Summary

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Published: July 23, 2012
doi:

Summary

Mikroglia merkezi sinir sisteminin savunma ve bağışıklık gözetim ilk satırı sağlamak makrofajlar ikamet ediyorsanız. MicroRNA aktivasyonu ve makrofaj farklılaşma da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik süreçlerin önemli bir rol oynar düzenleyici moleküllerdir. Bu yazıda, mikroglia yılında microRNA ölçümü için bir yöntem sunduk.

Abstract

Mikroglia merkezi sinir sistemi (MSS) 1 ikamet miyeloid soyunun hücrelerdir. Bu hücreler multipl skleroz (MS) 2 gibi nöro-inflamasyonu ile ilişkili birçok hastalık patolojileri önemli bir rol oynamaktadır. Normal bir MSS mikroglia makrofaj belirteç CD11b ifade ve böyle CD45 olarak aktivasyonu düşük seviyelerde ifade ederek dinlenme fenotip sergilerler. MSS patolojik olaylar sırasında, mikroglia CD45 upregülasyonunun ve diğer belirteçler 3 olarak belirlenmiştir aktive olur. Mikroglia fenotip ve MSS işlevlerini etkileyen faktörler iyi çalışılmıştır değildir. MicroRNA (miRNA'lar) gibi hücre büyümesi ve farklılaşması 4 ve inflamasyon 5 gibi patolojiler gibi birçok normal fizyolojik süreç olarak katılıyor korunmuş molekülleri (~ 22 nükleotid uzunluğunda) büyüyen bir aileyiz. MiRNA'lar bağlayıcı tamamlayıcı dizileri tarafından belli bir hedef genlerin ifade downregulateir mRNA'ların ve makrofajlar 6 ve mikroglia 7 de dahil olmak üzere doğal bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu önemli bir rol oynamaktadır. Mikroglial fenotipi, biyolojik işlevini tanımlamak ve makrofajların diğer türlerinden mikroglia ayırmak için miRNA aracılı yollarının araştırılması amacıyla, kantitatif MSS yerleşik mikroglia farklı alt grupları özellikle microRNA ifade değerlendirmek için önemlidir. MSS kullarak ölçmek için ortak yöntemler tüm nöronal doku ve in situ hibridizasyon kantitatif PCR içerir. Ancak, bütün doku homojenattan kantitatif PCR nöronal doku hücrelerinin sadece% 5-15 temsil mikroglia miRNA ifadesi değerlendirilmesi, izin vermez. In situ hibridizasyon doku bölümlerini özel hücre tipleri içinde mikroRNA ile ifade değerlendirmesi sağlar, fakat bu yöntem tamamen niceliksel değildir. Bu yazıda, niceliksel ve sens tarifNormal MSS veya deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE), MS için fare modeli kullanılarak nöro-inflamasyonu sırasında izole mikroglia gerçek zamanlı PCR ile miRNA tespiti için itive yöntemi. Açıklanan yöntem, normal MSS veya MS, inme, travmatik yaralanma, Alzheimer hastalığı ve beyin tümörleri gibi çeşitli patolojiler ile ilişkili nöro-inflamasyonu sırasında mikroglia içinde microRNA ifade düzeyini ölçmek için yararlı olacaktır.

Protocol

1. Normal CNS den mikroglia İzolasyonu Mikroglia izolasyonu modifikasyonlar 3 ile daha önce tarif edildiği gibi yapılabilir. Makas, forseps, 27g iğne, 15 ml Dounce homojenizör (Teflon / cam), 40 mikron naylon hücre süzgecinden,% 40 ve% 70 Percoll çözümleri, 1X PBS ile 10 ml şırınga: diseksiyonu ve perfüzyon aletleri hazırlayın. CO 2 kamera hızlı boğulma (oksijen eksikliği) tarafından fareler Euthanize ve hemen cerrahi manipüla…

Discussion

Yakın zamanda önemli bir ilgiyi mikroglia ve Nöro ve nörodejenerasyonunun ile ilişkilendirilen birçok patolojilerin bu hücrelerin infiltrasyonu verildi. Ayrıca, bağışıklık ve kanser hücrelerinin farklılaşmasında microRNA rolü önemli ölçüde son birkaç yıl 5,10 içinde büyüdü. Biz önceden normal MSS 7 mikroglia aktive olmayan veya dinlenme fenotip bakım miR-124 rolünü bildirdin, ama mikroglia fenotip ve aktivasyon devlet microRNA diğer türleri rolü keşfedilmeyi bekl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışma NIH R01 NS071039-01A1 araştırma bursu ile desteklenmiştir.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
1X PBS GIBCO 14190 Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
10X PBS Thermo Scientific SH30258.02 Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
DMEM; FBS GBCO 11965; 10438  
miRVana kit Invitrogen AM1561  
Percoll Sigma P4937-500 ml 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM
50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS
MOG35-55 peptide AnaSpec Inc 60130-5  
CFA DIFCO 263810  
Pertussis Toxin Sigma P7208  
FcR blocking antibodies BD Biosciences 553142 Clone 2.4G2
Anti-CD11bPE mAb BD Biosciences 553311 Can be used with different fluorophores (e.g. AF488)
Anti-CD45-APC-Cy7 mABs Biolegend 103116 Can be used with different fluorophores (e.g. APC)
Paraformaldehyde (16%) EMS Inc 15710 Dilute 1:15 in 1X PBS
15% TBE-Urea Gel Life Technologies Inc. EC68855BOX  
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Life Technologies Inc 4366596  
TaqMan Universal PCR Master Mix Life Technologies Inc 4304437  
TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a Life Technologies Inc 4427975 ID 001182  
TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 Life Technologies Inc 4427975 ID 001228  
Nuclease-free water Life Technologies Inc AM9937 Nuclease-free water
384-well clear optical reaction plate Life Technologies Inc. 4309849 Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments
Dounce homogenizer (15 ml) Wheaton Science Products. 358044 Teflon/glass
40 μ nylon cell strainer Falcon 352340  
Big centrifuge Sorval RT 6000B Rotor diameter 18.5 cm
Small centrifuge Eppendorf 5415 R Rotor diameter 6.5 cm
Real-time PCR Instrument Life Technologies Inc. AB 7900 HT Can be substituted with other instruments
Flow cytometer BD Biosciencess LSR II Can be substituted with other instruments
FACS BD Biosciences FACSAria Can be substituted with other instruments
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 1000  

References

  1. Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
  2. Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
  3. Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
  4. Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
  5. McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
  6. He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
  7. Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
  8. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
  9. Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
  10. Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  12. Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
  13. Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).

Play Video

Cite This Article
Veremeyko, T., Starossom, S., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (65), e4097, doi:10.3791/4097 (2012).

View Video