Summary
Microglia תושב מקרופאגים הם המספקים את השורה הראשונה של מעקב ההגנה החיסונית של מערכת העצבים המרכזית. מיקרו RNA הם מולקולות רגולטוריות כי לשחק תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל הפעלת והבחנה של מקרופאגים. במאמר זה נתאר את שיטת המדידה של מיקרו RNA ב microglia.
Abstract
Microglia הם תאים של שושלת מיאלואידית הנמצאים במערכת העצבים המרכזית (CNS) 1. תאים אלה ממלאים תפקיד חשוב פתולוגיות של מחלות רבות הקשורות neuroinflammation כמו טרשת נפוצה (MS) 2. Microglia בעוד כמה CNS רגילים להביע CD11b מקרופאג סמן ולהציג פנוטיפ מנוחה בהבעת רמות נמוכות של סמנים הפעלה כגון CD45. במהלך אירועים פתולוגיים מערכת העצבים המרכזית, microglia להיות מופעל כפי שנקבע על ידי upregulation של CD45 ו סמנים אחרים 3. הגורמים המשפיעים על הפנוטיפ microglia פונקציות מערכת העצבים המרכזית לא למד היטב. מיקרו RNA (miRNAs) משפחה הולך וגדל של מולקולות המשתמרים (~~~HEAD=NNS 22 נוקלאוטידים ארוך) כי הם מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים רבים רגילים כגון צמיחת תאים והתמיינות 4 ו מחלות כגון דלקת 5. MiRNAs downregulate את הביטוי של גנים מסוימים היעד של רצפים משלימים מחייב שלIR mRNAs ולשחק תפקיד חשוב ההפעלה של תאים חיסוניים מולדים כולל מקרופאגים 6 ו מיקרוגליה 7. על מנת לחקור מירנה בתיווך מסלולים המגדירים את הפנוטיפ microglial, פונקציה ביולוגית, להבדיל microglia מסוגים אחרים של מקרופאגים, חשוב להעריך כמותית את הביטוי של מיקרו RNA מסוימות תת שונים של מערכת העצבים המרכזית microglia תושב. השיטות המקובלות למדידת ביטוי miRNAs מערכת העצבים המרכזית כולל PCR כמותי מן הרקמה העצבית כולה ב ההכלאה באתרה. עם זאת, PCR כמותי מן homogenate הרקמה כולה אינה מאפשרת הערכת הביטוי של מירנה ב microglia, אשר מייצגים רק 5-15% מכלל התאים של הרקמה העצבית. ההכלאה באתרם מאפשרת הערכת הביטוי של microRNA של סוגי תאים מסוימים בסעיפים רקמות, אך שיטה זו אינה כמותית לחלוטין. בדו"ח זה אנו מתארים כמותית sensשיטת itive לצורך זיהוי של מירנה על ידי בזמן אמת PCR ב microglia מבודד CNS רגילים או במהלך neuroinflammation באמצעות Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE), מודל העכבר על טרשת נפוצה. בשיטה המתוארת יהיה שימושי כדי למדוד את רמת הביטוי של מיקרו RNA ב microglia ב CNS רגילים או במהלך neuroinflammation קשור פתולוגיות שונות, כולל טרשת נפוצה, פגיעה שבץ, טראומה, מחלת אלצהיימר גידולים במוח.
Protocol
1. הבידוד של microglia מ CNS רגיל
הבידוד של microglia מבוצעת כפי שתואר קודם לכן עם שינויים 3.
- הכינו מכשירים לנתיחה ו זלוף: מספריים, מלקחיים, 10 מ"ל מזרק עם מחט 27g, 15 מ"ל Dounce homogenizer (טפלון / זכוכית), ניילון 40 מיקרומטר מסננת תא, 40% ו 70% פתרונות Percoll, 1X PBS.
- להרדים עכברים בחנק מהירה (שלילת חמצן) בדלתיים סגורות 2 CO ומיד להעביר אותם לספסל מעבדה מניפולציות כירורגית זלוף.
- לבצע מניפולציות כירורגיות (מספריים שימוש ו מלקחיים ואתנול 70% כמו חיטוי): חלל הצפק פתוח, לחתוך, הסרעפת החזה חלל פתוח ולא לגזוז אטריום הזכות במספריים.
