Summary
Микроглия проживают макрофагов, которые обеспечивают первую линию защиты и иммунного надзора центральной нервной системы. Микро РНК являются регуляторные молекулы, которые играют важную роль во многих физиологических процессах, включая активацию и дифференциацию макрофагов. В этой статье мы опишем метод для измерения микроРНК в микроглии.
Abstract
Микроглия являются клетками миелоидной линии, которые находятся в центральной нервной системе (ЦНС) 1. Эти клетки играют важную роль в патологии многих заболеваний, связанных с neuroinflammation таких как рассеянный склероз (РС) 2. Микроглия в нормальной нервной выразить макрофагов маркер CD11b и обладают отдыха фенотип, выражая низким уровнем активации маркеров, таких как CD45. При патологических событий в ЦНС, микроглии активируются, как это определено регуляция CD45 и другие маркеры 3. Факторы, влияющие на фенотип микроглии и функции в ЦНС не очень хорошо изучены. Микро РНК (миРНК) представляют собой растущую семью сохраняющихся молекул (~ 22 нуклеотидов), которые принимают участие во многих нормальных физиологических процессах, таких как рост и дифференцировку клеток 4 и патологий, таких как воспаление 5. МиРНК подавляют экспрессию определенных генов-мишеней путем связывания комплементарных последовательностей вл мРНК и играют важную роль в активации врожденного иммунитета клеток, включая макрофаги микроглии 6 и 7. С целью изучения микроРНК-опосредованного пути, которые определяют микроглии фенотип, биологические функции, и отличить микроглии от других видов макрофаги, важно, чтобы количественно оценить выражение частности микроРНК в различных подмножеств CNS-резидент микроглии. Общие методы измерения выражение микроРНК в ЦНС включает количественный ПЦР из цельного нейронной ткани и гибридизация. Тем не менее, количественный ПЦР из цельного гомогената ткани не позволяют оценить выражение микроРНК в микроглии, которые представляют собой лишь 5-15% клеток нейронов ткани. Гибридизации на месте позволяет оценить выражение микроРНК в специфические типы клеток в срезах ткани, но этот метод не совсем количественные. В этом докладе мы описываем количественных и Sensтельным методом для обнаружения микроРНК на ПЦР в реальном времени в микроглии изолирован от нормального ЦНС или при использовании neuroinflammation экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), модель мыши для MS. Описанный метод будет полезен для измерения уровня экспрессии микроРНК в микроглии ЦНС в норме или при neuroinflammation, связанных с различными патологиями, включая MS, инсульт, травмы, болезни Альцгеймера и опухолей головного мозга.
Protocol
1. Выделение Микроглия от нормальной ЦНС
Выделение микроглии осуществляется, как было описано ранее с изменениями 3.
- Подготовка инструментов для вскрытия и перфузии: ножницы, пинцет, 10 мл шприц с иглой 27G, 15 мл Dounce гомогенизатор (Teflon / стекло), 40 мкм нейлон ячейки фильтра, 40% и 70% Перколла решений, 1X PBS.
- Усыпить мышей быстро удушья (лишение кислорода) в CO 2 камеры и немедленно передавать их на лабораторный стол для хирургических манипуляций и перфузии.
- Выполняет хирургические манипуляции (использование ножниц и щипцы и 70% этанола в качестве антисептика): открытое брюшной полости, перерезал диафрагмы, открытой грудной полости и отрезать правое предсердие с помощью ножниц.
- Выполнить все тело внутрисердечной перфузии путем введения 10 мл шприца в левом желудочке и применения давления. Передайте 8-10 мл 1X PBS через кровообращение в медленный и стабильный годсе.
- Повторите шаги 1.2-1.4 для всех мышей в группе (обычно 5-10 мышей). После перфузии держать мышь на льду, пока все мышей перфузии.
- После перфузии всех мышей, препарировать мозг и спинной мозг. (Дополнительно: изучить экспрессию микроРНК в различных областях мозга, рассекают этих конкретных областях, таких как мозжечок, гиппокамп и т.д. для группы из 5-10 мышей и бассейн вместе для гомогенизации).
- Однородный мозга и спинного мозга с использованием 15-мл Dounce гомогенизатора. Поместите один мозг и одна спинного мозга в гомогенизатор и добавить 5 мл 1X PBS. Выполните 10-20 нежный ударов, проходить через клеточные гомогената фильтр в 50 мл, коническая трубка и сертификат на 2000 оборотов в минуту на большую центрифугу 5-7 минут.
