Summary
Hemos desarrollado un sistema de seguimiento de vídeo de tasa microscopio que puede registrar y cuantificar
Abstract
Hemos desarrollado técnicas de instrumentación, procesamiento de imágenes, y los datos de análisis para cuantificar el comportamiento locomotor de C. elegans como se arrastra sobre la superficie de una placa de agar. Para el estudio de la base genética, bioquímica, y neuronal de la conducta, C. elegans es un organismo ideal, ya que es genéticamente tratable, susceptible de microscopía, y muestra una serie de comportamientos complejos, incluidos los taxis, el aprendizaje y la interacción social 1,2. El análisis del comportamiento basado en el seguimiento de los movimientos de los gusanos que se arrastran sobre placas de agar han sido particularmente útiles en el estudio del comportamiento sensorial 3, 4 locomoción, y fenotipificación generales mutacional 5. Nuestro sistema funciona moviendo el sistema de cámara e iluminación como los gusanos se arrastra en una placa de agar estacionaria, que asegura que no se estímulo mecánico se transmite al gusano. Nuestro sistema de seguimiento es fácil de usar e incluye una función de calibración semi-automática. Un challenge de todos los sistemas de vídeo de seguimiento es que genera una enorme cantidad de datos que es intrínsecamente alta dimensional. Nuestro procesamiento de imágenes y programas de análisis de datos de resolver este problema mediante la reducción de la forma de gusanos en un conjunto de componentes independientes, que comprensiblemente reconstruir el comportamiento gusanos como una función de solamente dimensiones 3-4 6,7. Como un ejemplo del proceso se muestra que el gusano entra y sale de su estado de revocación de una manera específica de fase.
Protocol
1. Descripción de Microscopio de seguimiento
- Una placa de agar es iluminado por una fuente de luz de fibra y con imágenes de una cámara. Este sistema está montado en una X, Y etapa de traducción.
- La etapa se desplaza por estándar de motores paso a paso, que están conectados a un controlador de motor paso a paso.
- El controlador y la cámara están conectados al ordenador y controlados por programas personalizados escritos en LabVIEW.
- La cámara de las imágenes de la superficie de una placa de agar e identifica objetos oscuros sobre un fondo claro.
- La calidad de la imagen se ajusta de modo que el programa de ordenador puede cuantificar objetos en tiempo real. La ganancia, el brillo y la velocidad del obturador de la cámara se puede ajustar para proporcionar un objeto oscuro sobre un fondo blanco.
- Una marca de calibración para la calibración automática se realiza por meter la superficie de agar con un pico gusano.
- La imagen filtrada, binario que es utilizado por el programa de seguimiento puede ser comprobado.
- El modoftware tiene una función de auto-calibración que calcula la matriz de calibración moviendo un objeto de prueba a una distancia fija.
- Las distancias en píxeles está calibrado a los pasos dados por el motor paso a paso por la matriz de calibración.
- Después de la calibración, el sistema está listo para funcionar y no es necesario volver a calibrar a menos que el aumento se cambia o si la cámara está reposicionado.
2. Preparación de las placas de Seguimiento y C. elegans para el rastreo
- Un anillo de cobre se usa para acorralar los gusanos y evitar que la migración hasta el borde de la placa. El cobre proporciona una barrera química local, y no afecta el movimiento del gusano de otro modo para la duración del experimento (<1 h). Calentar el anillo primero colocándolo en un bloque de calor o equivalente.
- Colocar el anillo sobre una placa de agar fresco (1,7% de agar Bacto, 0,25% de Bacto-peptona, 0,3% de NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM de tampón de fosfato de potasio, 5 g / mlcolesterol) y presione ligeramente para incrustarlo en la superficie del agar.
- Elige L4 etapa o gusanos adultos jóvenes en una placa de agar lleno de algún buffer de NGM (0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM tampón fosfato de potasio) para lavarlos de residuos de comida. Deje que los gusanos nadar durante unos minutos.
- Cuidadosamente coloque un solo gusano sobre la placa de seguimiento de cerca del centro del anillo. Y a continuación, coloque la placa sobre el seguimiento de gusano.