- ביצוע כל גוף זלוף intracardial על ידי הזרקת 10 מ"ל מזרק לתוך החדר השמאלי לבין הפעלת לחץ. לעבור 8-10 מ"ל של 1X PBS דרך מחזור הדם אל הרשות איטית ויציבהלספירה.
- חזור על שלבים 1.2-1.4 עבור כל העכברים בקבוצת עכברים (בדרך כלל 5-10). לאחר זלוף לשמור על העכבר על קרח עד שכל העכברים הם perfused.
- אחרי טפטוף של כל העכברים, לנתח מוחות וחוטי השדרה. (אופציונלי: ללמוד ביטוי miRNAs באזורים שונים של המוח, לנתח אלה אזורים ספציפיים כמו המוח הקטן, וכו 'היפוקמפוס לקבוצה של עכברים 5-10 ובריכת אותם יחד homogenization).
- Homogenize המוחות וחוטי השדרה באמצעות 15 מ"ל Dounce homogenizer. במקום אחד המוח וחוט השדרה ב 1 homogenizer ולהוסיף 5 מ"ל של 1X PBS. לבצע 10-20 שביתות עדין: homogenate לעבור דרך מסננת לתוך התא צינור ML-50 חרוטי ותעודת ב 2000 סל"ד על כמה דקות צנטריפוגות גדולים 5-7.
- מחק המוח supernatant, resuspend / homogenate חוט השדרה של 2-3 עכברים מ"ל 5-7 Percoll של 70% ו כיסוי 7 מ"ל של Percoll 40%. להסתובב בסל"ד 2000 (לא בלם!) במשך 30 דקות.
- מחק תאים פגומים / פסולת המיאלין על גבי של 70% ולאסוף מונותאים גרעיניים על הממשק / 40% 70%. לדלל תאים שנאספו לפחות ב 01:01 עם 1X PBS ואת הספין של 2,000 סל"ד 5-7 דקות. Resuspend תאים של 0.5 מ"ל PBS ולהעביר אותם לתוך צינור 1.7 ependorf מ"ל. תשואה אופיינית היא ~ 500 x 10 3 תאים mononuclear לכל עכבר, מה שיותיר את מספר התאים microglial ~ 1x10 6 ב 0.5 מ"ל להכנת תאים מן המוחות וחוטי השדרה של 2-3 עכברים.
2. פיקוח על טוהר microglia ידי cytometry זרימה
מכתים עם נוגדנים מבוצעת כפי שתואר קודם עם שינויים 7,8.
- הכן FACS חיץ (1X PBS עם FBS 2%), FCR נוגדנים החוסמים, אנטי CD11b - PE, אנטי CD45-APC-Cy7 נוגדנים, paraformaldehyde 1% ב PBS.
- קח 50 μl של תאים משלב 1.9 ולהעבירם צינור חדש Eppendorf 1.7 מ"ל ולהוסיף 350 μl של חיץ FACS.
- הוסף μl 5-10 נגד FCR נוגדנים דגירה 10-15דקות על הקרח.
- פיצול תאים לשני צינורות Eppendorf. הוסף צינור 1 1 μl נגד CD11b - PE ו 2 μl נגד CD45-APC-Cy7 נוגדנים דגירה 10-15 דקות על קרח. הצינור השני ישמש שליטה שלילי מכתים נוגדנים. לאחר הדגרה עם נוגדנים להוסיף 1 מ"ל של חיץ FACS לשני צינורות ספין של צנטריפוגה קטנה בסל"ד 5400 דקות 5. אחרי ספינינג לתקן את התאים על ידי resuspending אותם μl 400 paraformaldehyde של 1% ב PBS ו vortexing.
- בצע ניתוח תזרים cytometry על cytometer הזרימה (LSR השנייה, BD Biosciences) באמצעות compubeads BD (BD Biosciences) עבור פקדי פיצויים כפי שתואר 8. דוגמאות של תכשירים טובים ורעים מוצגים בתרשים. 1 א, ב.
3. הבידוד של microglia ומקרופגים היקפיים מ CNS דלקת במודל של עכבר Neuroinflammation
דלקת קרום המוח אוטואימונית ניסויית (EAE) מושרה כפי שתואר קודם לכןבעיתון שלנו 7, מיון FACS מבוצע באופן דומה הפרוטוקול שפורסם 8.