- Удалить супернатант, Ресуспендируйте мозга / гомогената спинного шнур от 2-3 мышей в 5-7 мл 70% Перколла и наложения 7 мл 40% Перколла. Спиновая на 2000 оборотов в минуту (без тормозов!) В течение 30 минут.
- Отмена поврежденных клеток / миелина мусора на вершине 70%, а сбор моноядерных клеток на 40% / 70% интерфейса. Развести собранных клеток по крайней мере, 1:1 1X PBS и спина при 2000 оборотов в минуту в течение 5-7 минут. Ресуспендируйте клеток в 0,5 мл ФСБ и передать их в трубку 1,7 мл ependorf. Типичный выход ~ 500 х 10 3 мононуклеарных клеток на мышь, которая даст число клеток микроглии ~ 1x10 6 в 0,5 мл для подготовки клетки мозга и спинного мозга на 2-3 мышей.
2. Контроль чистоты микроглии с помощью проточной цитометрии
Окрашивание с антителами происходит, как описано выше с изменениями 7,8.
- Подготовить FACS буфером (1х PBS с 2% ЭТС), FcR блокирующие антитела, анти-CD11b - PE, анти-CD45-APC-Cy7 антител, 1% параформальдегида в ФСБ.
- Принимать по 50 мкл клеток с шагом 1.9 и перенести их на новые трубки 1,7 мл Eppendorf и добавляют 350 мкл буфера FACS.
- Добавить 5-10 мкл против FcR антител и инкубировать 10-15минут на льду.
- Сплит клеток в две пробирки Эппендорф. Добавить в одну пробирку 1 мкл анти-CD11b - PE и 2 мкл анти-CD45-APC-Cy7 антител и инкубировать 10-15 минут на льду. Вторая трубка будет использоваться в качестве отрицательного контроля на наличие антител окрашивания. После инкубации с антителами, добавляют 1 мл буфера FACS как трубы и спина в небольшой центрифуге при 5400 оборотов в минуту в течение 5 мин. После того, как вращается исправить клеток суспендирования их в 400 мкл 1% параформальдегида в ФСБ и встряхивая.
- Выполните проточной цитометрии анализа проточной цитометрии (LSR II, BD Biosciences) с помощью BD compubeads (BD Biosciences) для компенсации управления, как было описано 8. Примеры хороших и плохих препаратов показано на рис. 1а, б.
3. Выделение микроглии и макрофаги из периферийных Воспаление ЦНС в мышиной модели Neuroinflammation
Экспериментальный аутоиммунный энцефалит (ЭОС) индуцируется, как было описано ранееВ нашей статье 7; FACS сортировка производится аналогично опубликовала протокол 8.
- Вызвать EAE по иммунизации подкожной 150 мг Мог 35-55 пептида в дозе 4 мг / мл полного адъюванта Фрейнда (CFA) в группе из 5-10 8-12-недельных C57BL / 6 мышей. Токсин коклюша следует ф (150 нг / мышь) в дни нуля и второй день после иммунизации. Мыши наблюдаются признаки болезни, начиная с 10-й день после иммунизации, а также тяжесть заболевания оценивается по числовой шкале от 0-5 следующим образом: 0) не болезни: 1) слабый хвост или шаткий ходьбы, 2) парез задних конечностей; 3) задние конечности паралич, 4) задние лапы и паралич, и 5) смерти или эвтаназии из-за гуманных соображений. Мыши в разгар заболевания (d21 после иммунизации) используются для экспериментов с характерным счетом болезни от 1,5 до 2,5.
- Изолировать мононуклеаров из ЦНС группы 5-10 мышей с шагом 1.1-1.4 и окрашивает клетки с анти-CD11b и анти-CD45 антитела, с шагом 2.1-2.4.В шаге 2,4 не исправить клеток, вместо того, чтобы их ресуспендируют в 400 мкл 1X PBS вместо 1% параформальдегида.
