Summary
Combinando goccia generazione monodisperse con ordinamento inerziale di cellule e particelle, si descrive un metodo per incapsulare un numero desiderato di celle o particelle in una singola goccia a tassi kHz. Abbiamo dimostrato efficienze due volte superiori a quelli di incapsulamento non ordinate per raccogliere le gocce singola e doppia-particelle.
Protocol
I protocolli in questa sezione descrivono i materiali e le attrezzature utilizzati specificamente per ottenere i risultati sperimentali presentati. Si noti che i fornitori alternativi per apparecchiature chimiche e possono essere utilizzati.
1. Dispositivo di Fabbricazione e litografia soft
Tecniche standard di litografia soft, 21 alcuni dei quali sono stati descritti in articoli precedenti Giove, 22 sono stati utilizzati per la creazione di polidimetilsilossano (PDMS) le reti microcanali legati ai substrati di vetro. Oltre fabbricazione maestro stampo replica di SU-8 fotolitografia, i processi possono essere effettuati all'esterno di una stanza pulita o cappa pulita, tuttavia, polvere e particelle dovrebbe ancora essere minimizzato per ottenere risultati coerenti.
- Progettare un micro-canale schema come mostrato in figura 1 in AutoCAD (AutoDesk Inc.). Impiegare un produttore di terze parti (Fineline Imaging Inc.) per stampare una risoluzione elevata (50.000 dpi) transmaschera di trasparenza su pellicola Mylar o quarzo dove i canali sono trasparenti su uno sfondo scuro.
- Creare un silicio e SU-8 master photoresist per lo stampaggio replica. In breve, girare SU-8 2050 (MicroChem) photoresist negativo con rpm consigliata dal costruttore su una spin-spalmatrice per creare uno strato spesso 52 micron su una superficie pulita 7,5 cm o 10 wafer di silicio cm. Dopo morbido cuocere, bordo la rimozione del tallone, l'esposizione ai raggi UV attraverso una maschera di contatto, post-esposizione cuocere, lo sviluppo e l'esposizione inondazioni, misurare lo spessore effettivo del SU-8 layer utilizzando un profilometro Dektak (Veeco). Nastro lo stampo principale sul fondo di un 4 "o 5" capsula Petri per preparare stampaggio PDMS replica.
- Mix PDMS base di elastomero con elastomero agente di indurimento (Dow Corning) in un rapporto di 10:1 w / w di base e catalizzatore. Versare ben miscelato precursore PDMS sul maestro silicio per creare uno strato di 2-3 mm di spessore finale. Una miscela di 20 g di base di elastomero con 2 g di agente di indurimento è sufficiente a coprire una 4 "superficie di diametro.
- Posizionare il master stampo PDMS e in essiccatore sotto vuoto (Jencons) di de-il gas non indurito PDMS. Utilizzando un regolatore di pressione (Cole Parmer), lentamente diminuire la pressione estensimetro camera da 0 "Hg a -27" Hg oltre 20 minuti per evitare eccessiva formazione di schiuma. Lasciare dispositivo in camera da vuoto a -27 "Hg per 30 minuti o fino a bolle d'aria scomparire.
- Rilascio del vuoto e spostare stampo master e PDMS ad un forno a 65 ° C (Thermo Scientific) per un minimo di quattro ore. Il dispositivo può essere lasciato nel forno durante la notte per migliorare la vulcanizzazione.
- Rimuovere il dispositivo dal forno e lasciare raffreddare. Tagliare con cautela PDMS intorno wafer circolare usando un coltello di precisione e la buccia fuori PDMS. Tagliare contorno dispositivo come mostrato in figura 1 con un bisturi.
- Punch porte fluidico (tre per dispositivo) nelle tre regioni rotonde mostrati in figura 1 con un punzone biopsia. Per questo dispositivo, utilizzare uno 0,75 millimetri di diametro esterno punzone (Harris).