- לגרום EAE ידי חיסון תת עורית עם 150 מ"ג ש"א 35-55 פפטיד ב 4 מ"ג / מ"ל משלים מלא של פרוינד (CFA) של קבוצה של 5-10 של C57BL 8-12 שבועות בן / 6 עכברים. הרעלן שעלת יש לתת IP (150 ng / עכבר) בימים אפס ביום שני, לאחר חיסון. עכברים הם נצפו סימנים של המחלה, החל ביום 10 לאחר חיסון, וחומרת המחלה הבקיע בסולם מספרי 0-5 כדלקמן: 0) לא מחלה; 1) זנב חלש או הליכה רעוע; 2) paresis איבר האחורית; 3) שיתוק הגפיים האחוריות, 4) שיתוק אחורית ו forelimb, ו 5) מוות או המתת חסד בשל סיבות אנושיות. עכברים בשיא של המחלה (d21 לאחר חיסון) משמשים לצורך הניסוי עם ציון המחלה אופיינית החל 1.5-2.5.
- לבודד תאים mononuclear מתוך מערכת העצבים המרכזית של קבוצת עכברים 5-10 כמו בשלבים 1.1-1.4 ו להכתים את התאים עם נוגדנים נגד CD11b ואנטי CD45 כמו בשלבים 2.1-2.4.בשלב 2.4 לא לתקן תאים, במקום resuspend אותם μl 400 של 1X PBS במקום paraformaldehyde 1%.
- מיון התא מתבצעת על ידי FACSAria לאוכלוסיות של CD11b + CD45 מיקרוגליה נמוך CD11b + CD45 בתאי היי (~ 80% מהם הם מקרופאגים פריפריה ~ 20% מהם מופעלים microglia 3; בעתיד נתייחס תאים אלה בשם " מקרופאגים "). השתמש 1.7-מ"ל ependorf צינורות לאיסוף הדגימות. 300 μl של 1X PBS עם 10% FBS יש להוסיף את צינורות לאיסוף כדי למנוע נזק של תאים ממוינים. דוגמאות של שלוש אוכלוסיות של microglia, מקרופאגים, לימפוציטים וכן מוצגים בתרשים. 2 א 'עם שער ההגדרות המתאימות מיון באיור. 2 ב. Purities מיון אופייניות היו 98-100% כפי שנקבע על ידי reanalyzing אוכלוסיות מיון של microglia (איור 2 ג) ומקרופגים (איור 2). התשואה הטיפוסי הוא 20-50 x10 3 עבור microglia ו50-100 x10 3 עבור מקרופאגים מבודד קבוצה של חמישה עכברים.
4. הבידוד של RNA
RNA יהיה מבודד באמצעות ערכת mirVana לפי הוראות היצרן עם שינויים.
- ספין microglia של מערכת העצבים המרכזית רגילים משלב 1.9 או תת מיון של microglia ומקרופגים משלב 3.3 ב 1.7-מ"ל צינורות Eppendorf בסל"ד 5400 5-7 דקות ב צנטריפוגה קטנה, בזהירות למחוק supernatant ולהקפיא את כדורי סלולריים על קרח יבש. עבור לשלב 4.2 או להעביר כדורי סלולריים קפואים -70 C, שם הוא יכול להיות מאוחסן במשך 2-3 חודשים.
- להעביר כדורי תאים קפואים כקרח קבוע הפשרה. הוסף 300 μl של מאגר תמוגה מתיק mirVana בעדינות מערבבים ידי pipeting 5-7 פעמים.
- הוסף 30 μl של תוסף Homogenate מ mirVana קיט, המערבולת 30 שניות לערבב, לשמור על קרח למשך 10 דקות
- הוסף 300 μl של Acid-Pehnol: כלורופורם מ mirVana קיט, המערבולת 30 שניות, ספין של 5 מ 'ב 10,000 סל"ד על צנטריפוגה קטנה.
- בזהירות את השלב מימית העליון (300 μl) ולהעביר למקום אחר צינור 1.7 Eppendorf מ"ל, לערבב עם 375 μl של אתנול 100%, להעביר לסנן המחסנית מתוך mirVana ערכת ספין דקות 1 בסל"ד 10,000.
- מחק זרימה דרך חיץ, הוסף 700 μl של פתרון Wash אני מ mirVana קיט, ואת הספין דקות 1 10,000 סל"ד.
- לשטוף פעמיים נוספות עם 500 μl של שטפי הפתרון השני מ mirVana הערכה ולבסוף elute RNA ממחסנית עם 60 μl מים nuclease ללא מחומם מראש.
