Summary
La combinación de generación monodispersas gota con ordenamiento inercial de células y partículas, se describe un método para encapsular un número deseado de células o partículas en una sola gota a tasas kHz. Se demuestra la eficiencia de dos veces superiores a las de la encapsulación no ordenada de las gotas de una y dos partículas.
Protocol
Los protocolos de esta sección describen los materiales y equipos utilizados específicamente para obtener los resultados experimentales presentados. Tenga en cuenta que los proveedores alternativos para los productos químicos y equipos pueden ser utilizados.
1. Fabricación de los dispositivos y la litografía blanda
Las técnicas estándar de la litografía blanda, 21 algunos de los cuales se han presentado en los artículos anteriores JOVE, 22 se utilizaron para la creación de polidimetilsiloxano (PDMS) las redes de microcanales adheridos a sustratos de vidrio. Aparte de fabricación del molde maestro réplica por SU-8 fotolitografía, los procesos pueden llevarse a cabo fuera de una sala limpia o campana limpia, sin embargo, el polvo y las partículas aún debe ser minimizada para lograr resultados consistentes.
- Diseño de un patrón de micro-canal como se muestra en la Figura 1 en AutoCAD (Autodesk Inc.). Emplear a un fabricante de terceros (Fineline Imaging Inc.) para imprimir una alta resolución (50.000 ppp) transtransparencia en la máscara de la película de Mylar o de cuarzo, donde los canales son transparentes sobre un fondo oscuro.
- Crear un silicio y SU-8 amo fotosensible para el moldeo de réplica. Brevemente, girar SU-8 2050 (MicroChem) fotorresistencia negativa con rpm recomendado por el fabricante en un spin-revestidor para crear una capa de 52 micras de espesor sobre una superficie limpia de 7,5 cm o 10 cm de obleas de silicio. Después de hornear suave, con el borde la eliminación de cuentas, los rayos UV a través de una máscara de contacto, al horno después de la exposición, desarrollo y exposición a inundaciones, medir el espesor real de la capa de SU-8 mediante un perfilómetro Dektak (Veeco). Cinta del molde maestro en el fondo de un 4 "o 5" placa de Petri para preparar PDMS moldeo réplica.
- Mezcla PDMS base de elastómero con el agente de curado elastómero (Dow Corning) en una relación 10:1 w / w de base para el agente de curado. Verter bien mezclada precursor de PDMS en el patrón de silicio para crear una capa de 2-3 mm de espesor final. Una mezcla de 20 g de base de elastómero con 2 g de agente de curado es suficiente para cubrir un 4 "superficie diámetro.
- Coloque el master molde y PDMS en el desecador de vacío (Jencons) para des-gas no curado PDMS. El uso de un regulador de presión (Cole Parmer), lentamente disminuir la presión manométrica de 0 cámara "de Hg a -27" Hg durante 20 minutos para evitar la excesiva formación de espuma. Deje el dispositivo en la cámara de vacío a -27 "Hg durante 30 minutos o hasta que las burbujas de aire desaparezcan.
- De liberación de vacío y mover el molde maestro y PDMS a un horno de 65 ° C (Thermo Scientific) durante un mínimo de cuatro horas. El dispositivo se puede dejar en el horno durante la noche para mejorar el curado.
- Retire el dispositivo del horno y dejar enfriar. Corte cuidadosamente alrededor de la oblea PDMS circular usando un cuchillo de precisión y la cáscara de PDMS. Cortar contorno dispositivo como se muestra en la Figura 1 con un escalpelo.
- Ponche de fluidos puertos (tres por equipo) en las tres regiones circunvecinas se muestra en la Figura 1 con una biopsia por punción. Para este dispositivo, use un 0,75 mm de diámetro exterior de golpe (Harris).