- Aderire nastro adesivo sul lato modellato del PDMS e la buccia di cancellare qualunquepolvere. Come alternativa di risparmio di costi, ma praticabile per apparati convenzionali plasma di ossigeno, 21,22 plasma trattare il lato modellato del PDMS e un ambiente pulito 3 "x 1" vetrino per microscopio usando un portatile di laboratorio corona treater (Electro-Technic Products Inc .) 23. Si noti che questo dispositivo dovrebbe essere utilizzato in una cappa aspirante o zona ben ventilata causa dello scarico di ozono, e di tutti gli orologi e telefoni cellulari devono essere tenuti almeno dieci metri di distanza. Regolare la corona di raggiungere una corona stabile, con un minimo scintille. Lentamente sventolare l'elettrodo circa 1/4 "sopra ogni superficie per circa 20 secondi e poi subito a portare le superfici trattate in contatto in modo da formare un forte legame permanente prima che le superfici PDMS ritornano al loro stato nativo.
- Posizionare il dispositivo su una piastra metallica, posto in un forno freddo, impostare il forno a 120 ° C, e cuocere notte per completare legame e per riportare il PDMS al suo stato originale idrofobo. 24 Durante questa cottura ad alta temperatura, tegli superficie di vetro del canale anche essere reso idrofobo dovuta alla deposizione di uno strato idrofobo sottile sul vetro. In alternativa, rivestimenti idrofobi come AQUAPEL (PPG Industries) può essere iniettato nei porti fluidici utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da siringa. 12 cura ma fermamente iniettare il AQUAPEL seguita da spurgo dell'aria nei porti fluidici senza rompere il vetro di PDMS legame . Aggressivamente ripetere lo spurgo d'aria su tutte le porte di entrata e uscita, mentre pulendo l 'eventuale AQUAPEL eccesso al fine di evitare eventuali depositi che potrebbero ostruire i canali dopo l'essiccazione.
2. Preparazione del campione
- Preparare una coltura cellulare secondo le procedure stabilite per il vostro tipo di cellula scelto. Per il particolare dispositivo utilizzato in questo studio, 8-15 micron di particelle o cellule devono ordinare in modo adeguato per l'incapsulamento. Tipi di cellule più piccole o più grandi possono richiedere variando le dimensioni del canale di messa a fuoco per ottenere un'adeguata Re p. Per il merisultati dimostrazione THOD mostrato in questo articolo, 9,9 micron microsfere di polistirene (G1000, Thermo Scientific) sono utilizzati come surrogati delle cellule.
- Preparare la particella o sospensione acquosa delle cellule attraverso la miscelazione delicata. Quando si usano cellule o particelle di polistirene, di controllo della concentrazione è essenziale (vedi Figura 4) per ottenere ideale incapsulamento ordinato. Utilizzando i dati precedenti 12 come guida, calcolare la cella desiderata o concentrazione di particelle in base alla spaziatura treno ordinato e micro-canale formato come: una cella o particella per orari dei treni previsti longitudinali spaziatura tra la focalizzazione canale sezione trasversale. Se la concentrazione magazzino (1% w / w) è insufficiente, aumentare la concentrazione (qui al 1,5% w / w) delicatamente centrifugazione del campione archivio, rimuovere il liquido supernatante, e ri-sospensione le particelle di vortex, o miscelazione gentile quando si utilizzano celle. Preparare la quantità necessaria per tenere conto del volume di raccolta desiderato e per la fase di esecuzione associata a flOW tuning.
- Entrambe le cellule e particelle di polistirene avere un peso specifico maggiore di uno. Sebbene non mostrato in questo protocollo, per esperimenti a lungo termine di durata dell'ordine di parecchi minuti ad alcune ore, galleggiabilità corrispondere la soluzione aggiungendo un soluto come CaCl 2 per particelle o OptiPrep (Sigma-Aldrich) per le cellule.
- Preparare un campione di 10 ml della fase continua olio fluorocarbonio miscelando l'olio fluorocarburico FC-40 (3M) e PFPE-PEG blocco tensioattivo copolimero a 25 (2,5% w / w) (Raindance Technologies) in una provetta da centrifuga da 15 mL. In alternativa, l'olio minerale leggero (Chemicals processo PTI) può essere utilizzato con ABIL-EM 90 tensioattivo (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).
