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Neuroscience

सी. एलिगेंस ट्रैकिंग और व्यवहार मापन

doi: 10.3791/4094 Published: November 17, 2012

Summary

हम एक वीडियो दर ट्रैकिंग खुर्दबीन प्रणाली विकसित किया है कि रिकॉर्ड और यों तो कर सकते

Abstract

हम उपकरण, इमेज प्रोसेसिंग, और डेटा विश्लेषण तकनीक विकसित की है सी. locomotory व्यवहार यों एलिगेंस के रूप में यह एक अगर थाली की सतह पर क्रॉल. आनुवंशिक, व्यवहार, सी. के जैव रासायनिक और neuronal आधार के अध्ययन के लिए एलिगेंस एक आदर्श जीव है क्योंकि यह आनुवंशिक विनयशील, माइक्रोस्कोपी करने के लिए उत्तरदायी है, और टैक्सियों, सीखने, और सामाजिक संपर्क 1,2 सहित जटिल व्यवहार के एक नंबर से पता चलता है. व्यवहार कीड़े की गतिविधियों पर नज़र रखने के रूप में वे अगर प्लेटों पर क्रॉल पर आधारित विश्लेषण विशेष रूप से उपयोगी संवेदी व्यवहार 3, 4 हरकत, और सामान्य mutational 5 phenotyping के अध्ययन में किया गया है. हमारी प्रणाली कैमरा और प्रकाश व्यवस्था आगे बढ़ के रूप में कीड़े एक स्थिर अगर थाली है, जो यह सुनिश्चित करता है कि कोई यांत्रिक उत्तेजना कीड़ा फैलता है पर क्रॉल करके काम करता है. हमारे ट्रैकिंग प्रणाली का उपयोग करने के लिए आसान है और अर्द्ध स्वचालित एक अंशांकन की सुविधा शामिल है. एक चासभी वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम के llenge है कि यह डेटा का एक विशाल राशि है कि आंतरिक रूप से उच्च आयामी है उत्पन्न करता है. हमारी छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण कार्यक्रमों स्वतंत्र घटक है जो व्यापक केवल 3-4 6,7 आयाम के एक समारोह के रूप में कीड़े व्यवहार फिर से बनाना या निर्माण करना का एक सेट में कीड़े आकार को कम करने से इस चुनौती से निपटने. हम प्रक्रिया का एक उदाहरण के रूप में दिखाने के लिए है कि कृमि में प्रवेश करती है और एक चरण विशिष्ट तरीके से रास्ते में अपनी उत्क्रमण राज्य.

Protocol

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1. ट्रैकिंग माइक्रोस्कोप का विवरण

  1. अगर प्लेट एक फाइबर प्रकाश स्रोत द्वारा प्रबुद्ध है और एक कैमरा के साथ imaged. इस प्रणाली के एक एक्स, वाई अनुवाद चरण के लिए मुहिम शुरू की है.
  2. चरण मानक stepper मोटर्स, जो एक stepper मोटर नियंत्रक से जुड़े हैं द्वारा ले जाया जाता है.
  3. नियंत्रक और कैमरा और कंप्यूटर से जुड़े हैं और कस्टम LabVIEW में लिखा कार्यक्रमों द्वारा नियंत्रित है.
  4. कैमरा एक अगर प्लेट की सतह छवियों और एक प्रकाश पृष्ठभूमि पर काले वस्तुओं की पहचान है.
  5. छवि गुणवत्ता इतनी है कि कंप्यूटर कार्यक्रम वास्तविक समय में वस्तुओं यों तो कर सकते करने के लिए निकाला जाता है. लाभ, चमक, और कैमरे के शटर गति एक सफेद पृष्ठभूमि पर एक अंधेरे वस्तु प्रदान करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
  6. स्वचालित अंशांकन प्रक्रिया के लिए एक अंशांकन चिह्न एक कीड़ा लेने के साथ अगर सतह poking द्वारा किया जाता है.
  7. फ़िल्टर्ड, द्विआधारी छवि है जो ट्रैकिंग कार्यक्रम के द्वारा किया जाता है की जाँच की जा सकती है.
  8. इसलिएftware एक ऑटो अंशांकन सुविधा है कि एक परीक्षण वस्तु एक निश्चित दूरी बढ़ द्वारा अंशांकन मैट्रिक्स की गणना है.
  9. पिक्सल में दूरियाँ अंशांकन मैट्रिक्स द्वारा stepper मोटर द्वारा उठाए गए कदमों के लिए calibrated है.
  10. अंशांकन के बाद, सिस्टम जाने के लिए तैयार है और की जरूरत है जब तक बढ़ाई बदल रहा है या नहीं अगर कैमरा repositioned है recalibrated जा.