- הכמות והאיכות של RNA נבחנת באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop. ריכוז של RNA צריך להיות 5-20 ng / ml ו OD λ260 / λ280 יחס בטווח 1.7-2.0. אם ריכוז של רנ"א נמוכה 3 ng / ml ו OD 260λ/280λ נמוך 1.6, הדגימות מבוטלים. דגימות רנ"א ניתן לאחסן ב -70 מעלות צלזיוס למשך 6-12 חודשים.
- המאפשרת אמידה נוספת של איכות RNA, AR דגימותדואר נותחו באמצעות אלקטרופורזה ג'ל ג'ל TBE-דשן 15% (החיים טכנולוגיות). דוגמאות אופייניות של איכות טוב ורע ההכנות רנ"א מוצגים בתרשים. 3 א ו Fig.3b, בהתאמה.
5. זיהוי של מירנה ב microglia ומקרופגים
לצורך ניתוח הביטוי מירנה, בזמן אמת כמותי הפוך transcriptase PCR (qRT-PCR) ניתוח מתבצע באמצעות מבחני TaqMan עם primers ו בדיקות ניאון עבור microRNA מסוים של עניין ואחד RNAs קצרים לידי ביטוי בכל מקום בגוף (למשל snoRNA-55, snoRNA -135 או U6) לנורמליזציה. Primers ו בדיקות ניאון עבור קבוצות מיוחדות של מירנה אדם או העכבר ניתן לרכוש החיים טכנולוגיות בע"מ הנה נשתמש miR-124 כדוגמא עבור מירנה עניין snoRNA-55 כדוגמה לנורמליזציה.
- בצע להפוך התגובה transcriptase לעשות cDNA מ דגימות רנ"א באמצעות ערכת TaqMan שעתוק לאחור:
| פריט | נפח (μl) לדגימה |
| פריימר 5x RT | 1.00 |
| RNA מדגם | 1.67 |
| RT Mix אנזים | |
| 25 מ"מ כל אחד (סה"כ 100 mM) dNTPs | 0.050 |
| MultiScribe transcriptase הפוכה) | 0.333 |
| מאגר 10X RT | 0.500 |
| א.ב. RNase אינהיביטור | 0.063 |
| Nuclease ללא מים | 1.388 |
| סך הכל | 5.00 |
לדלל RNA דגימות ריכוז ng 3 / μl. להכין תערובת אנזימים RT ולשים 3.33 μL לצינורות ה-PCR מוסיפים 1.67 μl של מדגם RNA. דגירה של מכשיר ה-PCR (BioRad) בשעה 16 ° Cבמשך 30 דקות, 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, 85 ° C במשך 5 דקות, ולהגדיר ב 4 ° C בהמתנה.
- ביצוע בזמן אמת תגובת PCR באמצעות שילוב TaqMan PCR:
| פריט | נפח (μl) לדגימה |
| RT המוצר | 1.0 |
| 2X TaqMan מיקס מאסטר | 5.0 |
| 5X Probe | 2.0 |
| Nuclease ללא מים | 2.0 |
| סך הכל | 10.0 |
השתמש צלחת 384 גם ברור התגובה אופטי (החיים טכנולוגיות) עבור התגובה של כל בזמן אמת PCR מכשיר AB 7900 HT. תנאי רכיבה על אופניים: 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, [95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות] x 40 מחזורים.
- עקומות אופיינית עבור סכום של fluoשכותרתו rescently ספציפיים מוצרי ה-PCR (Y למוצרי צירים) עבור snoRNA-55 ו miR-124 עבור דגימות רנ"א (מדגם זה הוא כפילויות) שבודדו microglia ו מח עצם מקרופאגים הנגזרים (BMDMs) לעומת מספר מחזורי (צילומי צירים) הם באיור. 4 א, ב.
6. נורמליזציה ניתוח נתונים
רמות הביטוי היחסי של מירנה עניין (miR-124) מחושבים באמצעות השיטה ΔΔCT כפי שתואר קודם 7,9 באמצעות snoRNA-55 לנורמליזציה של הסכום הראשוני של רנ"א.
- דוגמה של חישוב רמת היחסי של הביטוי miR-124 עבור microglia ו BMDMs מוצג לוח.