- Сотовые сортировка осуществляется FACSAria для населения CD11b + CD45 низкая микроглии и CD11b + CD45 привет клеток (~ 80% из них являются периферические макрофаги и ~ 20% из них активируются микроглии 3, в будущем мы будем называть эти клетки как " макрофаги "). Используйте 1,7 мл ependorf трубы для сбора образцов. 300 мкл 1X PBS с 10% FBS должны быть добавлены к коллекции трубы, чтобы предотвратить повреждение отсортированных клеток. Примеры из трех популяций микроглии, макрофагов и лимфоцитов, показаны на рис. 2а при правильной сортировке ворота параметры, показанные на рис. 2b. Типичные чистоты сортировки были на 98-100%, как это определено реанализом отсортированы населения микроглии (рис. 2) и макрофагов (рис. 2). Типичный выход составляет 20-50 x10 3 микроглии и50-100 x10 3 макрофагов изолированы от группы из пяти мышей.
4. Выделение РНК
РНК будет выделена с использованием mirVana комплект в соответствии с инструкциями изготовителя с изменениями.
- Спиновая микроглии от нормальной ЦНС с шагом 1.9 или сортируются подмножеств микроглии и макрофагов с шагом 3.3 в 1.7 мл пробирок Эппендорф при 5400 оборотов в минуту в течение 5-7 минут в небольшой центрифуге, тщательно отказаться супернатант и заморозить клетки гранулы в сухом льду. Переходите к пункту 4.2 или передача замороженных гранул клетки до -70 С, где его можно хранить в течение 2-3 месяцев.
- Передача замороженных гранул клетки регулярно лед для оттаивания. Добавить 300 мкл лизирующего буфера из комплекта mirVana и осторожно смешать по пипетировать 5-7 раз.
- Добавить 30 мкл гомогената добавки из mirVana комплект, вихревые 30 секунд, чтобы перемешать, хранить на льду в течение 10 минут
- Добавить 300 мкл кислотно-Pehnol: хлороформа из mirVana комплект, вихревые 30 секунд, спина 5 мв в 10000 оборотов в минуту на небольшой центрифуге.
- Осторожно верхней водной фазы (300 мкл) и передать еще 1,7 мл Eppendorf трубку, смешайте с 375 мкл 100% этанола, передать фильтра от mirVana комплект и спину в течение 1 мин при 10000 оборотах в минуту.
- Отменить потока через буфер, добавляют 700 мкл промывочного решение, которое я с mirVana комплект, и спина в течение 1 мин при 10000 оборотах в минуту.
- Мыть два раза с 500 мкл промывочного решение II от mirVana комплект и, наконец, элюции РНК из картриджа с 60 мкл предварительно нагретой нуклеазы без воды.
- Количество и качество РНК оценивается по Nanodrop спектрофотометр. Концентрация РНК должна быть от 5 до 20 нг / мл и диаметром λ260 / λ280 соотношение в пределах 1,7-2,0. Если концентрация РНК ниже 3 нг / мл и диаметром 260λ/280λ ниже, чем 1.6, образцы удаляются. РНК образцы могут храниться при -70 ° С в течение 6-12 месяцев.
- Для дальнейшей оценки качества РНК, образцы аранализировались с помощью электронной гель-электрофореза в 15% случаев КЭ-мочевины гель (Life Technologies). Типичные примеры хорошего и плохого качества препаратов РНК показаны на рис. 3а и 3б соответственно.
5. Обнаружение микроРНК в микроглии и макрофаги
Для анализа микроРНК выражение в реальном времени, количественный обратной транскриптазы ПЦР (QRT-PCR) анализ проводится с использованием TaqMan анализы с грунтовки и флуоресцентных зондов для определенных микроРНК интересов и один из повсеместно выражается короткой РНК (например, snoRNA-55, snoRNA -135 и U6) для нормализации. Грунты и флуоресцентных зондов для конкретных наборов человека и мыши микроРНК могут быть приобретены у Life Technologies Инк Здесь мы будем использовать микроРНК-124 в качестве примера для микроРНК интересов и snoRNA-55 в качестве примера для нормализации.