- Adherirse cinta adhesiva al lado del patrón y la cáscara de PDMS para eliminar cualquierpolvo. Como una alternativa de ahorro de costes, pero viable a los convencionales aparatos de plasma de oxígeno, 21,22 de plasma tratar el lado estampado de la PDMS y una limpieza de 3 "x 1" portaobjetos de vidrio con un manual de laboratorio Tratamiento de corona (Electro-Técnica Products Inc .) 23. Tenga en cuenta que este dispositivo se debe utilizar en una campana de humos o área bien ventilada, debido a la descarga de ozono, y todos los relojes y teléfonos celulares se deben mantener por lo menos diez pies de distancia. Ajustar la descarga en corona para alcanzar una corona estable con un mínimo de chispas. Poco a poco agitar el electrodo aproximadamente 1/4 "por encima de la superficie de cada unos 20 segundos y luego poner inmediatamente las superficies tratadas en contacto para formar una fuerte unión permanente antes de que las superficies de PDMS volver a su estado natal.
- Coloque el aparato sobre una placa de metal, colocar en un horno frío, ponga el horno a 120 ° C y hornear durante toda la noche para completar la unión y para devolver el PDMS a su estado hidrofóbico original. 24 Durante este horno de alta temperatura, tque la superficie de vidrio del canal también se representará hidrófobo debido a la deposición de una capa hidrófoba delgada sobre el vidrio. Alternativamente, los recubrimientos hidrófobos tales como Aquapel (PPG Industries) puede ser inyectado en los puertos de fluidos utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de la jeringa. 12 cuidadosamente pero con firmeza inyectar el Aquapel seguido de purga de aire en los puertos de fluidos sin romper el vidrio a PDMS enlace . Agresivamente repetir la purga de aire en todos los puertos de entrada y salida, mientras limpiando cualquier exceso Aquapel con el fin de evitar los depósitos que pueden obstruir los canales durante el secado.
2. Preparación de la muestra
- Preparar un cultivo de células de acuerdo a los procedimientos establecidos para el tipo celular elegido. Para el dispositivo particular usado en este estudio, 8-15 micras partículas o células adecuadamente debe ordenar para la encapsulación. Más pequeñas o más grandes tipos de células pueden requerir cambiar las dimensiones del canal de enfoque para lograr p Re adecuada. Para el meresultados thod demostración se muestra en este trabajo, el 9,9 micras microesferas de poliestireno (G1000, Thermo Scientific) se utilizan como sustitutos de células.
- Preparar la partícula acuosa o suspensión de células a través de la mezcla suave. Cuando se usan células o partículas de poliestireno, el control de la concentración es esencial (véase Figura 4) para alcanzar la encapsulación ideales ordenado. Utilizando los datos anteriores 12 como una guía, calcular la celda deseada o la concentración de partículas basado en el espaciamiento tren ordenado y micro-canal tamaño como: una célula o partícula por esperados veces longitudinales del tren de espaciamiento del canal centrado en sección transversal de la zona. Si la concentración de valores (1% w / w) es insuficiente, aumentar la concentración (en este caso a 1,5% w / w) por centrifugación suavemente la muestra de stock, la eliminación de líquido sobrenadante, y re-suspensión de las partículas por un mezclador vortex, o más suave mezclado utilizando células. Preparar un volumen adecuado para tener en cuenta el volumen deseado y recogida por el tiempo de ejecución asociado con flujo de sintonía.
- Tanto las células y partículas de poliestireno tienen un peso específico mayor que uno. Aunque no se ha demostrado en este protocolo, para experimentos a largo plazo con una duración del orden de varios minutos a horas, la flotabilidad que coincida con la solución mediante la adición de un soluto, como CaCl 2 para partículas o OptiPrep (Sigma-Aldrich) para las células.
- Preparar una muestra de 10 ml de la fase continua de aceite de hidrocarburo fluorado mezclando el aceite fluorocarbonado FC-40 (3M) y PFPE-PEG bloque copolímero tensioactivo 25 (2,5% w / w) (RainDance Technologies) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Alternativamente, el aceite mineral ligero (Productos químicos de proceso PTI) puede ser utilizado con ABIL-EM 90 tensioactivo (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).
3. Montaje experimental
- Encienda el microscopio invertido óptica (Axio Observer, Zeiss) y cámara de alta velocidad (Phantom V310, Visión de Investigación). Enfoque e inspeccionar las canales de los zuecos y los desechos, ya sea moviendo manualmente el dispositivo omediante el uso de una platina del microscopio motorizado. Algunos residuos de pequeño tamaño pueden ser empujados a cabo cuando el líquido fluye a través de. Para residuos de gran tamaño u obstrucciones evidentes, seleccione otro canal en el dispositivo como los desechos en el canal centrado puede degradar significativamente la calidad de pedido. Tenga en cuenta que obstruye a menudo puede ser removido en virtud de flujo, presionando firmemente sobre la superficie de PDMS sobre la región afectada con unas pinzas romas.