- כצעד ראשון, ערכי ה-CT של snoRNA-55 ו miR-124 נקבעים על microglia ו BMDMs מ qRT-PCR עקומות (Fig.4, לוח, עמודות: snoRNA-55 ו miR-124).
- כשלב שני, ערכים ΔCtמחושבים עבור כל עותק של מדגם זה על ידי חיסור של CT עבור snoRNA-55 (נורמליזציה) מ Ct עבור miR-124 (ניסוי) (לוח א, עמודות: CT (נורם), CT (EXP), ו ΔCt).
- כצעד שלישי. ערכים ΔΔCt מתקבלים לאחר ניכוי ΔCt המדגם הפניה (ΔCt (נ"צ)) מערכים ΔCt של דגימות אחרות (לוח א, עמודה: ΔΔCt). דגימה אחת מוגדרת כנקודת התייחסות, רמת היחסי של מירנה ביטוי למדגם זה יוגדר 1.0. דגימות כל שאר נשווה את המדגם הפניה זו. במקרה שלנו, אנו מגדירים את רמת miR-124 במדגם הראשון microglia כמו 1.0, ולכן ΔCt (נ"צ) = 0.49 (לוח א, שורה 1, מסומנים באדום).
- לבסוף, הרמה היחסית של הביטוי מחושב 2-ΔΔCt (לוח א, עמודה: miR-124 expression).
- כל qRT למוצרי PCRs מבוצעות triplicates או כפילויות, ורמת היחסית של הביטוי מוצג ממוצע ± סטיות תקן (SD) עבור triplicates (איור 5 א, ב) או בצד הן כפילויות על ידי הצד כפי שמוצג באיור. 5 ג.
7. נציג תוצאות
עקומות אופייניות בזמן אמת PCR וערכי ה-CT של miR-124 (microRNA של ריבית) וכן snoRNA-55 (נורמליזציה), כמו גם רמות יחסית של ביטוי miR-124 מוצגים באיור. 4 ולוח אני. בניסויים שלנו השתמשנו snoRNA-55 כביקורת לנורמליזציה. כפי שהזכרנו לעיל, RNAs בכל מקום אחר ניתן להשתמש גם לנורמליזציה כגון snoRNA-135 ו U6.
דוגמאות של הביטוי של miR-124 בוגרים ב מיקרוגליה לעומת מח עצם מקרופאגים הנגזרים (BMDMs) מוצגים בתרשים. 5 א (BMDMs גדלו presencהדואר של M-CSF כמתואר 7). באיור. 5 ב ', השווינו את הביטוי של miR-124 באוכלוסיות מיון של CD45 microglia נמוך לעומת CD45 מקרופאגים היי. בשני ניסויים אלה הראינו כי microglia שונים מקרופאגים אחרות של ביטוי רמות גבוהות יותר של miR-124. ניסויים דומים ניתן לבצע בעתיד על קינטיקה של הפעלת microglia in vivo או במבחנה.
הביטוי של miR-124 ב microglia מבודד מערכת העצבים המרכזית של C57BL / 6 עכברים בשלבים שונים של פיתוח מוצג איור. 5 ג. נתונים אלה מראים כי microglia בשלבים המוקדמים של הפיתוח אקספרס נמוך רמות של miR-124, אשר בקורלציה עם הפנוטיפ פעיל שלהם 7. ניתוח דומה ניתן לבצע על מנת ללמוד את הפונקציות של מערכת העצבים המרכזית microglia רגילים כגון השוואה בין הביטוי של miRNAs מסוימות microglia שבודדו באזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית: המוח הקטן, שלכבל pinal וכו 'ההיפוקמפוס
באיור 1. הדוגמאות של ההכנות הטובים והרעים של microglia כפי שנקבע על ידי cytometry הזרימה. במקרה של בידוד "טוב" של microglia מ CNS רגילים, 95-98% של התאים לייצג CD11b + CD45 microgla נמוכה עם 2-5% של CD11b + CD45 היי perivascular מקרופאגים. פחות מ 1% של CD11b - CD45 לימפוציטים או CD11b היי - CD45 - תאים astroglial או oligodendroglial או שברי התא צריך להיות נוכח (א). במקרה של הכנת "רע" מוצג כאן (ב) 18% של זיהום CD11b - CD45 - תאים קיים (ב, ברבע השמאלי התחתון) המצביע על הפרדה מספקת צבע Percoll. במקרה של הכנה טובה, 95-98% של התאים צריך לייצג CD11b + CD45נמוך microglia (רביע, השמאלית העליונה), 2-5% של כל התאים צריכה לייצג CD11b + CD45 מקרופאגים היי perivascular (רביע, הימנית העליונה), ופחות מ 1% של כל התאים צריכה לייצג CD11b תאים מזהמים שליליים (, להוריד ברבע משמאל). במקרה של "הכנה רע", זיהום משמעותי של CD11b - CD45 - תאים או שברי תאים (astroglia, חלקיקים המיאלין וכו ') נמצאים (ב, ברבע השמאלי התחתון), מה שהופך את ההכנה של תאים מתאים בידוד RNA ועוד ניתוח. בנוסף, CD11b - CD45 בתאי היי יכול להיות נוכחת גם במקרה של "הכנה רע" (ב, ברבע הימני התחתון) המציין זיהום על ידי לימפוציטים דם עקב זלוף מספיק.