2. ट्रैकिंग प्लेट्स और सी. की तैयारी ट्रैकिंग के लिए एलिगेंस

  1. एक तांबे की अंगूठी कीड़े खेत और थाली के किनारे करने के लिए पलायन से उन्हें रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. तांबा एक स्थानीय रासायनिक बाधा प्रदान करता है और प्रयोग (<1 घंटे) की अवधि के लिए तो कीड़ा के आंदोलन को प्रभावित नहीं. अंगूठी यह एक गर्मी ब्लॉक या समकक्ष पर रखने से पहले गर्मी.
  2. एक ताजा अगर थाली पर प्लेस अंगूठी (1.7% Bacto अग्रवाल, 0.25% Bacto peptone, 0.3% NaCl, 1 मिमी CACL 2, 1 मिमी MgSO 4, 25 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर, 5 ग्राम / मिलीलीटरकोलेस्ट्रॉल) और थोड़ा नीचे प्रेस करने के लिए अगर सतह में एम्बेड.
  3. एक अगर कुछ एन जी एम बफर (0.3%, NaCl 1 मिमी CACL 2, 1 मिमी MgSO 4, 25 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर) के साथ भरा करने के लिए उन्हें भोजन अवशेषों के धो प्लेट पर L4 मंच या युवा वयस्क कीड़े उठाओ. कीड़े कुछ मिनट के लिए तैरने.
  4. ध्यान से अंगूठी के केंद्र के पास ट्रैकिंग थाली पर एक कीड़ा जगह है. और फिर कीड़ा tracker पर थाली जगह है.

3. कृमि ट्रैकिंग

  1. LabVIEW कार्यक्रम चलाने के लिए और विकल्पों का चयन अगर जरूरत (छवियों के लिए स्थान, चित्र, माप, कैमरा सेटिंग्स के प्रकार).
  2. का प्रयोग जोस्टिक कीड़ा की एक छवि तक खुर्दबीन चाल (कंप्यूटर स्क्रीन) को देखने के क्षेत्र में है. प्रेस "ट्रैक" ट्रैकिंग कार्यक्रम संलग्न.
  3. कंप्यूटर प्रोग्राम वास्तव में एक द्विआधारी फ़िल्टर्ड छवियों के आंदोलनों के उपाय के रूप में दिखाया गया है और वास्तविक समय में इस छवि पर माप कर सकते हैं
  4. पिछाड़ीवैश्विक प्रक्षेपवक्र के पुनर्निर्माण पर नज़र रखने एर stepper मोटर आंदोलनों से बनाया जा सकता है, जबकि स्थानीय कृमि के आकार बदलता विस्तार में देखा जा सकता है.

4. डेटा विश्लेषण

  1. Skeletonizing स्क्रिप्ट (MATLAB) चलाने के लिए कीड़ा आकार parameterize. (चित्रा 2)
  2. Skeletonized डेटा के eigenmodes गणना. (3,4 चित्रा)
  3. चित्रा 5. आंकड़ा किंवदंती या प्रतिनिधि परिणाम पढ़ें.

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Representative Results

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उदाहरण: जब foraging सी., एलिगेंस संक्रमण आगे से प्रस्ताव को उल्टा करने के लिए, अक्सर आगे गति राज्य के लिए लौटने से पहले एक पुनरभिविन्यास (ओमेगा बारी) प्रदर्शन. इस संक्रमण बढ़ाता आंदोलन के foraging पैटर्न को समझने में और भी कीड़ा मोटर नियंत्रण में महत्वपूर्ण है. हरकत व्यवहार का सूक्ष्म विवरण प्रकट करने की शक्ति हमारे tracker उपकरण का उपयोग कर देखा जा सकता है.

एक उदाहरण के रूप में हम आगे देखने के लिए रिवर्स और ~ 30 मिनट के लिए अगर प्लेट पर स्वतंत्र रूप से रेंगने कीड़े की उच्च संकल्प छवियों पर कब्जा करने से संक्रमण आगे रिवर्स. चलाता है. eigenmode विश्लेषण (3 चित्रा) हमें कृमि के undulatory आंदोलनों के चरण को मापने के लिए अनुमति देता है. बदले में चरण माप हमें कीड़ा और संक्रमण (4 चित्रा) रिवर्स करने के लिए आगे के वेग की गणना करने के लिए अनुमति देता है. कीड़ा वेग और चरण के संयुक्त संभाव्यता की साजिश रचने, हम देख सकते हैं कि ट्रांसition के बीच आगे और रिवर्स एक तरजीही चरण (चित्रा 5a) के साथ probabilistically होता. अगर हम आगे अलग करने के लिए रिवर्स और बदलाव करने को आगे और रिवर्स कीड़ा जब यह प्रवेश करती है और रास्ते एक उलट घटना के चरण के सशर्त संभावना पर देखो, हम देखते हैं कि वे अलग चरण वितरण (चित्रा 5b, ग).

