Summary
Мы создали видео-курс отслеживания микроскопа, который может записывать и количественно
Abstract
Мы разработали методы приборов, обработки изображений и анализа данных для количественной оценки двигательного поведения C. Элеганс как он ползает на поверхности агар пластины. Для изучения генетических, биохимических и нейронные основы поведения, C. Элеганс является идеальным организма, потому что это генетически послушный, поддаются микроскопии, а также показывает ряд комплексных поведения, в том числе такси, обучения и социальной 1,2 взаимодействия. Поведенческий анализ, основанный на отслеживании движений червей, как они ползают по агаром были особенно полезны при изучении сенсорных поведение 3, локомоции 4, а общее мутационные фенотипирование 5. Наша система работает посредством перемещения камеры и системы освещения, как черви ползает на неподвижной пластины агара, который обеспечивает отсутствие механических стимулов передается на червя. Наша система слежения проста в использовании и включает в себя полуавтоматическую калибровку функции. Чаllenge всех систем видео слежения является то, что она порождает огромное количество данных, которые по своей сути высокой размерности. Наш обработки изображений и программ анализа данных справиться с этой задачей за счет сокращения червей форму в набор независимых компонентов, которые всесторонне восстановить червей поведение как функция только 3-4 размеры 6,7. В качестве примера этого процесса мы покажем, что червь входит и выходит из ее разворот состояния в фазу специфическим образом.
Protocol
1. Описание отслеживания Микроскоп
- Агаром освещается волокном источником света и полученную с камеры. Эта система устанавливается на X, Y стадии перевода.
- Этап переносится на стандартных шаговых двигателей, которые связаны с контроллером шагового двигателя.
- Контроллер и камера подключена к компьютеру и управляется пользовательских программ, написанных в LabVIEW.
- Изображения с камеры на поверхности пластины агара и определяет темных объектов на светлом фоне.
- Качество изображения регулируется таким образом, что компьютерные программы позволяют количественно оценить объектов в реальном времени. Коэффициент усиления, яркости и скорости затвора камеры может регулироваться, чтобы обеспечить темный объект на белом фоне.
- Калибровка знак для автоматического процесса калибровки сделан, тыкая поверхность агара с червем выбор.
- Фильтром, бинарных изображений, который используется программа отслеживания может быть проверена.
- Такftware имеет автоматической калибровки функция, которая вычисляет калибровки матрицы путем перемещения объекта испытаний фиксированном расстоянии.
- Расстояние в пикселях откалиброван для шагах, предпринятых шагового двигателя при калибровке матрицы.
- После калибровки, система готова к работе и не нуждается в повторной калибровке, если увеличение будет изменено или, если камера перемещаются.
2. Подготовка отслеживания Плиты и C. Элеганс для отслеживания
- Медное кольцо используется для загон червей и удержать их от перехода на край тарелки. Меди обеспечивает местный химический барьер и не влияет на движение червь в противном случае в течение всего срока эксперимента (<1 часа). Нагреть кольцо сначала поместить его на блок тепла или эквивалент.
- Место кольцо на свежие пластины агара (1,7% Bacto агар, 0,25% Бакто-пептон, 0,3% NaCl, 1 мМ CaCl 2, 1 мМ MgSO 4, 25 мМ калий-фосфатный буфер, 5 мкг / млхолестерин) и надавите слегка вставлять его в поверхность агара.
- Выберите L4 сцене или молодых взрослых червей на пластинке агара заполнены некоторые буфера NGM (0,3% NaCl, 1 мМ CaCl 2, 1 мМ MgSO 4, 25 мМ калий-фосфатный буфер), чтобы вымыть их от остатков пищи. Пусть черви плавают в течение нескольких минут.
- Аккуратно положите одного червя на отслеживание пластины недалеко от центра кольца. А затем поместите пластину на червя трекера.
3. Worm слежения
- Запустите программу LabVIEW и выберите опцию, если нужно (место для изображений, типы изображений, измерений, настройки камеры).
- С помощью джойстика переместите микроскопом, пока изображение червя находится в поле зрения (экран компьютера). Нажмите "дорожка" заниматься программу слежения.
- Компьютерная программа на самом деле измеряет движения двоичной отфильтрованные изображения, как показано и может сделать измерения на эту фотографию в реальном времени
- Кормовойэ отслеживания реконструкции глобальной траектории могут быть сделаны из шаговых движений двигателя, в то время как локальные изменения формы червя можно увидеть в подробностях.
4. Анализ данных
- Выполнить скелетируя сценарий (MATLAB) для параметризации формы червя. (Рис. 2)
- Рассчитать мод каркасно данных. (Рис 3,4)
- Показать Рисунок 5. Читайте легенде фигура или представителем результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример: Живя, C. Элеганс переходы с прямого на обратный ход, часто выполняя переориентации (омега очередь) перед возвращением в состояние движения вперед. Количественная этот переход является важным в понимании кормления паттернов движения, а также в управление двигателем червя. Мощность выявить тонкие детали передвижения поведение можно увидеть, используя наш трекер.
В качестве примера мы посмотрим на переднем чтобы обратить вспять и обратить вспять направить переход от захвата изображений с высоким разрешением черви ползают свободно на чашки с агаром в течение ~ 30 мин. работает. Анализ собственных мод (рис. 3) позволяет измерять фазу волновой движения червя. Измерения фазы в свою очередь, позволяет вычислить скорость червя и ожидает обратного перехода (рис. 4). По построения совместной вероятности скорости червя и фазы, мы видим, что транс-ition между прямой и обратной случиться вероятностно с льготным фазы (рис. 5а). Если мы отделяем вперед повернуть вспять и обратить вспять направить переходов и посмотреть на условную вероятность фазе червя, когда он входит и выходит из разворота событий, мы видим, что они имеют различные распределения фазы (рис. 5б, в).