3. Gusano de seguimiento
- Ejecute el programa LabVIEW y seleccione las opciones si es necesario (la ubicación de las imágenes, los tipos de imágenes, mediciones, ajustes de la cámara).
- Uso de la palanca de mando mover el microscopio hasta que una imagen de el gusano está en el campo de visión (pantalla de ordenador). Pulse el botón "pista" para activar el programa de seguimiento.
- El programa de ordenador en realidad mide los movimientos de un imágenes binarias filtradas tal como se muestra y puede hacer mediciones en esta imagen en tiempo real
- En popaer el seguimiento de una reconstrucción de la trayectoria global puede hacerse a partir de los movimientos de motor paso a paso, mientras que los cambios en la forma locales del gusano se puede ver en detalle.
4. Análisis de Datos
- Ejecutar script skeletonizing (MATLAB) para parametrizar las formas del gusano. (Figura 2)
- Cálculo de los modos propios de los datos esqueletizados. (Figura 3,4)
- Mostrar la Figura 5. Lea leyenda de la figura o resultados representativos.
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Representative Results
Ejemplo: Al forrajear, C. elegans transiciones de marcha adelante a marcha atrás, a menudo realizando una reorientación (giro omega) antes de volver al estado de movimiento hacia adelante. La cuantificación de esta transición es importante para entender los patrones de alimentación de los movimientos y también en el control motor del gusano. El poder para revelar los detalles sutiles de comportamiento locomoción puede ser visto usando nuestro dispositivo rastreador.
Como ejemplo, podemos ver el sentido de la marcha y marcha atrás que transmita la transición mediante la captura de imágenes de alta resolución de gusanos que se arrastran libremente en la placa de agar de ~ 30 min. se ejecuta. El análisis de modo propio (Figura 3) nos permite medir la fase de los movimientos ondulatorios del gusano. La medida de fase, a su vez, nos permite calcular la velocidad del tornillo sin fin y el sentido de la marcha de transición (Figura 4). Al representar la probabilidad conjunta de velocidad del gusano y fase, podemos ver que el transition entre avance y retroceso suceder probabilísticamente con una fase preferencial (Figura 5a). Si separamos adelante a marcha atrás y marcha atrás que transmita transiciones y mirar la probabilidad condicional de la fase del gusano cuando entra y sale de un evento de inversión, vemos que tienen distintas distribuciones de fase (Figura 5b, c).
Figura 1. Seguimiento de microscopio. La muestra de un gusano que se arrastra sobre una placa de agar permanece estacionario mientras que el sistema de formación de imágenes se mueve para mantener el gusano en el centro de la vista. El sistema de formación de imágenes se basa en una etapa de traslación 2D impulsada por motores paso a paso (3). Una cámara CCD (Basler A601f) y lente de 25 mm (distancia focal) imágenes del gusano de abajo (1) y una luz de fibra óptica (Edmunds, modelo) se ilumina desde arriba (2). Un casero motor paso a paso controlador más simple utilizando unep tarjeta controladora (SimpleStep; SSXYZ) controla el movimiento del sistema de formación de imágenes. Un programa personalizado LabVIEW (National Instruments, Austin, TX, EE.UU.) adquiere y procesa las imágenes de los gusanos, al mismo tiempo que la comunicación con el controlador del motor para mantener el gusano en el centro del campo.
Figura 2. El procesamiento de imágenes. (A) Los gusanos se mueven modificando su curvatura en el tiempo y así que procesa las imágenes de gusanos mediante la parametrización de su línea central. Las imágenes fueron hechas por thesholding binario la imagen en bruto en escala de grises (b), y gusanos individuales se identificaron mediante el filtrado de objetos por tamaño (c). La distancia entre el centro de la masa del tornillo sinfín y el centro de la imagen y se calculó entonces la etapa fue movido las distancias apropiadas para volver a centrar el documento WOrm. Estas distancias de corrección se utiliza para calcular la trayectoria del gusano. La curvatura del perímetro gusano se utilizó para identificar la cola (curvatura máxima) y la cabeza (máximo secundario). (D) Las imágenes fueron skeletonized entonces para localizar la línea central. (E) La curva resultante fue luego luego interpolado en 101 segmentos y el ángulo calculado entre segmentos se utiliza para parametrizar la curva. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Cálculo Eigenmode. Curvas Fundamentales de la forma del gusano han sido calculados utilizando análisis de componentes principales 5. Cada curva gusano está representada por una suma lineal de los vectores propios (o eigenworms), donde la amplitud de cada componente que se conoce como el modo propio (modo). Podemos cuantificar el comportamiento de la lombriz mediante la medición de los primeros 3 modos propios de la forma de gusano con el tiempo.