3. Setup sperimentale
- Accendere il microscopio ottico invertito (Axio Observer, Zeiss) e la macchina fotografica ad alta velocità (Phantom V310, Vision Research). Focus e ispezionare i canali per zoccoli e detriti dal manualmente spostando il dispositivo outilizzando una fase microscopio motorizzato. Alcuni piccoli detriti possono essere spinto fuori quando i flussi di liquido attraverso. Per i detriti più grandi o evidenti zoccoli, selezionare un altro canale sul dispositivo, come i detriti nel canale di messa a fuoco può degradare in modo significativo la qualità di ordinazione. Si noti che gli zoccoli possono essere rimossi in condizioni di flusso premendo con forza sulla superficie PDMS al di sopra della regione colpita con una pinzetta contundenti.
- Tagliare tre lunghezze di tubo in PVC (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) per l'ingresso acquosa, di ingresso e di uscita olio, emulsione. Per ridurre al minimo volume morto, quel tanto che basta tagliare tubi per raggiungere dalle pompe siringa alla fase microscopio. Tagliare estremità tubi un angolo di 45 ° per facilitare l'inserimento nei porti fluidici.
- Utilizzare delle pinzette per premere fissare il tubo finisce nei porti fluidici perforate nel passaggio 1 e quindi premere il montaggio di due calibro 30 a punta smussata aghi da siringa in acciaio inox (SmallParts) nelle estremità libere del acquosa rispettivi tubi di ingresso e di olio (non necessario adesivo) . Posizionare il tubo di uscita in un r rifiutieservoir. Questo tubo viene successivamente spostato in un serbatoio di raccolta.
- Spostare il dispositivo e il tubo collegato alla fase microscopio, allineare, e concentrarsi su l'ugello dispositivo utilizzando un obiettivo disponibile (20x è stato utilizzato per questo esperimento). Regolare per K hler illuminazione e altre impostazioni del microscopio come richiesto per la registrazione ottimale.
- Riempire una siringa da 1 ml (BD) con ben miscelato fase acquosa e una siringa da 3 mL (BD) con la fase oleosa soluzione preparata nella fase 2. Si noti che tutte le siringhe di ogni volume può essere usato e deve essere attentamente selezionati a seconda dei tempi di esecuzione desiderati e la minimizzazione di qualsiasi pulsatilità. Inclinare una siringa in verticale e sfiorare per passare le bolle d'aria alla presa di siringa. Premere lentamente lo stantuffo sufficiente per spingere l'aria per la punta della siringa. Tenendo la siringa verticalmente, collegare le siringhe per l'ago della siringa rispettivo già attaccato al dispositivo nella Fase 3,3. Premere lo stantuffo per forzare l'aria attraverso il volume ago della siringa morto finché il liquido è psvuotata attraverso il tubo quasi al dispositivo. Montare saldamente la siringa per una pompa a siringa (Nexus 3000, Chemyx) e coinvolgere il blocco dello stantuffo. Ripetere i collegamenti per la seconda siringa e montare una pompa seconda siringa.
- Accendere ogni pompa siringa e programma utilizzando i protocolli del produttore pompa. Impostare le portate iniziali di Q olio = 50 microlitri / min e Q = aq 5 microlitri / min per la fase olio e fase acquosa, rispettivamente. Avviare le pompe.
- Attendere per ciascun fluido di entrare nel dispositivo e riempire i canali, spingendo fuori l'aria restante morto. Questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti. Se c'è una grande quantità di aria nel tubo di ingresso, aumentare temporaneamente ciascuna portata finché l'aria viene espulsa. Non aumentare le portate così alte che le pressioni di grandi dimensioni si verificano nel canale, che porta a PDMS-to-vetro fallimento bond.
- Utilizzando le portate iniziali, osservare la formazione di gocce al ugello (risultati qui: 20x magnification, il frame rate 21005 fps, l'esposizione 3 ms). Ridurre il campo di vista telecamera solo l'ugello per massimizzare il frame rate e ridurre i requisiti di memoria, se possibile. Acquisizione di video di esempio e verificare che la frequenza di campionamento è sufficiente per evitare l'aliasing.
- Per evitare di getto (vedi figura 2), iniziare con bassi tassi di flusso acquose. Lentamente aumentare il tasso di flusso acquoso di osservare ordinamento delle particelle nel canale lungo soluzione acquosa come all'aumentare della portata.