चित्रा 1
1 चित्रा खुर्दबीन ट्रैकिंग. एक एक अगर थाली पर कृमि क्रॉलिंग का नमूना स्थिर बनी हुई है जबकि इमेजिंग प्रणाली दृश्य के केन्द्र में कीड़ा रखने चाल. इमेजिंग प्रणाली एक 2d अनुवाद stepper मोटर्स (3) द्वारा संचालित मंच पर बनाया गया है. एक सीसीडी (Basler A601f) कैमरा और लेंस (25mm फोकल लम्बाई) (1) के नीचे से कीड़ा छवियों और एक फाइबर प्रकाश (Edmunds प्रकाशिकी, मॉडल) (2) के ऊपर से illuminates. एक घर stepper मोटर नियंत्रक एक सरल का उपयोगep नियंत्रक बोर्ड (SimpleStep, SSXYZ) इमेजिंग प्रणाली के आंदोलन को नियंत्रित करता है. एक कस्टम LabVIEW कार्यक्रम (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स, ऑस्टिन, TX, संयुक्त राज्य अमेरिका) प्राप्त प्रक्रियाओं और कीड़े की छवियों, जबकि एक साथ मोटर नियंत्रक के साथ संवाद स्थापित करने के लिए क्षेत्र के केंद्र में कीड़ा रखने.

चित्रा 2
चित्रा 2 छवि प्रसंस्करण. (क) कीड़े समय में उनकी वक्रता बदल कदम है और इसलिए हम अपने केंद्र लाइन parameterizing द्वारा कीड़ा छवियों संसाधित. छवियों कच्चे ग्रे स्केल छवि (ख) thesholding द्वारा द्विआधारी किए गए थे, और व्यक्तिगत कीड़े आकार (ग) वस्तुओं को छानने की पहचान की गई है. कृमि के द्रव्यमान का केंद्र और छवि के केन्द्र के बीच की दूरी की गणना की थी और तब चरण में ले जाया गया था फिर से केंद्र wo के लिए उपयुक्त दूरीrm. ये सुधार दूरी कृमि के प्रक्षेपवक्र की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया. कीड़ा परिधि की वक्रता (अधिकतम वक्रता) पूंछ और सिर (माध्यमिक अधिकतम) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. (घ) छवियों तो केंद्र की रेखा का पता लगाने skeletonized थे. (ई) जिसके परिणामस्वरूप वक्र तो फिर 101 खंडों में interpolated और क्षेत्रों के बीच की गणना कोण वक्र parameterize करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3 eigenmode गणना. कीड़ा आकार के मौलिक घटता सिद्धांत घटक विश्लेषण 5 का उपयोग कर की गणना की गई है. प्रत्येक कीड़ा वक्र eigenvectors की एक रेखीय राशि (या eigenworms), द्वारा प्रतिनिधित्व किया है, जहां प्रत्येक घटक के आयाम eigenmode (मोड) के रूप में जाना जाता है. हम समय पर कीड़ा आकार के पहले 3 eigenmodes मापने के द्वारा कृमि के व्यवहार यों कर सकते हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4 चरण और वेग. (क) एक सीमा चक्र के लिए पहले दो मोड के संयुक्त वितरण. (ख) या इस सीमा चक्र पर चरण स्थिति कीड़ा undulatory स्थिति के चरण के साथ संबद्ध है. (ग) चरण वेग कीड़े आगे का प्रयोग और पिछड़े आंदोलनों मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. (घ) और इस सीमा चक्र के साथ गति और दिशा कीड़ा वेग को इंगित करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

4094fig5.jpg "alt =" चित्रा 5 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 4in "के लिए: src =" / files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg / ">
चित्रा 5 चरण निर्भर वेग स्विचन. आगे और रिवर्स राज्यों के बीच संक्रमण बेतरतीब ढंग से oscillatory चक्र के साथ ऐसा नहीं है. वे (लेकिन अभी भी stochastically) विशिष्ट चरणों में होता है. (क) चरण वेग और गति के संयुक्त वितरण स्पष्ट रूप से इंगित करता है कि कीड़े छोड़ और विशिष्ट चरणों में आगे राज्य में प्रवेश preferentially. (ख) एक उलट घटना के लिए प्रवेश द्वार पर वातानुकूलित चरण के एक भूखंड से पता चलता है. (ग) एक उलट घटना के बाहर निकलने पर वातानुकूलित चरण से पता चलता है. काला लाइन एक निकास या प्रवेश द्वार पर कंडीशनिंग के बिना चरण कोणों का वितरण है.