איור 2. תזרים cytometry analysiשל ומיון אוכלוסיות של microglia ומקרופגים היקפי מ CNS חולים (א) במהלך neuroinflammation שלוש אוכלוסיות של התאים נמצאים מערכת העצבים המרכזית: CD11b + CD45 נמוכה (microglia), CD11b + CD45 היי (מקרופאגים), ו CD11b - CD45. היי (לימפוציטים), כפי שמוצג הימנית העליונה, השמאלית העליונה הרביעים הימנית התחתונה, בהתאמה. גייטס למיון אוכלוסיות של CD11b + CD45 נמוכה microglia ו CD11b + CD45 מקרופאגים היי מוצגים (ב) ואת purities של אוכלוסיות reanalyzed מיון מוצגים (ג, ד). Gating ראשוני על תאים קיימא המבוסס על FSC / SSC פרמטרים יושמה.
איור 3. דוגמאות qualit "טוב" או "רע"IES של RNAs מבודד microglia ונותחו על ידי ג'ל אלקטרופורזה. במקרה של איכות טובה, סולם RNA ו-RNA ריבוזומלי ניכר (א). במקרה של איכות מריחה רע, ו 'נמוכה' מולקולריים השפלה מוצרים משקל ניכרים (ב).
באיור 4. בזמן אמת qRT-PCR עקומות עבור שכותרתו fluorescently miR-124 ו-snoRNA 55 מוצרי ה-PCR. Curves עבור snoRNA-55 (א) ו miR-124 (ב) מוצגים microglia ו מח עצם מקרופאגים הנגזרים (BMDMs). הניסוי בוצע ב כפילויות. ערכי ה-CT נקבעו על ידי הצטלבות של קו הבסיס עם החלק התחתון של תחום ליניארי של qRT-PCR מתעקל כפי שמוצג (ב). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
| snoRNA-55 | miR-124 | DCT = CT (Exp)-CT (נורם) | DDCt = DCT-DCT (נ"צ) | רמה יחסית הביטוי = 2-DDCt | |
| CT (נורם) | CT (EXP) | DCT | DDCt | miR-124 הביטוי | |
| Microglia של מערכת העצבים המרכזית רגילים | 24.082 | 24.572 | 0.49 (נ"צ) | 0 | 1.0 |
| 23.766 | 24.291 | 0.525 | 0.035 | 1.02 | |
| מח עצם (מקרופאגים הנגזרות BMDMs) | 26.879 | 32.231 | 5.352 | 5.317 | 0.025 |
| 26.526 | 32.078 | 5.552 | 5.517 | 0.022 |
לוח ט חישוב הרמות היחסיות של הביטוי miR-124 ב מיקרוגליה לעומת מקרופאגים מח עצם הנגזרים על בסיס של ערכים ג'טי עבור miR-124 (microRNA של ריבית) וכן snoRNA-55 (שלט לנורמליזציה).