- Se la concentrazione di particella è troppo bassa per fornire treni con relativamente poche "dispersi" e particelle del campione non è stato galleggiabilità trovati, fisicamente inclinare la pompa a siringa verso l'uscita siringa per fornire graduale sedimentazione delle particelle verso l'uscita siringa. Questo metodo è illustrato nel protocollo video. Periodicamente ruotando la siringa lungo il suo asse può anche ridurre sedimentazione indesiderato.
- Una volta ordinamento adeguata verifica, regolare la portata di olio per sintonizzare la frequenza di generazione edimensione delle gocce. Il volume di goccia media può essere calcolata utilizzando la velocità di flusso acquoso divisa per la frequenza di generazione goccia misurata mediante cattura video. Iterativamente regolare entrambi i flussi di raggiungere tassi di incapsulamento desiderati e volumi goccia.
- Una volta ordinato stabile incapsulamento è confermata, spostare il tubo di uscita dal serbatoio dei rifiuti in un serbatoio di raccolta o di un mangime in un altro dispositivo per il test successivo.
- Determinare il tempo di raccolta in base al numero desiderato di goccioline e la frequenza di generazione calcolato.
- Registrare la frazione di gocce contenenti 0, 1, 2, ..., N particelle di quantificare l'efficienza utilizzando sia risultati goccia video di generazione o pipettando un campione di emulsione raccolto per l'ispezione.
4. Risultati rappresentativi
I risultati sono presentati che conseguire sia controllato singola particella e particella controllato in doppio-incapsulamento (Figura 3). Con il tagliola portata FC-40 di olio a metà, una singola particella, incapsulamento diventa due particelle incapsulamento. Al contrario, avremmo potuto aumentato il tasso di flusso acquoso di consegnare le particelle all'ugello più rapidamente, ma avrebbe anche aumentato il rischio di getto del flusso acquoso. Gli istogrammi in figura 3 presenta il numero frazionario di particelle per caduta per i due casi, insieme con confronti con le statistiche Poisson. Le gocce occasionali con le particelle a zero sono principalmente dovute al "mancante" particelle nei treni ordinati, mentre i casi in cui ci sono particelle più incapsulati che risultato desiderato da locali elevate concentrazioni di particelle e le particelle che a volte migrano verso una delle due posizioni verticali messa a fuoco. Si noti che galleggiamento corrispondente come descritto al punto 2 non è stato utilizzato. Invece, la pompa a siringa è stata fisicamente inclinato per permettere deposizione di particelle verso l'uscita siringa, portando a una concentrazione elevata di particelle durante la corsa.
Figura 1. Dispositivo di incapsulamento. a) totale con dispositivo di insenature, outlet, e lungo canale di ordinazione. L'altezza del dispositivo è di 52 micron e la larghezza del canale di ordinazione è di 27 micron. b) Sia acquoso e bocche olio hanno filtri detriti grandi fessure l'ordine della larghezza del canale di ordinazione per la vista ingrandita di ingresso dell'olio. c) La vista ingrandita dell'ugello mostra uguali larghezze di canale di 27 micron per i canali acquosi e olio, seguiti dalla contrazione ugello di 22 micron e improvvisa espansione a un canale più ampio 61 um.Si noti che le dimensioni del dispositivo illustrato qui sono stati verificati utilizzando un profilometro dopo microfabbricazione e differiscono leggermente dalle dimensioni nominali sulla maschera. Una vera immagine del canale di ordinazione e l'ugello sono disponibili on-line come figura supplementare 1 . La maschera di file di AutoCAD è stata inoltre inserita on-line come un supplemento a questo manoscritto.
Figura 2. Isteresi di un gocciolamento di transizione getto utilizzando un dispositivo più ampio (80 micron di larghezza x 22 um alto). a) A rate costante flusso FC-40 (Q olio = 45 microlitri / min), si verifica la formazione calo costante a 10 kHz con una soluzione acquosa di portata Q aq = 8 microlitri / min. Poiché il flusso acquosa viene lentamente aumentata a 10 m &u; L / min, getto del flusso di fluido acquoso viene attivato. b) Quando la portata viene restituito a 8 microlitri / min getto continua. Si noti che la formazione calo costante può essere ristabilita con una breve pausa la pompa di flusso acquoso (una pausa di 1 secondo è tipico).
