Summary
이 비디오에서 우리는 플라즈마 결합하지 않고 신경 세포 microfluidic 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
이 비디오에서는, 우리는 플라즈마 결합하지 않고 신경 세포 microfluidic 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 어떤 경우에는 그것은 코닝 제 1 커버 유리 reversibly 결합 장치를하는 것이 바람직하다 수 있습니다. 이것은 가능한되지 않는 플라즈마 클리너로, 아마도으로 인해 수 있습니다. 그것은 뉴런이 장치의 스테인드 수 있으므로 immunostaining을위한 장치를 제거하는 데 필요한 것은 아니지만, 다른 경우에, 그것은 현미경이나 immunostaining 특정 유형의 뉴런의 culturing 후에 유리에서 장치를 제거하는 것이 바람직하다 수 있습니다. 일부 연구자들은 그러나 여전히 장치를 제거하는 것을 선호합니다. 이 경우, 커버 유리에 장치의 가역 본딩은 가능합니다. 인감으로 꽉하지가 형성되어있는 장치가 아닌 플라즈마 접합 몇 가지 단점이 있습니다. 어떤 경우에는 axons은 홈 아래에보다는 그들을 통해 성장 수 있습니다. 또한, 유리와 PDMS는 소수성이기 때문에, 액체는 쉽게 장치에 미디어 및 기타 시약을 강제로 시간이 필요하고 장치를 입력하지 마십시오. 액체가 모세관을 통해 장치를 입력하지만, 그것은 상당히 이상으로 플라즈마 보세 있었 장치에 비해 소요됩니다. 플라즈마 청소기 초 이내에 결합 후 장치를 통해 액체의 흐름을 촉진 유리 및 장치에 임시 친수성 요금을 만듭니다. 비 - 플라즈마 바운드 장치, 장치를 통해 액체 흐름은 몇 분 정도 걸립니다. 장치가 플라즈마 청소기 그들을 소독하기 때문에 플라즈마 처리 장치를 사용하기 전에 소독을 할 필요가 없습니다 비해 먼저 소독을해야 결합이 아닌 플라즈마와 함께 사용할 수 있습니다 또한 중요하다.
Protocol
신경 세포의 세포 배양에 대한 Microfluidic 장치를 준비
1) 클린 코닝 제일 24mm X 40mm 유리 슬라이드
- 30 분 물 목욕 sonicator의 유리 슬라이드를 Sonicate
- 70 % EtOH로 유리 슬라이드 린스
- 세차 DH 2 O로 세 번 슬라이드
- 선호 하루 몇 시간을위한 조직 문화 후드에 건조 슬라이드
참고 : 우리는 슬라이드와 함께로드되는 특수 금속 쟁반 있습니다. 슬라이드는 개별적으로 구분이 금속 선반에 슬롯에 배치됩니다. 그러면 우리가 물 욕실 sonicator에 물, 장소 기입되는 유리 접시에서 이러한 금속 로딩 트레이를 배치하고, 30 분 sonicate 수 있습니다. 후속 세척이 접시에 실시하고 있습니다.
2) PDMS 장치를 준비
- PDSM 캐스트 및 분기 안에있는 실리콘 웨이퍼에서 PDMS 금형을 잘라 펀치 구멍
- 먼저 전체 불활성 가스 (아르곤 또는 질소) 불어로 PDMS 장치를 청소하십시오. 그런 다음 남은 부스러기를 떠 3M 스카치 브랜드 471 테이프를 사용하여
참고 : 장치까지 얼굴 유지하는 것이 중요합니다. 처음에는, 우리는 실리콘 웨이퍼에서 멀리 PDMS를자를 때, 웨이퍼와 접촉하는 측면이 깨끗한 측면입니다 그것은 microfluidic 채널을 포함하고 있습니다. 우리는 같은 장치를 손상하고, 우리가 플라즈마 결합에 대한 준비가 될 때까지 깨끗한 측면 얼굴을 유지하지 않을 수있는만큼 조심하십시오.
- 플라스틱 용기 압력솥 장치
- autoclaving, 깨끗한 제 1 코닝 유리 슬라이드와 Harrick 브랜드 플라즈마 클리너 사용 플라즈마 처리 장치 후 www.harrickplasma.com을
- 장치가 유리 슬라이드에 측면을 청소 플레이스.
이 장치는 이제 유리 슬라이드에 접착 플라즈마입니다.