- Corte tres trozos de tubo de PVC (0,01 "ID/0.03" de diámetro exterior, Tygon) para la entrada de la acuosa, de entrada y salida de aceite, emulsión. Para reducir al mínimo el volumen muerto, cortado lo suficiente como para llegar a la tubería de las bombas de jeringa de la platina del microscopio. Corte los extremos de tubería en un ángulo de 45 ° para facilitar la inserción en los puertos de fluidos.
- Utilice pinzas para presionar encajar el tubo termina en los puertos de fluidos perforados en el paso 1 y luego presione encajar dos de calibre 30 de acero inoxidable con puntas romas agujas de jeringas de acero (SmallParts) en los extremos libres de la fase acuosa respectivo y tubos de entrada de aceite (sin adhesivo es necesario) . Coloque el tubo de salida en una r de residuoseservoir. Este tubo más tarde se trasladó a un depósito de recogida.
- Mueva el dispositivo y el tubo conectado a la platina del microscopio, alinear, y se centran en la boquilla del dispositivo, utilizando un objetivo disponible (20x fue utilizado para este experimento). Ajustar para obtener el K hler iluminación y otros ajustes del microscopio como se requiere para una grabación óptima.
- Llenar una jeringa de 1 ml (BD) con la fase acuosa bien mezclada y una jeringa de 3 ml (BD) con la solución de la fase aceite preparado en el Paso 2. Tenga en cuenta que las jeringas de un determinado volumen puede ser utilizada y debe ser cuidadosamente seleccionados en función de los tiempos de ejecución deseados y la minimización de cualquier pulsatilidad. Incline una jeringa vertical y con un tirón para mover las burbujas de aire a la salida de la jeringa. Lentamente presione el émbolo lo suficiente como para empujar el aire hacia la punta de la jeringa. Sosteniendo la jeringa vertical, conectar las jeringas a la aguja de la jeringa respectiva ya conectada al dispositivo en el Paso 3,3. Presione el émbolo para forzar el aire a través de la aguja de la jeringa el volumen muerto hasta que el líquido es pushed a través del tubo casi al dispositivo. Monte firmemente la jeringa en una bomba de jeringa (Nexus 3000, Chemyx) y activar el bloqueo del émbolo. Repita las conexiones para la segunda jeringa y montar a una bomba de segunda jeringa.
- Potencia en cada bomba de jeringa y el programa utilizando los protocolos del fabricante de la bomba. Establecer los caudales iniciales a Q aceite = 50 l / min y aq Q = 5 l / min para la fase oleosa y fase acuosa, respectivamente. Inicio de las bombas.
- Espere a que cada fluido para entrar en el dispositivo y llenar los canales, empujando hacia fuera el aire que queda muerta. Esto puede tardar varios minutos. Si hay una gran cantidad de aire en la tubería de entrada, aumentar temporalmente cada velocidad de flujo hasta que el aire es expulsado. No aumentar las tasas de flujo tan altas que se producen grandes presiones en el canal, que podría dar lugar a fallo de la unión de PDMS-a-vidrio.
- Uso de los caudales iniciales, se observa la formación de gotas en la boquilla (los resultados se muestra aquí: 20x magnification, 21005 fps velocidad de fotogramas, la exposición a 3 ms). Reducir el campo de vista de la cámara sólo la boquilla para maximizar la velocidad de cuadro y reducir los requisitos de memoria, si es posible. Captura de vídeos de muestra y confirmar que la tasa de muestreo es el adecuado para evitar el aliasing.
- Para evitar la inyección (ver Figura 2), comience con las bajas tasas de flujo acuoso. Lentamente aumentar la velocidad de flujo acuoso para observar ordenamiento de partículas en el canal de solución acuosa largo medida que aumenta la velocidad de flujo.