Figura 3. Incapsulamento singolo e doppio-particella. A) formazione delle gocce con una cella per goccia (Q olio = 60 microlitri / min, Q aq = 9 pl / min) con un tasso di abbandono generazione di 6,1 kHz, dimensioni calo medio del 24,4 pL, e una singola cellula l'efficienza di cattura D k = 79,5% e P k = 83,7% (λ = 0,95) per un campione di n d = 517 gocce e n p = 491 particelle. b) la formazione di discesa a due celle per goccia si ottiene semplicemente riducendo l'FC-40 velocità di flusso di olio Q a 30 μL / min. Più grande (39,8 pL) gocce sono formate a un tasso di 3,8 kHz con due celle efficienza di cattura D k = 71,5% e P k = 79,5% (λ = 1,80) per un campione di dimensione n d = 383 gocce e n p = 689 particelle. cd) Due istogrammi confrontare l'efficienza di incapsulamento delle particelle goccia D k ha ordinato di incapsulamento singolo e doppio di particelle con le statistiche di Poisson (incapsulamento casuale). Si noti che per entrambi i casi, la spaziatura delle particelle nella direzione del flusso è circa 17-18 micron per completamente ordinati particelle alternati. Video supplementari mostrano sia l'incapsulamento singolo e doppio-particelle sono disponibili online. Clicca qui per vedere 3 film supplementari . Clicca qui per vedere 3b Movie supplementari .
Concentrazione Figura 4. Influisce notevolmente l'efficienza di incapsulamento. A) al diminuire della concentrazione, l'ordinamento piena non si verifica, e quindi "buchi" nei treni emergono, lasciando qualche goccia con meno di particelle previsti. B) L'istogramma mostra la minore efficienza ( D k = 55,9%, P k = 70,9%) per due particelle incapsulamento a causa di un valore inferiore di λ = 1,57 dove ci sono tanti quanti singola particella, diminuisce in quanto vi sono due particelle gocce. Ciò risulta dalla figura Q olio = 30 microlitri / min e Q aq = 9 pL / min, le condizioni di flusso stesse di figura 3b. Un video rappresentante supplementare è disponibile online. Clicca qui per vedere Supplemental Movie 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nonostante i livelli relativamente alti di ordine, non tutte le gocce conterrà il numero corretto di particelle o cellule. Efficienza di incapsulazione può essere calcolato come numero di cellule o particelle che incapsulate in gocce con l'uso desiderato diviso per il numero totale. Questi dati grezzi può essere ottenuto da un algoritmo automatico video ad alta velocità o da un campione di immagini emulsione raccolto. Questo può essere paragonato alla frazione di particelle P k incapsulato in una goccia contenente particelle k e la frazione di gocce D k che contengono particelle k. Dalla Figura 3, entrambe le singole e doppie efficienze di incapsulamento delle particelle sovraperformare efficienza di incapsulazione casuali di un fattore di due e ridurre notevolmente il numero di gocce con più del numero desiderato di particelle figura 4 mostra la necessità di concentrazioni appropriate per alta efficienza.; cioè, e lambd a;, funzione sia concentrazione di particelle e volume di goccia, deve essere uguale o vicino al numero di cellule desiderate per caduta per massimizzare particelle correttamente-incapsulati o cellule. Si noti che una maggiore concentrazione di particelle o cellule di solito è una buona cosa per ordine completo come treni densi tendono a diffondersi nel tempo e riempire le regioni più vuote fra i treni. D'altra parte, se la concentrazione è troppo elevata, il numero elevato di particelle può causare instabilità interfacciale che inducono eiezione all'ugello. In studi specifici (come singole cellule incapsulamento, per esempio), può essere più vantaggioso per evitare multi-cellulari goccioline a spese di introdurre un gocce in più vuote, quindi un λ leggermente inferiore sarà desiderato. Questo vale anche per gli studi volti a interazioni tra due celle o tra una cella e una particella, in cui goccioline singola particella o singola cellula sono più tollerabili di goccioline con due o più di un tipo di cellula o particelle.