3) 코팅 폴리 L - 라이신 (PLL)를 가진 장치
- PLL은 장치의 양쪽에 잘 추가하고 다음 우물에를 통해 흐름을 허용
= 작은 우물에 대한 큰 우물 30 μ 리터 PLL에 대한 PLL의> 150 μl. 그것은 한 우물 전체 있으므로 정확한 필요가 없습니다.
참고 : 장치에서 보면 당신은 4 우물을 볼 수 있습니다 : 각 두 연결됩니다. 당신은 잘 따라서는 다음 잘으로 장치를 통해 흐름을 것입니다 하나의 PLL을 데려가고 싶다는 거잖아요.
- PLL에 대해 10 분 동안 장치를 통해 흐름을 그리고 그들을 채우기 위해 우물에 더 많은 PLL 추가 허용
- (야간 바람직합니다) 4 시간 최소 37 ° C에서 배양기에서 PLL을 포함하고있는 장치를 배치
- 치료 후 여분의 PLL을 진공하지만, 장치의 밖으로 모든 액체를 빨아하지 않도록주의해야
참고 : 채널 또는 챔버에 공기 방울을 소개하고 싶지 않아요. 그냥 우물에 과다한 PLL을 진공.
- 장치의 양쪽에 각각 잘하는 autoclaved DH 2 O를 추가하고, 모세관 작용에 의해 다른 잘하는 흐름 수
그림 1은 microfluidic 장치의 다이어그램입니다. 블루 (소마 쪽)이 연결 방법은 공지 사항과 레드는 (Axonal 쪽) 연결됩니다. 우리가 장치의 양쪽에 잘 하나에서 PLL, 또는 물이나 미디어를 넣어 말할 때, 우리는 무슨 말인지 예를 들어,입니다 플레이스 autoclaved DH 중 하나를 블루 그럼 곳에서 150 μl의 autoclaved DH 2 O 150 UL 글쎄, 첫째 레드로 2 0. 물 (또는 PLL, 또는 미디어, 또는 전지) 다른 해당 잘 수있는 장치를 통해 흐름을 것입니다.
그림 1
참고 사항 : 지금부터 내가 말하는 "TOP 우물에서 개최 미디어, 세포, 물 또는 PLL은"내가 소마의 왼쪽에 될 어디에 위의 그림과 Axons 말하는거야, 참고하면로 성장할 것입니다 좋아.
- 물 (다시 신중하다고하는 것은 완전히 장치에서 모든 액체를 제거하지 않음)에서 대기음 후, 잘 연결되어있는 각각의 하나 autoclaved DH 2 O의 또 다른 150 μl를 추가하고 잘 대응까지 흐름 수 있습니다.
- 37 인큐베이터에서 DH 2 O를 포함하는 장치를 ° C 1 시간 후 다시 세척 단계를 반복합니다. 총 있습니다 일시간 각각에 대해 DH 2 O와 장치를 세 번 씻으십시오.
참고 : PLL에서 borate는 전 연구소의 일부 제가 몇 이후 autoclaved DH 2 O와 하룻밤 장치를 잠복기 추천 PDMS에 흡수 수있는 가능성으로 인해nitial 빠른 rinses. 이것은 모두 무료 borate는 세포의 로딩하기 전에 PDMS 밖 리치 것을 보장합니다. 이것이 완료되지 않으면 세포 독성을 초래할 수 시간이 지남에 따라 미디어에 borate의 출시가있을 수 있습니다.
- 상단 우물에 필요한 요소 (glutamax, B27, PenStrep)과 신경 기저 미디어 (NBM)를 추가
참고 : 장치 하룻밤과 그 다음날 전지와 도금 incubated, 또는 세포를 도금하기 전에 NMB + 요인 3 시간 최소 incubated 수 있습니다.
장치 속으로 로딩에 대한 뉴런 준비
우리는 어느 뇌 비트 또는 우리 캠퍼스에 여기서 준비라는 회사에서 구입되는 십팔일 오래된 태아 쥐의 피질을 사용합니다. 우리는 조직 신선한 얻을 것을 선호합니다.
- 최대 절전 E에 저장 한 태아의 두뇌 피질을 (조직 2 개) 구합니다
- 알코올 램프를 사용하여 세 긴 유리 pipettes를 타고 연속 작은 크기로 각각 그들을 불
- 멸균 15 ML 튜브에 NMB + 요인이 ML에 유리 피펫과 장소와 최대 절전 E에서 조직을 제거하십시오.