- Si la concentración de partículas es demasiado baja para proporcionar trenes con relativamente pocas "falta" partículas y la muestra no fue acompañado de flotabilidad, físicamente inclinar la bomba de jeringa hacia la salida de la jeringa para proporcionar gradual sedimentación de partículas hacia la salida de la jeringa. Este método se muestra en el protocolo de vídeo. Periódicamente girar la jeringa a lo largo de su eje también puede reducir sedimentación no deseado.
- Una vez que se produce ordenamiento adecuado, regular el caudal de aceite para sintonizar la frecuencia de generación ytamaño de las gotas. El volumen de la gota media puede calcularse utilizando la tasa de flujo acuoso dividida por la frecuencia de generación gota, medida por la captura de vídeo. Iterativamente ajustar tanto las tasas de flujo para lograr las tasas deseadas de encapsulación y el volumen de la gota.
- Encapsulación ordenado Una vez estable se confirma, mover el tubo de salida desde el depósito de residuos en un depósito de recogida o alimentar en otro dispositivo para pruebas posteriores.
- Determinar el tiempo de recogida basada en el número deseado de gotas y la frecuencia de generación calculado.
- Anotar la fracción de gotas que contienen 0, 1, 2, ..., N partículas para cuantificar la eficiencia utilizando ya sea gota video resultados generación o pipeteando una muestra de emulsión recogieron para su inspección.
4. Los resultados representativos
Los resultados se presentan que lograr tanto una partícula controlado y controlado doble partícula encapsulación (Figura 3). Al reducirla velocidad de flujo del FC-40 aceite en un medio, de una sola partícula de encapsulación se convierte en dos partículas de encapsulación. Por el contrario, se podría haber aumentado la velocidad de flujo acuoso para suministrar partículas a la boquilla de forma más rápida, pero también nos han aumentado el riesgo de inyección de la corriente acuosa. Los histogramas en la Figura 3 se presenta el número fraccionario de partículas por caída de los dos casos, junto con las comparaciones con las estadísticas de Poisson. Las gotas ocasionales con partículas de cero se deben principalmente a "desaparecido" las partículas en los trenes solicitados, mientras que los casos en que hay más partículas encapsuladas que resultado deseado de locales altas concentraciones de partículas y las partículas que a veces emigran hacia una de las dos posiciones verticales de enfoque. Tenga en cuenta que la flotabilidad juego tal como se describe en la Sección 2 no se utilizó. En su lugar, la bomba de jeringa se inclina físicamente para permitir la sedimentación de partículas hacia la salida de la jeringa, que conduce a una alta concentración de partículas durante la carrera.
Figura 1. Dispositivo de encapsulación. a) En general el dispositivo con las entradas, salida y el canal de largo el pedido. La altura del dispositivo es de 52 micras y el ancho del canal de pedido es de 27 micras. b) Tanto acuosa y entradas de petróleo tienen filtros grandes escombros con huecos en el orden de la anchura del canal de pedido para la vista ampliada de la entrada de aceite. c) La vista ampliada de la boquilla muestra la misma anchura de canal de 27 m para los canales acuosos y aceite, seguido por la contracción de la boquilla de 22 micras y la expansión súbita a un canal más ancho 61 micras.Tenga en cuenta que las dimensiones del dispositivo que se muestran aquí han sido verificadas mediante un perfilómetro después de la microfabricación y difieren ligeramente de las dimensiones nominales de la máscara. Una verdadera imagen del canal de pedidos y la boquilla están disponibles en línea, como la figura de consulta 1 . El archivo de máscara de AutoCAD también ha sido incluido en línea como un suplemento a este manuscrito.
Figura 2. Histéresis de un goteo de transición chorro usando un dispositivo más amplio (80 micras de ancho x 22 m de altura). a) A velocidad constante FC-40 de flujo (Q aceite = 45 l / min), la formación de descenso constante se produce a 10 kHz utilizando una solución acuosa de caudal Q aq = 8 l / min. A medida que la tasa de flujo acuoso se incrementa lentamente a 10 y mu, l / min, chorro de la corriente de fluido acuoso se dispara. b) Cuando el caudal es devuelto a 8 l / min chorro sigue. Tenga en cuenta que la formación de gotas constante puede ser re-establecido por la breve pausa de la bomba de flujo acuoso (una pausa de 1 segundo es típico).