- Выполните обратной транскриптазы реакции, чтобы кДНК из образцов РНК с использованием TaqMan обратной транскрипции комплект:
| Пункт | Объем (мкл) в образце |
| 5x Primer РТ | 1,00 |
| РНК образца | 1,67 |
| RT ферментов Mix | |
| 25 мм (100 мм общая) дНТФ | 0,050 |
| MultiScribe обратной транскриптазы) | 0,333 |
| 10X Буфер РТ | 0,500 |
| AB РНКазы ингибитор | 0,063 |
| Нуклеазы без воды | 1,388 |
| Общий | 5,00 |
Разбавьте образцы РНК концентрации 3 нг / мкл. Подготовить РТ Mix ферментов и положил на 3,33 мкл ПЦР пробирок и добавить 1,67 мкл образцов РНК. Инкубируйте в ПЦР инструмент (BioRad) при 16 ° Св течение 30 мин, 42 ° С в течение 30 мин, 85 ° C в течение 5 минут, и поставил на 4 ° C на удержание.
- Выполните ПЦР в реальном времени реакции с использованием TaqMan ПЦР смеси:
| Пункт | Объем (мкл) в образце |
| RT продукт | 1,0 |
| 2X TaqMan Master Mix | 5,0 |
| 5X Probe | 2,0 |
| Нуклеазы без воды | 2,0 |
| Общий | 10,0 |
Использование 384-подальше оптические пластины реакции (Life Technologies) для каждой реакции и ПЦР в реальном времени прибор AB 7900 HT. Велоспорт условиях: 95 ° C в течение 10 мин, [95 ° C в течение 5 сек, 60 ° С в течение 60 сек] х 40 циклов.
- Типичные кривые на сумму флуоресценцииrescently помечены конкретных продуктов ПЦР (у-оси) для snoRNA-55 и микроРНК-124 образцов РНК (каждый образец в двух экземплярах), выделенных из микроглии и костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) в зависимости от количества циклов (х-оси) показанной на рис. 4а, б.
6. Нормализация и анализа данных
Относительный уровень экспрессии микроРНК на интерес (микроРНК-124) рассчитаны с использованием метода ΔΔCT, как описано выше 7,9 использованием snoRNA-55 для нормализации исходного количества РНК.
- Пример расчета относительного уровня микроРНК-124 выражение для микроглии и BMDMs показано в таблице.
- В качестве первого шага, Ct значения snoRNA-55 и микроРНК-124 определяется для микроглии и BMDMs от QRT-PCR кривых (рис. 4, таблицы, столбцы: snoRNA-55 и микроРНК-124).
- В качестве второго шага, ΔCt значениярассчитываются для каждого дубликата каждого образца путем вычитания Ct для snoRNA-55 (нормализации) от Ct для микроРНК-124 (эксперимент) (табл. I, колонки: Ct (норма), КТ (Exp) и ΔCt).
- В качестве третьего шага. ΔΔCt значения вычисляются путем вычитания ΔCt эталонного образца (ΔCt (ссылка)) из ΔCt значения других образцов (табл. I, столбец: ΔΔCt). Один образец определяется как ссылка, относительный уровень микроРНК выражение для этого образца будет определяться как 1,0. Все остальные образцы будут по сравнению с этим эталонным образцом. В нашем случае мы определяем уровень микроРНК-124 в первый образец для микроглии как 1.0, поэтому ΔCt (Ссылка) = 0,49 (табл. I, первый ряд, отмеченный красным цветом).
- Наконец, относительный уровень экспрессии рассчитывается как 2-ΔΔCt (табл. I, столбец: микроРНК-124 EXpression).
- Все QRT-PCR, осуществляется в triplicates или в двух экземплярах, а относительный уровень выражения представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD) для triplicates (рис. 5а, б) или оба дублирует бок о бок, как показано на рис. 5с.
7. Представитель Результаты
Типичные кривые для ПЦР в реальном времени и КТ значения микроРНК-124 (микроРНК процентов) и snoRNA-55 (нормализация), а также относительные уровни экспрессии микроРНК-124, показаны на рис. 4 и таблицы. В наших экспериментах мы использовали snoRNA-55 в качестве контроля для нормализации. Как мы уже упоминали выше, другие повсеместно РНК может быть использована для нормализации таких как snoRNA-135 и U6.
Примеры выражения микроРНК-124 у взрослых микроглии против костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) показаны на рис. 5а (BMDMs были выращены в presencе M-CSF, как описано 7). На рис. 5б, мы сравнили экспрессию микроРНК-124 в отсортированном популяции CD45 низкая микроглии против CD45 привет макрофагов. В обоих этих экспериментов показали, что микроглии отличаются от других макрофагов, выражая более высокие уровни микроРНК-124. Подобные эксперименты могут быть выполнены в будущем кинетики активации микроглии в естественных условиях или в пробирке.
