Non-Bonding פלזמה של PDMS עבור ייצור זולה של מכשירים microfluidic

Summary

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך להשתמש במכשיר נוירון microfluidic בלי מליטה פלזמה.

Abstract

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד להשתמש במכשיר נוירון microfluidic בלי מליטה פלזמה. במקרים מסוימים זה עשוי להיות רצוי מכשירי הקשר הפיך על כוס מס '1 כיסוי קורנינג. זה יכול להיות בגלל, אולי, שואב פלזמה לא להיות זמין. במקרים אחרים, זה יכול להיות רצוי להסיר את ההתקן מן הכוס לאחר culturing של נוירונים עבור סוגים מסוימים של מיקרוסקופ או immunostaining, אם כי זה לא הכרחי כדי להסיר את ההתקן עבור immunostaining מאז הנוירונים יכול להיות מוכתם במכשיר. כמה חוקרים, עם זאת, עדיין מעדיפים להסיר את ההתקן. במקרה זה, מליטה הפיך של המכשיר כדי לכסות את הכוס עושה את זה אפשרי. יש כמה חסרונות מליטה לא פלזמה של התקנים שאינם צמודים כמו חותם נוצר. במקרים מסוימים אקסונים עשוי לגדול תחת חריצים ולא דרכם. כמו כן, בגלל הזכוכית PDMS הם הידרופובי, נוזלים לא להיכנס בקלות את המכשיר ומכריח לעתים לאלץ את התקשורת ריאגנטים אחרים לתוך המכשיר. נוזלים יכנסו למכשיר דרך פעולה נימי, אבל זה לוקח זמן רב יותר באופן משמעותי בהשוואה למכשירים שכבר פלזמה ערובה. שואב פלזמה יוצר חיובים הידרופילי זמני על הזכוכית מכשיר להקל על זרימת נוזלים דרך המכשיר לאחר מליטה בתוך שניות. עבור הלא פלזמה התקנים מחויב, זרימת הנוזל דרך המכשירים לוקח כמה דקות. כמו כן, חשוב לציין כי התקנים לשימוש עם אי - פלזמה מליטה צריכים להיות מעוקרים הראשון, בעוד מכשירים פלזמה טיפול לא צריך לעבור עיקור לפני השימוש, כי יהיה נקי פלזמה לעקר אותם.

Protocol

הכנת התקנים microfluidic עבור התרבות התא Neuron

1) ניקוי קורנינג מס '1 24 מ"מ X 40 מ"מ זכוכית שקופיות

• Sonicate שקופיות הזכוכית sonicator אמבט מים במשך 30 דקות
• שטפו את השקופיות זכוכית עם EtOH 70%
• לשטוף שקופיות שלוש פעמים עם DH ₂ O
• מגלשות יבש במנדף רקמה תרבות במשך כמה שעות, רצוי לילה

הערה: יש לנו מגשי מתכת מיוחד שאנחנו עומס עם השקופיות. השקופיות מופרדות בנפרד להציב חריצי במעמד זה מתכת. אז אנו יכולים למקם את טעינת מגשי מתכת בכלי זכוכית כי אנחנו ממלאים את המקום במים, sonicator האמבטיה במים, sonicate במשך 30 דקות. שוטף לאחר מתבצעות המנה הזו.

2) הכנת התקנים PDMS

• לגזור את התבנית PDMS מן פרוסות סיליקון סיליקון, חורים אגרוף השחקנים PDSM ורבע זה
• נקו את מכשירי PDMS ידי הראשון פיצוץ גז אינרטי (ארגון או חנקן) על פני אותם. ואז להשתמש 3M סקוטש 471 קלטת מותג להרים את כל הפסולת הנותרת

הערה: חשוב לשמור על המכשירים עם הפנים כלפי מעלה. בתחילה, כאשר אנו לגזור את PDMS ממנו פרוסות סיליקון, הצד במגע עם פרוסות סיליקון הוא הצד נקי: הוא מכיל את ערוצי microfluidic. אנחנו מנסים להיות זהירים ככל שאנחנו יכולים שלא לגרום נזק להתקן, ולשמור על פני הצד לנקות עד שאנחנו מוכנים מליטה פלזמה.