jove_content "> Il mantenimento di un λ costante nel tempo è un fattore critico per l'incapsulamento coerente. assist di galleggiamento corrispondenti a lungo termine del controllo della concentrazione, riducendo sedimentazione delle cellule e particelle la siringa e il tubo. Tuttavia, la galleggiabilità corrispondenza comporta anche una maggiore viscosità acquosa che può ritardo ordinamento (con conseguente messa a fuoco più requisiti di canale), aumentare la caduta di pressione del canale, e modificare le portate necessarie per la generazione goccia. Un'alternativa alla galleggiabilità di allineamento in questo esperimento è di inclinare fisicamente la pompa a siringa in modo che l'uscita siringa viene rilevato quasi verticalmente verso il basso (per ridurre al minimo l'adesione delle cellule o particelle verso l'interno siringa). Qui, abbiamo usato 9,9 micron diametro microsfere con una frazione di particelle volume di 1,3% (circa 25 milioni di particelle per mL), ma abbiamo utilizzato inclinazione per aumentare frazioni di volume al 2% per i dati mostrati nella Figura 3. Una seconda alternativa è quella di miscelare il fluido acquoso intermitttemente con un cuscinetto a sfera in acciaio inox chiuso (Teflon rivestito per lavorare con le cellule) con un piccolo magnete esterno. Cura è tuttavia necessario per evitare che il cuscinetto a sfere per saldare la siringa quali può occludere l'ingresso del tubo di ingresso. Tuttavia, queste alternative sono più manodopera e meno ripetibili della corrispondenza galleggiamento, per cui la corrispondenza galleggiamento è più adatto per gli esperimenti su larga scala che si verificano in tempi lunghi. Mentre ordinamento inerziale richiede Re alto e Re p ad operare, quando il acquosa e flussi di petrolio sono spinti sempre più in alto, costante stillicidio di gocce si rivolge a getto 14 (vedi figura 2) ed i risultati di incapsulamento incontrollate. Per le cellule più piccole delle particelle di 10 um utilizzati qui, dimensioni di canale più piccoli possono essere necessarie per ottenere p sufficiente Re se gli indici di flusso non può essere aumentata senza getto. Una peculiarità del getto in sistemi microfluidici è effetti di isteresi che possono verificarsi which rendono difficile bloccare getto semplicemente abbassando la velocità di flusso acquoso volta che si verifica ad un punto in cui non è stato osservato. Sulla base dei risultati sperimentali, si potrebbe sviluppare un gocciolamento dimensionale o adimensionale a getto mappa di flusso come quelle già definite per assiali co-fluenti ugelli 14 e T-giunzioni 26-28 con contorni aggiuntivi per drop rate generazione, cellule per goccia, e incapsulamento efficienza. Questa mappa potrebbe fornire una tabella robusta da cui la velocità di generazione goccia può essere previsto per calcolare λ e fornire così un tasso stimato di flusso per i flussi di acqua e olio a priori.Sebbene non direttamente dimostrato qui, ulteriori riduzioni del flusso olio portata Q da quelli presentati in Figura 3b aumenterebbero ulteriormente il numero di particelle per goccia a tre, quattro, e così via. Per ottenere di più particelle per goccia, o olio di Q deve diminuire o AquEOUS portata Q aq deve aumentare. Per inciso, abbiamo incluso una linea supplementare script di MATLAB che modella l'efficienza di incapsulamento di catturare un numero qualsiasi di particelle in gocce. L'utente immette la spaziatura media delle particelle e una deviazione distanza antiparticolato di serie, che modella il grado di ordinare. Per i treni ordinati, la deviazione standard sarà piccolo. Inoltre, l'utente immette le dimensioni calo medio-and-drop dimensioni deviazione standard, che rappresenta la polidispersione di dimensioni delle gocce. Fare riferimento alla documentazione script per ulteriori informazioni.
Aumentando la velocità di flusso acquoso o diminuendo la portata dell'olio di aumentare il numero di particelle o cellule per caduta, il rischio di instabili aumenta eiezione come le portate vicino rispettivi valori estremi. Così, il numero massimo di particelle ottenibili / cellule per gocciadipenderà dalla geometria del dispositivo e proprietà del fluido. Data la particella / concentrazione cellulare e portata gasolio, il numero di particelle / cellule per goccia è vincolato da limiti sulla portate acquose, che deve essere sufficientemente grande da indurre ordinamento, ma deve essere sufficientemente piccola da evitare instabile getto (e taglio limite sollecitazioni sulle cellule per garantire la redditività). Alternativamente, dato un flusso acquoso in cui si verifica l'ordinamento, la portata dell'olio deve essere sufficientemente grande abbastanza da rimanere nel regime gocciolamento.