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Discussion

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हरकत और प्राकृतिक व्यवहार का अध्ययन डेटा कम करने की तकनीक के साथ साथी में गैर इनवेसिव ट्रैकिंग तकनीक की आवश्यकता है. यहाँ हम एक ट्रैकिंग प्रणाली है कि रिकॉर्ड सी. के विस्तृत चित्र का उपयोग करने के लिए आसान प्रदर्शन किया है एलिगेंस व्यवहार के रूप में यह एक अगर थाली की सतह पर क्रॉल. इन छवियों में निहित जानकारी की राशि विशाल और उच्च आयामी है, और इसलिए हम भी केवल चार बुनियादी उपायों में डेटा के dimensionality को कम करने के लिए तरीके विकसित किया है. इन उपायों व्यापक हैं और कीड़ा व्यवहार करने के लिए सम्मान के साथ की व्याख्या करने के लिए आसान कर रहे हैं. इस कार्य के लिए हम आगे और पिछड़े अपने undulatory चक्र में विभिन्न बिंदुओं, एक उपाय है कि आंख से करना मुश्किल है preferentially राज्यों के बीच है कि कीड़े संक्रमण दिखाते हैं. यह काम करने के लिए प्रणाली है कि कम 8,9,10 बढ़ाई कीड़े के व्यवहार को मापने के लिए विकसित किया गया है पर नज़र रखने के लिए पूरक है, और भी प्रणाली है कि करने के लिए उपाय करने में सक्षम हैं या neuronal acti मिलानाआनुवंशिक रूप से इनकोडिंग अभिकर्मकों 11,12 vity का उपयोग कर.

जबकि एकल जीव ट्रैकिंग व्यवहार की मात्रा का ठहराव के लिए एक शक्तिशाली तरीका है कि तकनीक के लिए कुछ सीमाएं हैं. पहला तथ्य यह है कि प्रणाली में एक समय में केवल एक ही जीवों पटरियों है. निश्चित कैमरा trackers जो कई 9,10 जीवों को ट्रैक करने में सक्षम हैं की तुलना में, हमारी नजर रखने के throughput कम है. हालांकि, हम बहु कीड़ा trackers, जो भूख, अंडे बिछाने, और foraging के रूप में लंबे समय के पैमाने पर व्यवहार यों के लिए महत्वपूर्ण है की तुलना में अब तक समय की लंबी अवधि के लिए एकल जीव के व्यवहार को मापने के लिए सक्षम हैं. इसके अलावा ट्रैकर छवियों, जो स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि से कृमि की पहचान की आवश्यकता है. यह हमें कीड़ा आंदोलनों का अध्ययन कि नेत्रहीन या बरबाद कर रहे हैं और छवि प्रसंस्करण प्रणाली के लिए बाहर कीड़ा फिल्टर अन्यथा बहुत जटिल वातावरण में से precludes.

इस प्रणाली लचीला है और behavi के अन्य प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैमौखिक ट्रैकिंग. बजाय एक समरूप वातावरण, कृमि, जबकि स्थानिक और लौकिक संवेदी जानकारी, अन्य ट्रैकिंग सिस्टम के लिए समान प्रस्तुत पता लगाया जा सकता है. उदाहरण के लिए, थर्मल प्रोत्साहन लेजर 7,14 प्रोत्साहन के माध्यम से लागू किया जा सकता है, या रासायनिक जानकारी अगर 3 के माध्यम से स्थानिक gradients के माध्यम से लागू किया जा सकता है. एक पूरे के रूप में इस प्रणाली के डिजाइन में लचीला है और ड्रोसोफिला लार्वा के रूप में अन्य रेंगने सिस्टम के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CCD camera Basler A601f
Lens Edmund Optics MMS series
Fiber Illumination Dolan Jenner DC-950H
Translation stage Deltron LS3-4
Stepper Motor US digital MS23C
Stepper motor drive Gecko G201
Stepper motor control SimpleStep SSXYZ
All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author.

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References

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<em>सी. एलिगेंस</em> ट्रैकिंग और व्यवहार मापन
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Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans Tracking and Behavioral Measurement. J. Vis. Exp. (69), e4094, doi:10.3791/4094 (2012).More

Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans Tracking and Behavioral Measurement. J. Vis. Exp. (69), e4094, doi:10.3791/4094 (2012).

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