Рисунок 1. Отслеживание микроскопом. Образец червь ползет по агаром остается неподвижным, а визуализация система движется сохранить червя в центре зрения. Системы визуализации построена на этапе перевода 2D действие шаговыми двигателями (3). CCD камера (Basler A601f) и объектива (фокусное расстояние 25мм) изображений червя снизу (1) и волоконных световодов (Edmunds оптики; модель) освещает его сверху (2). Домашнее шаговым двигателем контроллер с использованием простейшейер плате контроллера (SimpleStep; SSXYZ) контролирует движение системы визуализации. Программа пользовательских LabVIEW (National Instruments, Остин, Техас, США) получает и обрабатывает изображения червей, одновременно общаясь с контроллером двигателя держать червя в центре поля.
Рисунок 2. Обработки изображения. (А) Черви двигаться путем изменения их кривизны во времени и таким образом мы обработали червь изображений параметрирования центральной линии. Изображения были сделаны двоичных thesholding сырья серых масштаб изображения (б), и индивидуальные черви были определены путем фильтрации объектов по размеру (с). Расстояние между центрами масс червя и центр изображения был рассчитан, а затем этап был перенесен соответствующие расстояния до повторного центр горегт. Эти коррекции расстояния были использованы для расчета траектории движения червя. Кривизны червь периметру была использована для выявления хвост (максимальная кривизна) и головы (вторичный максимум). (Г) изображения были затем скелетонизирован, чтобы найти центральную линию. (Е) В результате кривая, то затем интерполировать на 101 сегментов и расчетный угол между сегментами были использованы для параметризации кривой. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Собственных мод расчет. Основные кривые червь формы были рассчитаны с использованием принципа Анализ компонентов 5. Каждый червь кривая представляет собой линейную сумму собственных (или eigenworms), где Амплитуда каждой компоненты известен как собственных мод (режим). Мы можем количественно поведение червя путем измерения первые 3 мод червь форму с течением времени.
Рисунок 4. Фазы и скорости. (А) совместное распределение двух первых режимах предельный цикл. (Б) фазу или позицию по этому предельный цикл коррелирует с фазой волновой позиции червя. (С) Использование фазовой скорости червей вперед и назад движения может быть определена количественно. (Г) скорость и направление вдоль этой предельных циклов указывает скорость червя. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
4094fig5.jpg "ALT =" Рисунок 5 "FO: содержание ширина =" 4in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg "/>
Рисунок 5. Фаза зависимым переключением скоростей. Переходы между прямой и обратной государств не бывает случайным вдоль колебательного цикла. Они (но все еще стохастически) происходят в определенных фазах. (А) совместное распределение фазовой скорости и скорости ясно показывает, что черви оставить и введите вперед состояния преимущественно в определенные фазы. (Б) приведена зависимость фазы обусловлено входе в поворот событий. (С) показывает фазы обусловлено выходом разворота событий. Черная линия распределения фазовых углов без кондиционирования на выходе или входе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изучение движения и естественное поведение требует неинвазивных методов отслеживания в партнера методов обработки данных. Здесь мы продемонстрировали простой в использовании системой слежения, которая записывает детальные изображения C. Элеганс поведение как она ползает на поверхности агар пластины. Количество информации, содержащейся в этих образов является обширной и многомерной, и поэтому мы также разработали методы снижения размерности данных в только четыре основных мер. Эти меры носят комплексный характер и их легко интерпретировать по отношению к червя поведения. Для этой работы мы покажем, что черви переход между прямой и обратной говорится преимущественно в разных точках ее волновой цикл, меры, которые трудно сделать на глаз. Эта работа дополняет системы отслеживания, которые были разработаны для измерения поведение червей в меньшем увеличении 8,9,10, а также к системам, которые в состоянии измерить или модулировать нейронные ACTiВиты с использованием генетически закодирована реагентов 11,12.
В то время как одна отслеживания организма является мощным методом для количественной оценки поведения существуют некоторые ограничения на технику. Первый заключается в том, что система отслеживает только одноклеточные организмы одновременно. В сравнении с фиксированным трекеры камеры, которые способны отслеживать несколько организмов 9,10, пропускная способность нашего трекера является низким. Тем не менее, мы можем измерить поведение единый организм гораздо дольше времени, чем несколько червей трекеры, которые важны для количественной долгое время масштабы поведения, такие как голод, откладки яиц и кормления. Также трекер требует образы, которые четко определить червя от фона. Это не позволяет нам изучения червя движения в условиях, которые визуально загроможденным или иным слишком сложным для системы обработки изображения, чтобы отфильтровать червя.
Эта система является гибкой и может быть использована для других видов поведениюустной слежения. Вместо однородной среде, червь могут быть отслежены в то время как представлено пространственное и временное сенсорной информации, как и другие системы слежения. Например, тепловые стимулы могут быть применены с помощью лазера стимул 7,14, или химическая информация может быть применен через пространственные градиенты через агар 3. Система в целом является гибким в дизайне и может быть использован с другими системами сканирования, такие как личинки дрозофилы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
- de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
- Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028 (2008).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914 (2010).
- Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115 (2004).
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
- Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
- Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).