Figura 3. Encapsulación individual o doble-partícula. Una formación de gotas) con una célula por gota (Q aceite = 60 l / min, Q aq = 9 l / min) con una tasa de generación de gota de 6,1 kHz, el tamaño promedio de gota 24.4 PL, y una eficiencia de captura de una sola célula D k = 79,5% y K p = 83,7% (λ = 0,95) para un tamaño de muestra de n = 517 gotas d y n p = 491 partículas. b) la formación de gotas con dos celdas por gota se consigue simplemente mediante la reducción de la FC-40 caudal Q de aceite a 30 μL / min. Los más grandes (39,8 pL) gotas se forman a un ritmo de 3,8 kHz con una eficiencia de captura de dos células D k = 71,5% y P = k el 79,5% (λ = 1,80) para un tamaño de muestra de n d = 383 gotas y n p = 689 partículas. cd) Dos histogramas de comparar la eficiencia de encapsulación de partículas gota D k de la encapsulación ordenó una y dos partículas con las estadísticas de Poisson (encapsulado al azar). Nótese que en ambos casos, el espaciamiento de las partículas en la dirección del flujo es de aproximadamente 17-18 micras para totalmente ordenadas, partículas que se alternan. Vídeos complementarios que muestran tanto la encapsulación de uno y dos partículas están disponibles en línea. Haga clic aquí para ver la 3a suplementarios Película . Haga clic aquí para ver la película 3b suplementarios .
Concentración Figura 4. Afecta grandemente la eficiencia de encapsulación. A) A medida que disminuye la concentración, el ordenamiento completo no se produce, y así "agujeros" en los trenes de emerger, dejando unas gotas con menos de partículas previstos. B) El histograma muestra la disminución de la eficiencia ( D k = 55,9%, p k = 70,9%) para la encapsulación de dos partículas debido a un menor valor de λ = 1,57 donde hay casi la misma cantidad de una sola partícula cae a medida que hay doble de partículas gotas. Esta cifra es el resultado de aceite Q = 30 l / min y aq Q = 9 l / min, las condiciones de flujo mismas para la Figura 3b. Un video suplementario representante está disponible en línea. Haga clic aquí para ver la película de consulta 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A pesar de grados relativamente altos de pedidos, no todas las gotas contendrá el número apropiado de partículas o células. Eficiencia de encapsulación puede ser calculada como el número de células o partículas que quedan encapsulados en gotas con la ocupación deseado dividido por su número total. Estos datos en bruto se puede obtener ya sea desde un sistema automatizado de algoritmo de video de alta velocidad o de imágenes de una muestra de emulsión de recogida. Esto puede ser comparado con la fracción de partículas P k encapsulado en una gota que contiene partículas de k, y la fracción de gotas D k que contienen partículas de k. De la Figura 3, ambos eficiencias de partículas los individuales y dobles de encapsulación superar eficiencias de encapsulación al azar por más de un factor de dos y reducir considerablemente el número de gotas con más que el número deseado de partículas Figura 4 demuestra la necesidad de concentraciones adecuadas para una alta eficiencia.; es decir, y lambd un;, una función de la concentración de partículas tanto y volumen de la gota, debe ser igual o cercana a la cantidad de células deseadas por gota para maximizar partículas correctamente encapsulados o células. Tenga en cuenta que una mayor concentración de partículas o células suele ser una buena cosa para la ordenación completa de los trenes densas tienden a extenderse en el tiempo y llenar las regiones vacías entre los trenes. Por otro lado, si la concentración es demasiado alta, el elevado número de partículas puede provocar inestabilidades interfaciales que inducen chorro en la boquilla. En estudios específicos (por ejemplo, una sola célula de encapsulación, por ejemplo), puede ser más ventajoso para evitar múltiples gotitas de células a expensas de la introducción de unas cuantas gotas más vacíos, por lo que un λ ligeramente inferior se desea. Esto también sería aplicable para estudios dirigidos a las interacciones entre dos células o entre una célula y una partícula, donde las gotas de una sola partícula o célula única-son más tolerable que las gotitas con dos o más de un tipo de célula o de partículas.
