (1,7% Bacto Agar, 0,25% Bacto-Pepton, 0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM Kaliumphosphatpuffer, 5 pg / mlCholesterin), und drücken Sie leicht nach unten, um es in der Agar-Oberfläche einbinden.
- Wählen L4 Bühne oder jungen erwachsenen Würmer auf eine Agarplatte mit einigen NGM-Puffer (0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM Kaliumphosphatpuffer) gefüllt, um sie von Speiseresten zu waschen. Lassen Sie die Würmer schwimmen für ein paar Minuten.
- Vorsichtig eine einzige Schnecke auf das Tracking Platte nahe der Mitte des Rings. Und legen Sie dann die Platte auf dem Wurm-Tracker.
3. Worm-Tracking
- Führen Sie das LabVIEW-Programm und wählen Sie Optionen, wenn nötig (Speicherort für Bilder, Arten von Abbildungen, Maße, Kamera-Einstellungen).
- Mit dem Joystick das Mikroskop bis ein Bild des Wurms ist im Sichtfeld (Computer-Bildschirm). Drücken Sie auf "Track", um die Tracking-Programm engagieren.
- Das Computerprogramm misst direkt die Bewegungen eines binären gefilterten Bilder wie gezeigt und können Messungen über dieses Bild in Echtzeit zu machen
- Achterner Verfolgen einer Rekonstruktion der globalen Bewegungsbahn aus den Schrittmotor Bewegungen ausgeführt werden, während die lokalen Formänderungen der Schnecke im Detail gesehen werden kann.
4. Data Analysis
- Führen Skelettieren script (MATLAB) des Wurms Formen parametrieren. (Abbildung 2)
- Berechnen Eigenmoden der skelettierten Daten. (Abbildung 3,4)
- Zeigen Abbildung 5. Lesen Figur Legende oder repräsentative Ergebnisse.
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Representative Results
Beispiel: bei der Futtersuche, C. elegans Übergänge von vorwärts auf rückwärts Bewegung, oft Durchführung einer Neuorientierung (omega Umdrehung) vor der Rückkehr in die Vorwärtsbewegung Zustand. Quantifizierung dieser Übergang ist für das Verständnis der Nahrungssuche Bewegungsmuster und auch in der Wurm-Motorsteuerung wichtig. Die Befugnis zur subtilen Details der Fortbewegung Verhalten zeigen, zu sehen mit unseren Tracker-Gerät werden.
Als Beispiel betrachten wir die vorwärts auf rückwärts und rückwärts, um den Übergang von der Aufnahme hochauflösende Bilder von Würmern kriechen frei auf der Agarplatte für ~ 30 min weiterzuleiten. läuft. Die Eigenmodus Analyse (Abbildung 3) ermöglicht es, die Phase der welligen Bewegungen der Schnecke gemessen werden. Die Phasenmessung wiederum ermöglicht es, die Geschwindigkeit der Schnecke und dem vorderen, den Übergang (Abbildung 4) umzukehren berechnen. Durch Auftragen der gemeinsamen Wahrscheinlichkeit des Wurms Geschwindigkeit und Phase können wir sehen, dass die transition zwischen vorwärts und rückwärts probabilistisch geschehen mit einer bevorzugten Phase (Abbildung 5a). Wenn wir vorwärts auf rückwärts und umgekehrt, um Übergänge zu übermitteln und schauen Sie sich die bedingte Wahrscheinlichkeit der Phase des Wurms, wenn es und tritt verlässt eine Umkehr Ereignis trennen, sehen wir, dass sie verschiedene Phasen Distributionen (5b, c) haben.
Abbildung 1. Tracking-Mikroskop. Die Probe von einem Wurm kriecht auf einer Agar-Platte stationär bleibt, während das bildgebende System bewegt sich der Wurm in der Mitte der Blick zu behalten. Das bildgebende System wird auf einem 2D Translationsstufe durch Schrittmotoren (3) angetrieben gebaut. Eine CCD-Kamera (Basler A601f) und Objektiv (25 mm Brennweite) Bilder die Schnecke von unten (1) und eine Faser Licht (Edmunds Optik; Modell) leuchtet es von oben (2). Eine hausgemachte Schrittmotor-Controller unter Verwendung einer einfachenep Anschaltbaugruppe (SimpleStep; SSXYZ) die Bewegung des Abbildungssystems. Eine benutzerdefinierte LabVIEW-Programm (National Instruments, Austin, TX, USA) erfasst und verarbeitet Bilder der Würmer, während gleichzeitig die Kommunikation mit der Motorsteuerung, um den Wurm in der Mitte des Feldes zu halten.