Si noti che la generazione e la caduta di gocce di getto di transizione sono molto sensibili alla concentrazione di tensioattivi. Alte concentrazioni di tensioattivi aumentare la viscosità dell'olio, cambiare i parametri di generazione goccia. Per inciso, la scarsità di tensioattivi biocompatibili largamente disponibili per gli oli di fluorocarbonio rappresenta una sfida importante. Attualmente, un fornitore commerciale (Technologies Raindance) esiste per PFPE-PEG tensioattivi copolimero a blocchi, 25 ma studi dimostrano piccoli tecniche di sintesi di un certo numero di gruppi tensioattivo come PFPE-HEG. 29,30 alternative come l'olio minerale leggero sono stati utilizzati in applicazioni biologiche generazione goccia di accedere a una vasta gamma di tensioattivi disponibili, 24,31 ma si noti che il conseguente aumento di viscosità rispetto al petrolio fluorocarburo altera i parametri di generazione goccia. Una recente 32 descrive un gran numero di pubblicati oli fase continua e tensioattivi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JE è un inventore di un brevetto basato sulla tecnologia utilizzata in questo manoscritto.
Acknowledgments
Ringraziamo Technologies Raindance per il campione di PFPE-PEG tensioattivo utilizzato in questo studio, e ringraziamo il BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, regista) per lo stampo wafer di silicio utilizzati per creare repliche di canale PDMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD | AutoDesk | ||
| Transparency Mask | Fineline Imaging Inc. | ||
| SU-8 Photoresist | MicroChem Corp. | 2050 | |
| Dektak Profilometer | Veeco Instruments, Inc. | ||
| Petri Dish | BD Biosciences | 351058 | |
| PDMS Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Sylgard 184, Material Number (240)4019862 | |
| Vacuum Desiccator | Jencons | 250-030 | |
| Vacuum Pump | Alcatel Vacuum Technology | 2010 C2 | |
| Vacuum Regulator | Cole-Parmer | EW-00910-10 | |
| Oven | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Lindberg Blue M, OV800F | |
| Biopsy Punch, 0.75 mm | Harris | Uni-Core 15072 | |
| Laboratory Corona Treater | Electro-Technic Products Inc. | BD-20AC, SKU 12051A | |
| Glass Slides | Gold Seal | 3010 | |
| Aquapel | PPG Industries | Alternative Strategy | |
| Polystyrene Microspheres, 9.9 μm | Thermo Fisher Scientific, Inc. | G1000 | |
| OptiPrep | Sigma-Aldrich | D1556 | Not Demonstrated |
| Luer-Lok Syringes | BD Biosciences | 1 mL: 309628 3 mL: 309585 | |
| FC-40 Fluorocarbon Oil | 3M Inc. | Sigma Aldrich, F9755 | |
| PFPE-PEG Fluorosurfactant | RainDance Technologies | ||
| Light Mineral Oil | PTI Process Chemicals | 08042-47-5 | Alternative Strategy |
| Mineral Oil Surfactant | Evonik Goldschmidt Corporation | ABIL EM 90 | Alternative Strategy |
| Tygon PVC Tubing | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" | Small Parts, Inc. | NE-301PL-C | |
| Inverted Microscope | Carl Zeiss Imaging | Axio Observer.Z1 | |
| High Speed Camera | Vision Research | Phantom V310 | |
| Syringe Pumps (2) | Chemyx Inc. | Nexus 3000 | |
| Silicone Oil | Dow Corning | 200 fluid, 10 cSt | Optional for Emulsion Storage |
References
- Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
- Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
- Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
- Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. , 1218-1220 (2007).
- Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
- Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
- Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
- Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001 (2010).
- Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
- Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364 (2003).
- Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
- Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
- Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
- Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
- Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
- Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703 (2010).
- Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413 (2010).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319 (2007).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).
- Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
- Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
- Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
- Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).
- Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
- Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
- Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).