jove_content "> Mantener un λ constante en el tiempo es crítico para la encapsulación consistente. asistencias flotabilidad coincidentes en el control de la concentración a largo plazo mediante la reducción de la sedimentación de las células y partículas en la jeringa y el tubo. Sin embargo, la flotabilidad coincidente también resultados en una mayor viscosidad acuosa que puede retrasar pedido (que resulta en más centrado requisitos de canal), aumentar la caída de presión del canal, y cambiar las velocidades de flujo requeridas para la generación de gota. Una alternativa a la flotabilidad juego el utilizado en este experimento es inclinar físicamente la bomba de jeringa de modo que la salida de la jeringa se señaló casi verticalmente hacia abajo (para minimizar la adherencia de las células o partículas al interior jeringa). Aquí, se utilizó 9,9 micras de diámetro microesferas con una fracción de volumen de partículas de 1,3% (aproximadamente 25 millones de partículas por ml), pero se utilizó para aumentar la inclinación fracciones de volumen a 2% para los datos mostrados en la Figura 3. Una segunda alternativa consiste en mezclar el fluido acuoso intermittpreservativos con un cerrado apoyo bola de acero inoxidable (de teflón recubierto para trabajar con las células) con un imán externo pequeño. Es necesario tener cuidado sin embargo de evitar que el cojinete de bolas se depositan en la punta de la jeringa en las que puede ocluir la entrada de la tubería de entrada. Sin embargo, estas alternativas son más mano de obra y menos repetible de coincidencia de flotabilidad, de modo coincidente flotabilidad es más adecuado para los experimentos de mayor escala que ocurren durante largos plazos. Mientras ordenamiento inercial requiere Re alta y Re p para operar, cuando el humor acuoso y los flujos de petróleo son empujados más y más alto, constante goteo de gotas se convierte en chorro 14 (ver Figura 2) y los resultados no controlados de encapsulación. Para las células más pequeñas que las partículas de 10 micras utilizados aquí, las pequeñas dimensiones del canal puede ser necesaria para lograr p Re suficiente si las velocidades de flujo no se puede aumentar sin inyección. Una peculiaridad de volar en los sistemas de microfluidos es que los efectos de histéresis puede ocurrir which hacen que sea difícil para detener chorro, simplemente reduciendo la velocidad de flujo acuoso una vez que se produce de nuevo a un punto donde no se observó. Con base en los resultados experimentales, se podría desarrollar un goteo de dimensiones o no dimensional a chorro mapa de flujo, como los desarrollados anteriormente para la co-axiales flujo boquillas 14 y T-26-28 cruces con los contornos adicionales para la tasa de abandono de generación, las células por la gota, y encapsulación eficiencia. Este mapa sería una hoja de ruta sólida desde la que puede ser la tasa de generación de caída prevista para el cálculo de λ y por lo tanto proporcionar un caudal estimado de las corrientes de agua y el aceite de a priori.Aunque no directamente demostrado aquí, las reducciones adicionales en el flujo de aceite tipo Q desde los que se presentan en la Figura 3b aumentaría aún más el número de partículas por gota a tres, cuatro, y así sucesivamente. Para lograr más partículas por caída, ya sea aceite de Q debe disminuir o AQU laEOU caudal Q aq debe aumentar. Como acotación al margen, hemos incluido una línea suplementaria secuencia de comandos de MATLAB que modela la eficiencia de encapsulación de la captura de cualquier número de partículas en forma de gotas. El usuario introduce el espaciamiento medio de las partículas y una desviación estándar de separación de partículas, que modela el grado de orden. Para los trenes solicitados, la desviación estándar será pequeño. Además, el usuario introduce el tamaño de gota promedio y desviación estándar de tamaño de gota, que representa la polidispersidad de tamaños de gota. Consulte la documentación de los scripts para obtener información adicional.
Al aumentar la velocidad de flujo acuoso o disminuyendo el caudal de aceite para aumentar el número de partículas o células por gota, el riesgo de inestabilidad de los aumentos de chorro como los caudales respectivos cerca de los valores extremos. Así, el número máximo de partículas o células viables por gotadependerá de la geometría del dispositivo y las propiedades del fluido. Dada la concentración de partículas / célula y la tasa de flujo de aceite, el número de partículas o células por gota está limitado por los límites superiores sobre las tasas de flujo acuoso, que deben ser lo suficientemente grande como para inducir pedido pero debe ser lo suficientemente pequeño para evitar inestable chorro (y cizallamiento límite tensiones sobre las células para asegurar la viabilidad). Alternativamente, dado un caudal acuoso en el que se produce ordenamiento, la tasa de flujo de aceite debe permanecer lo suficientemente grande como para permanecer en el régimen de goteo.