- 분쇄 : 피질은 10-5 번 정도 아래로 통과하고있는 전구와 유리 피펫을 사용합니다. 그런 다음 작은 피펫은 조직을 아래로 피펫과하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 가장 작은 피펫은 조직을 아래로 피펫과하는 데 사용됩니다. 우리는 보이는 덩어리가 없는지 확인 것을 좋아합니다.
참고 : 최근 전 연구실 처음 50 % 0.125 %의 트립신 대우 조직의 준비가되어있는 세포에 최대 절전 E에 저장된 조직에서 세포를 비교하기 시작 칼슘 + + 무료 MG + + 무료 해부 버퍼. 합의는 트립신 당신이 바로 조직을 사용하지 않을 경우에는 최대 절전 모드 E.에 처음 배치 조직보다 더 많은 가능한 세포를 얻을 사용 준비가되는 조직이며, 다음은 최대 절전 E.에있는 조직을 저장해야합니다
지금 당장 조직을 이용하려고하고 증가 가능성을 원하시면 다음과 같이 다음 이전 기계적 분쇄에 트립신과 조직을 치료 : 1) 칼슘 + + 무료 MG + + 무료 1 ML 1 ML 0.25 % 트립신 (Gibco, Invitrogen)를 희석 해부 버퍼는 15 ML 튜브 (얼음 추위를 유지)에 (최종 트립신 = 0.125 %) 2) 장소 버퍼의 조직과 8 분 ° C 37 즉시 품어, 3)을 중지 10 ML DMEM/10 % FBS를 추가 트립신 반응하고 아래 절차를 계속 진행합니다. - 1 분 1,100 rpm으로 원심 분리기 세포
- 조심스럽게 세포 펠렛에서 Aspirated 미디어
- 최대 pipetting하여 펠렛 다시 일시 중지 그것에 NMB + 요인 1 ML을 추가하고 다운
- (BD 팰컨 셀 스트레이너 40 음 나일론)에 대단히 짧은 시간을 제거하는 필터를 통해 중력의 흐름에 의해 다시 정지 세포 패스
- 카운트 및 플레이트 세포 :
- microfuge 튜브에 60 μl NMB를 추가 + 요인, 세포 현탁액 20 μl와 trypan 파랑 20 μl 다음 믹스
- hemocytometer이 솔루션을 10 μl에 대한 추가하고 살아있는 세포를 (파란색) 개수
- 2.5 농도를 조절 - 4.5 X10 6 셀 / ML
참고 : 우리는 일반적으로 약 2.5 농도 취득 - 4.5 X 106 세포 / ML 있습니다. 볼륨에 따라 전지 (일반적으로 1 ML NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex)에 resuspended 있습니다. 조직이 트립신 사용한 경우, 생산량은 가능성이 증가됩니다.
장치를 도금
- 하나로 잘 장치의 세포 (뉴런 주)로드
- 플레이트 작은 장치 당 5 μl 큰 장치 당 20 μl
참고 :이 장치의 상단과 장치의 하단 (반 전체 볼륨) 10 μl의 세포 10 μl를로드하거나, 상단 somal 우물에 세포의 직접 모든 20 μl (물론 상단 somal 5 μl 수 작은 장치에 대한). - 37 ° C 배양기에서 10 분 동안 부화하기 때문에 전지는 첨부 시작할 수 있습니다
- 물론 장치의 크기에 따라 각각 NMB의 + 요인의 약 30분의 150 μl 추가
참고 : 볼륨이 PDMS의 두께에 따라 달라질 수 있습니다. 모든 문제는 우물이 가득이다.
플라즈마 본딩없이 장치를 사용하여 보충
플라즈마 처리하지 않고, 플라즈마없이 매주 성공적으로 그것을 크리스티나 화, 기술자, 그냥 바로 세포를 로드할 수 말합니다.
소마의 측면에 모두 우물 (자네가 미디어를 남기시려면 축삭 측면은 중요하지 않습니다)에서 미디어를 해제하는 것을 잊지 말아주세요. 이것은 세포가 주요 채널을 입력할 수있는 유체 흐름의. 당신이 우물에 미디어가있다면, 당신은 유체 흐름을하지 않습니다.
Discussion
여기서 우리는 플라즈마 클리너없이 신경 microfluidic 장치를 사용하는 방법을 보여주었다. 우리는이 같은 비 - 플라즈마 결합을 참조하십시오.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you | |
| Cornig No. 1 Cover Glass | Cover Glass | Corning | Corning No. X2935 244 | Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
| 60 mm Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-13A | 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass. |
| Poly-L-Lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A |
| BD Falcon 15 ml tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