איור 5. ניתוח של ביטוי miR-124 ב microglia ומקרופגים. השוואה בין הביטוי-124 מיר microglia מ CNS רגילים לעומת מח עצם ומקרופגים הנגזרים (BMDMs) מוצג (א). השוואת miR-124 ב microglia לעומת מקרופאגים הפריפריה מבודדים של מערכת העצבים המרכזית אצל עכברים עם neuroinflammation מוצג (ב). שינוייםרמת הביטוי של miR-124 ב microglia במהלך הפיתוח של עכברים של 1, 2, ו 4 שבועות בהשוואה לעכברים בוגרים (בגיל 8 שבועות) מוצג (ג). ב (a, b) את הניסוי בוצע בשלושה עותקים עם ממוצע ± סטיית תקן של שלוש תגובות נפרדות ה-PCR הראו. ב (ג) הניסוי נערך כפילויות כמצוין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לאחרונה עניין רב ניתנה microglia ומעורבות של תאים אלה מחלות רבות הקשורות neuroinflammation ו ניוון מוחיים. בנוסף, התפקיד של מיקרו RNA של התמיינות של תאים חיסוניים וסרטן גדל באופן דרמטי על 5,10 מספר השנים האחרונות. דיווחנו בעבר את התפקיד של miR-124 בשמירה על הפנוטיפ לא פעיל או מנוחה של microglia ב CNS רגילים -7, אבל את התפקיד של סוגים אחרים של מיקרו RNA של הפנוטיפ microglia ומדינה ההפעלה עדיין לא גילו. זה יחייב פיתוח שיטות חדשות למדידת ביטוי מירנה במיוחד microglia.
Microglia הם תאים קשה להתמודד בניסויים שכן הם הופכים להיות מופעל ישתנה באופן משמעותי, לאחר בידודם של מערכת העצבים המרכזית. הפרוטוקולים של בידוד microglia מ CNS רגילים פורסמו קודם לכן 11,12. אף על פי הפרוטוקולים הללו coulד להיות שימושי עבור בידוד RNA, אנו מאמינים כי פרוטוקולים אלו מתאימים יותר לביטוי mRNA ולא להערכת הביטוי microRNA. ראשית, חוקרים רבים משתמשים עיכול אנזימטי של רקמה הומוגני או טיהור חרוז מגנטי להפעיל microglia ולגרום לשינויים משמעותיים ביטוי microRNA (לא פורסם תצפית). שנית, המחברים להשתמש Trizol מבוססות שיטות בידוד RNA 11 אשר אינו אופטימלי לניתוח microRNA במספר קטן של תאים microglial, במיוחד עבור אלה אוכלוסיות מוינו של מערכת העצבים המרכזית על ידי FACS. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מהיר ופשוט עם מניפולציות מינימלית במהלך הבידוד של microglia של מערכת העצבים המרכזית. שיטה זו מאפשרת קבלת אוכלוסיות טהורות של microglia עם רמות מינימליות של הפעלת ספונטנית בשילוב עם הטכניקה של בידוד יעיל של RNA ממספר קטן של תאים. בנוסף, אנו משתמשים בפרוטוקול על בידוד של RNA אשר יהיה מועשר במיוחדעם ללא קידוד RNAs קצרים microRNA.
מלבד טוהר מבודד microglia, חשוב גם לוודא את איכות RNA מתאים. ללא הפרדה נכונה של microglia על שיפוע Percoll התוצאה היא זיהום של דגימות רנ"א בפסולת המיאלין, אשר יגרום פרופיל מירנה ב microglia לא רק קשה לפרש, אלא גם מפחית את איכות RNA ולא באופן דרסטי בשל ריכוז גבוה של חומצות גרעין, חלבונים, שומנים חלקיקי מיאלין.
כפי שהזכרנו לעיל, קושי משמעותי במדידת ביטוי מירנה ב microglia הוא מספר קטן של תאים כמות נמוכה של RNA שהתקבלו אפילו קבוצה גדולה של עכברים (10 או יותר). לכן אנו ממליצים לעשות רשימה קצרה של 10-30 מיקרו RNA ולחפש בנפרד ברמת הביטוי של כל אחד באמצעות singleplex qRT-PCR במקום להשתמש פחות רגישים זמנית מבחני ה-PCR או מערכים כידורשים כמות גבוהה למדי של RNA. לאחר הערכת ביטוי של רנ"א על ידי מספר singleplex qRT-PCR כפי שתוארו, אחרים גדולים בקנה מידה מירנה שיטות אפיון יוכל לשמש לאחר אימות זהירה שלהם. לאחרונה היתה כתבה על שיטה רגישה יותר לניתוח זמנית של רנ"א על פלטפורמות מיקרופלואידיקה 13, אשר עלול להיות מאומץ על microRNA גדול פרופיל ביטוי בקנה מידה microglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי R01 NIH NS071039-01A1 מענק מחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