Nótese que la generación de gota y el goteo a chorro de transición son muy sensibles a la concentración de tensioactivo. Las altas concentraciones de surfactante aumentar la viscosidad del aceite, cambiando los parámetros de generación de la gota. Como acotación al margen, la escasez de tensioactivos biocompatibles ampliamente disponibles para los aceites de hidrocarburos fluorados constituye un reto importante. En la actualidad, un proveedor comercial (RainDance Technologies) existe para PFPE-PEG tensoactivos de copolímero de bloque, 25, pero estudios demuestran pequeña escala técnicas de síntesis de un número de grupos tales como surfactantes PFPE-HEG. 29,30 alternativas tales como aceite mineral ligero se han utilizado en aplicaciones biológicas gota generación para acceder a una gama más amplia de tensioactivos disponibles, 24,31 pero tenga en cuenta que el consiguiente aumento de la viscosidad en comparación con el aceite de fluorocarbono altera los parámetros de generación de la gota. Una revisión reciente 32 describe un gran número de aceites publicados fase continua y tensioactivos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JE es un inventor de una patente en trámite sobre la base de la tecnología utilizada en este manuscrito.
Acknowledgments
Damos las gracias a RainDance Technologies para la muestra de PFPE-PEG surfactante utilizado en este estudio, y agradecemos al Centro de Recursos de BioMEMS (Mehmet Toner, director) para el molde de obleas de silicio para crear réplicas de los canales de PDMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD | AutoDesk | ||
| Transparency Mask | Fineline Imaging Inc. | ||
| SU-8 Photoresist | MicroChem Corp. | 2050 | |
| Dektak Profilometer | Veeco Instruments, Inc. | ||
| Petri Dish | BD Biosciences | 351058 | |
| PDMS Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Sylgard 184, Material Number (240)4019862 | |
| Vacuum Desiccator | Jencons | 250-030 | |
| Vacuum Pump | Alcatel Vacuum Technology | 2010 C2 | |
| Vacuum Regulator | Cole-Parmer | EW-00910-10 | |
| Oven | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Lindberg Blue M, OV800F | |
| Biopsy Punch, 0.75 mm | Harris | Uni-Core 15072 | |
| Laboratory Corona Treater | Electro-Technic Products Inc. | BD-20AC, SKU 12051A | |
| Glass Slides | Gold Seal | 3010 | |
| Aquapel | PPG Industries | Alternative Strategy | |
| Polystyrene Microspheres, 9.9 μm | Thermo Fisher Scientific, Inc. | G1000 | |
| OptiPrep | Sigma-Aldrich | D1556 | Not Demonstrated |
| Luer-Lok Syringes | BD Biosciences | 1 mL: 309628 3 mL: 309585 | |
| FC-40 Fluorocarbon Oil | 3M Inc. | Sigma Aldrich, F9755 | |
| PFPE-PEG Fluorosurfactant | RainDance Technologies | ||
| Light Mineral Oil | PTI Process Chemicals | 08042-47-5 | Alternative Strategy |
| Mineral Oil Surfactant | Evonik Goldschmidt Corporation | ABIL EM 90 | Alternative Strategy |
| Tygon PVC Tubing | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" | Small Parts, Inc. | NE-301PL-C | |
| Inverted Microscope | Carl Zeiss Imaging | Axio Observer.Z1 | |
| High Speed Camera | Vision Research | Phantom V310 | |
| Syringe Pumps (2) | Chemyx Inc. | Nexus 3000 | |
| Silicone Oil | Dow Corning | 200 fluid, 10 cSt | Optional for Emulsion Storage |
References
- Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
- Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
- Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
- Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. , 1218-1220 (2007).
- Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
- Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
- Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
- Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001 (2010).
- Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
- Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364 (2003).
- Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
- Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
- Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
- Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
- Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
- Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703 (2010).
- Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413 (2010).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319 (2007).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).
- Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
- Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
- Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
- Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).
- Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
- Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
- Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).