Выражение микроРНК-124 в микроглии изолированы от ЦНС C57BL / 6 мышей на разных стадиях развития показаны на рис. 5с. Эти данные показывают, что микроглии на ранних стадиях развития экспресс низкие уровни микроРНК-124, которые связаны с их активированный фенотип 7. Подобный анализ может быть проведен для изучения функции микроглии в нормальном ЦНС, такие как сравнение выражения частности микроРНК в микроглии, выделенных из различных областей ЦНС: мозжечок, сPinal мозга, гиппокамп и т.д.
Рисунок 1. Примеры хорошей и плохой подготовкой микроглии, как это определено методом проточной цитометрии. В случае «хорошего» изоляции от нормальной микроглии ЦНС, 95-98% клеток представляют CD11b + CD45 низкая microgla с 2-5% CD11b + CD45 привет периваскулярные макрофаги. Менее 1% CD11b - CD45 лимфоцитов привет или CD11b - CD45 - астроглиального или олигодендроглиальных клетки или клеточные фрагменты должны присутствовать (а). Случае «плохого» препарата показано на рисунке (б), где 18% загрязняющих CD11b - CD45 - клеток присутствует (б, в левом нижнем квадранте) свидетельствует недостаточное разделение градиент Перколла. В случае хорошей подготовки, 95-98% клеток должны представлять CD11b + CD45низкий микроглии (а, левый верхний квадрант), 2-5% всех клеток должны представлять CD11b + CD45 привет периваскулярные макрофаги (а, правый верхний квадрант), и менее 1% всех клеток должны представлять CD11b отрицательные загрязнения клеток (а, левый нижний квадрант). В случае "плохого препарата", значительное загрязнение CD11b - CD45 - клеток или клеточных фрагментов (астроглией, миелин частиц и т.д.) присутствуют (б, в левом нижнем квадранте), что делает подготовку клетки непригодны для РНК и дальнейшей изоляции анализа. Кроме того, CD11b - CD45 привет клетки могут быть также и в случае "плохого препарата" (б, в правом нижнем квадранте) с указанием загрязнения лимфоцитов крови из-за недостаточной перфузии.
Рисунок 2. Проточная цитометрия анас сортировкой и населения микроглии и периферические макрофаги больных ЦНС (а) в neuroinflammation трех популяций клеток, присутствующих в ЦНС: CD11b + CD45 низкая (микроглии), CD45 + CD11b привет (макрофаги), а CD11b - CD45. привет (лимфоциты), как показано в верхнем левом, правом верхнем и правом нижнем квадрантах, соответственно. Ворота для сортировки популяции CD45 + CD11b низкой микроглии и CD11b + CD45 привет макрофаги показано в (б) и чистота переосмыслены отсортированы населения приведены в (в, г). Предварительные стробирования на жизнеспособных клеток на основе FSC / SSC параметров был реализован.
Рисунок 3. Примеры "хороших" и "плохих" Qualitх годов РНК изолирован от микроглии и анализируются с помощью гель-электрофореза. В случае хорошего качества, РНК лестнице и рибосомной РНК очевидно (). В случае плохого качества, мазок, и низкомолекулярные продукты распада вес очевидны (б).
Рисунок 4. В режиме реального времени QRT-PCR кривые флуоресцентно меченных микроРНК-124 и snoRNA-55 продуктов ПЦР. Кривые snoRNA-55 (а) и микроРНК-124 (б) показано микроглии и костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs). Эксперимент проводился в двух экземплярах. Ct значения были определены на пересечении с базовой нижней части линейного спектра QRT-PCR кривые, как показано в (б). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
| snoRNA-55 | микроРНК-124 | DCT = Ct (Exp) Ct (Норма) | DDCT = DCT-DCT (Ссылка) | Относительный уровень экспрессии = 2-DDCT | |
| Ct (Норма) | Ct (Exp) | DCT | DDCT | микроРНК-124 Выражение | |
| Микроглия от обычных ЦНС | 24,082 | 24,572 | 0,49 (Ref) | 0 | 1,0 |
| 23,766 | 24,291 | 0,525 | 0,035 | 1,02 | |
| Костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) | 26,879 | 320,231 | 5,352 | 5,317 | 0,025 |
| 26,526 | 32,078 | 5,552 | 5,517 | 0,022 |
Таблица I. Расчет относительных уровней микроРНК-124 выражение в микроглии против костного мозга, полученных макрофагов основан С значения т для микроРНК-124 (микроРНК процентов) и snoRNA-55 (управление по нормализации).