Figura 4. Fase y velocidad. (A) La distribución conjunta de los dos primeros modos para un ciclo límite. (B) La fase o posición en este ciclo límite se correlaciona con la fase de posición ondulatorio del gusano. (C) Utilizando la velocidad de fase de los gusanos hacia adelante y hacia atrás los movimientos se pueden cuantificar. (D) La velocidad y la dirección a lo largo de estos ciclos límite indica la velocidad del gusano. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Figura 5. Conmutación de fase dependiente de la velocidad. Las transiciones entre los estados de avance y retroceso no ocurren aleatoriamente a lo largo del ciclo oscilatorio. Ellos (pero todavía estocásticamente) ocurren en fases específicas. (A) La distribución conjunta de la velocidad de fase y la velocidad indica claramente que los gusanos salir y entrar en el estado de avance preferentemente en fases específicas. (B) muestra un gráfico de la fase de condición de la entrada a un evento de reversión. (C) muestra la fase condicionado a la salida de un evento de reversión. La línea de negro es la distribución de los ángulos de fase sin aire en una salida o entrada.
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Discussion
El estudio de la locomoción y el comportamiento natural requiere técnicas no invasivas de seguimiento en pareja con las técnicas de reducción de datos. Aquí hemos demostrado un fácil utilizar el sistema de rastreo que registra imágenes detalladas de C. elegans comportamiento, ya que se arrastra sobre la superficie de una placa de agar. La cantidad de información contenida en estas imágenes es muy amplio y alto-dimensional, por lo que también han desarrollado métodos para reducir la dimensionalidad de los datos en sólo cuatro medidas fundamentales. Estas medidas son integrales y son fáciles de interpretar con respecto al comportamiento de estos animales. Para este trabajo se muestra que la transición entre los gusanos hacia adelante y hacia atrás indica preferentemente en diferentes puntos de su ciclo ondulatorio, una medida que es difícil de hacer a ojo. Este trabajo es complementario a los sistemas de seguimiento que se han desarrollado para medir el comportamiento de los gusanos a un menor aumento 8,9,10, y también a los sistemas que son capaces de medir o modular neuronal actividad usando reactivos codificados genéticamente 11,12.
Si bien el seguimiento solo organismo es un poderoso método para la cuantificación de la conducta que hay algunas limitaciones a la técnica. El primero es el hecho de que el sistema rastrea sólo los organismos individuales a la vez. En comparación con los rastreadores de cámaras fijas que son capaces de realizar un seguimiento de múltiples organismos 9,10, el rendimiento de nuestro rastreador es baja. Sin embargo, somos capaces de medir el comportamiento de solo organismo durante períodos mucho más largos de tiempo que los seguidores del gusano múltiples, lo cual es importante para cuantificar la escala de tiempo largos comportamientos tales como el hambre, la puesta de huevos y la búsqueda de alimento. También el rastreador requiere que las imágenes que identifican claramente el gusano desde el fondo. Esto nos impide estudiar los movimientos del gusano en ambientes que son visualmente desordenado o de otra manera demasiado complejo para el sistema de procesamiento de imágenes para filtrar el gusano.
Este sistema es flexible y puede ser utilizado para otros tipos de behaviseguimiento oral. En lugar de un entorno homogéneo, el gusano pueden ser rastreados mientras presentado a la información sensorial espacial y temporal, similar a otros sistemas de seguimiento. Por ejemplo, un estímulo térmico se puede aplicar a través de láser estímulo 7,14, o información química se puede aplicar a través de gradientes espaciales a través del agar 3. El sistema en su conjunto es flexible en diseño y se puede utilizar con sistemas de rastreo tales como larvas de Drosophila.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
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