Abbildung 2. Bildverarbeitung. (A) Worms zu bewegen, indem ihre Krümmung in der Zeit und so haben wir den Wurm Bilder durch Parametrierung ihrer Mittellinie verarbeitet. Die Bilder wurden binäre durch thesholding die rohe Graustufenbild (b) gemacht, und einzelne Würmer wurden durch Filterung von Objekten nach Größe (c) identifiziert. Der Abstand zwischen dem Zentrum der Masse der Schnecke und dem Zentrum des Bildes berechnet wurde und dann wurde die Bühne bewegt die entsprechenden Abstände zu neu zu zentrieren die WOrm. Diese Korrekturdistanzen wurden verwendet, um die Trajektorie der Schnecke zu berechnen. Die Krümmung des Umfangs der Schnecke wurde verwendet, um den Schwanz (maximale Krümmung) und Kopf (Nebenmaximum) zu identifizieren. (D) Die Bilder wurden anschließend skelettiert, um die Mittellinie zu lokalisieren. (E) Die resultierende Kurve wurde dann dann interpoliert in 101 Segmente und der berechnete Winkel zwischen den Segmenten wurde verwendet, um die Kurve zu parametrieren. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. Eigenform Berechnung. Fundamental Kurven der Wurm Form wurden anhand Hauptkomponentenanalyse 5. Jede Schnecke Kurve durch eine lineare Summe der Eigenvektoren (oder eigenworms), vertreten, wo der Amplitude jeder Komponente wird als der Eigenmode (Mode) bekannt. Wir können das Verhalten der Schnecke durch die Messung der ersten 3 Eigenmoden der Schnecke der Zeit ihre Form zu quantifizieren.
Abbildung 4. Phase und Geschwindigkeit. (A) Der gemeinsame Verteilung der ersten beiden Modi für einen Grenzzyklus. (B) Die Phase oder Position auf diesem Grenzzyklus korreliert mit der Phase des Wurms wellenförmigen Position. (C) Mit der Phasengeschwindigkeit die Würmer Vorwärts-und Rückwärtsbewegungen quantifiziert werden können. (D) Die Geschwindigkeit und Richtung entlang dieser Grenze Zyklen zeigt der Wurm Geschwindigkeit. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Abbildung 5. Phase abhängig Velocity Switching. Die Übergänge zwischen Vorwärts und Rückwärts-Zustände nicht mehr beliebig passieren entlang der oszillierende Zyklus. Sie (aber immer noch stochastisch) in bestimmten Phasen geschehen. (A) Die gemeinsame Verteilung der Phasengeschwindigkeit und Geschwindigkeit zeigt deutlich, dass Würmer und lassen Sie den Forward-State bevorzugt an bestimmte Phasen. (B) zeigt ein Diagramm der Phase am Eingang zu einer Umkehr Ereignis konditioniert. (C) zeigt die Phase des Ausgangs von einer Umkehr Ereignis konditioniert. Die schwarze Linie ist die Verteilung der Phasenwinkel ohne Konditionierung auf einem Ausgang oder Eingang.
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Discussion
Die Studie der Fortbewegung und natürliches Verhalten erfordert nicht-invasive Tracking-Techniken in den Partnerländern mit Datenreduktion Techniken. Hier haben wir eine einfache gezeigt, dass Tracking-System, das detaillierte Bilder von C. Datensätze verwenden elegans Verhalten, wie es auf der Oberfläche einer Agarplatte kriecht. Die Menge der Informationen in diesen Bildern enthalten ist riesig und High-dimensional, und so haben wir auch Methoden, um die Dimensionalität der Daten in nur vier grundlegende Maßnahmen zur Reduzierung entwickelt. Diese Maßnahmen sind umfassend und lassen sich leicht mit Bezug auf Wurm Verhalten zu interpretieren. Für diese Arbeit zeigen wir, dass Würmer Übergang zwischen Vorwärts und Rückwärts besagt bevorzugt an unterschiedlichen Punkten in seiner wellenförmigen Zyklus, eine Maßnahme, die nur schwer mit dem Auge zu tun ist. Diese Arbeit ist komplementär zu Tracking-Systeme, die entwickelt wurden, um das Verhalten von Würmern bei niedriger Vergrößerung 8,9,10 messen, und auch für Systeme, die in der Lage sind zu messen oder zu modulieren neuronalen aktivität mit genetisch kodierten Reagenzien 11,12.
Während einzigen Organismus Tracking ist eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung des Verhaltens gibt es einige Einschränkungen für die Technik. Die erste ist die Tatsache, dass das System nur einzelne Organismen zu einer Zeit verfolgt. Im Vergleich zu festen Kamera trackers die Lage, mehrere Organismen 9,10 verfolgen sind, ist der Durchsatz der Tracker niedrig. Allerdings sind wir in der Lage, das Verhalten des einzelnen Organismus für weit längere Zeiträume als die multi-Wurm trackers, was wichtig ist für Quantifizierung langen Zeitraum Verhaltensweisen wie Hunger, Eiablage und Nahrungssuche zu messen. Auch der Tracker benötigt Bilder, die eindeutig identifizieren den Wurm aus dem Hintergrund. Dies schließt uns aus dem Studium Wurm Bewegungen in Umgebungen, die visuell überladen sind oder sonst zu komplex für das Bildverarbeitungssystem herauszufiltern den Wurm.
Dieses System ist flexibel und kann für andere Arten von Verhaltensebene verwendet werdenmündliche Tracking-Systems. Statt einer homogenen Umgebung, kann der Wurm verfolgt, während die räumliche und zeitliche sensorische Informationen, ähnlich wie in anderen Tracking-Systeme gestellt werden. Beispielsweise kann thermischen Reiz mittels Laser Stimulus 7,14 angewendet werden, oder chemische Informationen können über räumlichen Gradienten durch den Agar 3 angewendet werden. Das System als Ganzes ist im Design flexibel und kann mit anderen Systemen wie Crawling Drosophila-Larven eingesetzt werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
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