Рисунок 5. Анализ микроРНК-124 выражение в микроглии и макрофагов. Сравнение микроРНК-124 выражение в микроглии от нормальной нервной против костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) показана на (а). Сравнение микроРНК-124 в микроглии против периферические макрофаги, изолированные от ЦНС у мышей с neuroinflammation показано в (б). Изменения вУровень экспрессии микроРНК-124 в микроглии в процессе развития у мышей 1, 2 и 4 недели по сравнению с взрослой мыши (на 8 недель) показан на (с). В (а, б) эксперимент был проведен в трех экземплярах с среднее ± SD из трех отдельных реакции ПЦР показано на рисунке. (В) Эксперимент проводился в двух экземплярах, как указано.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Недавно значительный интерес был дан микроглии и участие этих клеток во многих патологий, связанных с neuroinflammation и нейродегенеративные. Кроме того, роль микроРНК в дифференцировке иммунной и раковых клеток резко выросли за последние несколько лет 5,10. Ранее мы уже сообщали роль микроРНК-124 в поддержании неактивированной или отдыха фенотип микроглии ЦНС в норме 7, но роль других видов микроРНК в микроглии фенотипа и активации состояние еще предстоит узнать. Это потребует разработки новых методов измерения микроРНК выражение именно в микроглии.
Микроглия трудно клетки для обработки в экспериментах, так как они активируются и значительно изменены после их изоляции от центральной нервной системы. Протоколы для изоляции от нормальной микроглии ЦНС были ранее опубликованы 11,12. Хотя эти протоколы Коулабы быть полезны для выделения РНК, мы считаем, что эти протоколы являются более подходящими для экспрессию мРНК, а не для оценки микроРНК выражения. Во-первых, многие исследователи используют ферментативного пищеварения гомогенизированных тканей или магнитной очистки шарика, которые активируют микроглии и в результате значительных изменений в микроРНК выражение (не публикуется наблюдения). Во-вторых, авторы используют Trizol методы, основанные на РНК изоляции 11, которая не является оптимальной для анализа микроРНК в небольшом количестве клеток микроглии, особенно для тех популяций, которые были отсортированы от ЦНС FACS. Здесь мы приведем простой и быстрый протокол с минимальными манипуляциями во время изоляции от микроглии ЦНС. Этот метод позволяет получать чистых популяций микроглии с минимальным уровнем спонтанной активации в сочетании с техникой для эффективного выделения РНК из небольшого количества клеток. Кроме того, мы использовали протокол для выделения РНК, которые будут особенно обогащенныекороткие некодирующие РНК и микроРНК.
Кроме того, чистота изолированных микроглии, важно также, чтобы убедиться, что качество РНК подходит. Без надлежащего разделения микроглии по градиенту Перколла в результате загрязнения образцов РНК с мусором миелина, который сделает микроРНК профилирования в микроглии не только трудно интерпретировать, но и снижает качество РНК, а резко из-за высокой концентрации нуклеиновых кислот, белков и липидов в миелиновой частиц.
Как уже отмечалось выше, значительная трудность в измерении микроРНК выражение в микроглии является небольшое количество клеток и низкое количество РНК получили даже от большой группы мышей (10 и более). Поэтому мы рекомендуем сделать короткий список 10-30 микроРНК и посмотреть отдельно на уровень экспрессии каждого из его, используя singleplex QRT-PCR, а не использовать менее чувствительны мультиплекс ПЦР или массивытребуется довольно большое количество РНК. После оценки экспрессии микроРНК на несколько singleplex QRT-PCR, как мы описали, других крупных масштабах методы микроРНК профилирования могут быть использованы после их тщательной проверки. Недавно появилось сообщение о более чувствительный метод мультиплексирования анализа микроРНК на платформах микрофлюидики 13, которые потенциально могли бы быть приняты для крупномасштабных микроРНК профилирование экспрессии в микроглии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке НИЗ R01 NS071039-01A1 исследовательский грант.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