• מכשירי החיטוי במכלי פלסטיק
• לאחר, מעוקר נקי מס '1 שקופיות הזכוכית קורנינג פלזמה לטפל באמצעות מכשירים פלזמה המותג Harrick נקי, www.harrickplasma.com
• מקום המכשירים נקי בצד למטה בשקופית זכוכית.

המכשיר הוא עכשיו פלזמה מלוכדות לשקופית זכוכית.

3) לציפוי מכשירים עם פולי-L-ליזין (PLL)

• PLL מתווסף גם בכל צד של המכשיר מותר לזרום לתוך הבאר הבא

=> 150 μl של PLL של בארות גדול 30 μ l PLL עבור בארות קטנות יותר. זה לא חייב להיות מדויק כל עוד בארות מלאים.

הערה: אם אתה מסתכל על המכשיר תוכלו לראות 4 בארות: כל שני מחוברים. אתה רוצה לשים את PLL באחד היטב כך שהוא יזרום דרך המכשיר לתוך הבאר הבא.

• אפשר PLL לזרום דרך המכשיר למשך כ -10 דקות ולאחר מכן להוסיף PLL יותר את הבארות כדי למלא אותם
• מניחים את המכשירים המכיל PLL באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 4 שעות (עדיף לילה)
• אבק את PLL עודף לאחר הטיפול, אבל להיזהר לא לשאוב את כל הנוזל מתוך המכשיר

הערה: אתה לא רוצה להציג את בועות האוויר לערוצי או קאמרית. רק ואקום את PLL עודף בארות.

• הוסף autoclaved DH ₂ O היטב בכל צד של המכשיר, ואפשר לזרום גם אחר על ידי פעולה נימי

איור 1 הוא דיאגרמה של מכשיר microfluidic. שימו לב איך הכחול (סומה בצד) מחובר האדום (צד axonal) מחוברים. כאשר אנו אומרים את PLL, או מים או התקשורת, על אחד טוב בכל צד של המכשיר, למה אנחנו מתכוונים, למשל, היא: מקום 150 ul של autoclaved DH ₂ O באחד μl כחול 150 טוב, אז במקום autoclaved DH ₂ 0 האדום לתוך באר אחת. המים (או PLL, או מדיה, או תאים) יזרמו דרך המכשיר היטב המקביל אחרים.

איור 1

הערה: שים לב, מעתה ואילך, כאשר אני אומר "כלי התקשורת במקום, תאים, מים או PLL בבארות TOP", אני מתכוון בתרשים לעיל שם סומה יהיה בצד שמאל ואת האקסונים יגדל זכות.

• לשאוב את המים (שוב נזהרים שלא להסיר לחלוטין את כל הנוזלים מהמכשיר), ואז להוסיף עוד 150 μl של autoclaved DH ₂ O אחד בכל מקושר היטב ולאפשר לו לזרום אל המקביל היטב.
• הנח את מכשיר המכיל DH ₂ O באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן לחזור על השלב לשטוף שוב. שטפו את התקנים שלוש פעמים עם DH ₂ O למשך שעה אחת, שהיא בסך הכל.

הערה: בשל האפשרות כי borate מן PLL יכול לספוג לתוך PDMS, חלק ב מעבדת Jeon ממליצים דוגרים המכשירים לילה עם autoclaved DH ₂ O אחרי כמה אנישטיפות מהיר nitial. זה יבטיח כי כל borate חינם יסתננו החוצה של PDMS לפני הטעינה של התאים. אם זה לא נעשה, ייתכן שיש לשחרר borate לתוך התקשורת לאורך זמן, מה שעלול להוביל cytotoxicity.

• הוסף מדיה בסל עצבית (NBM) עם הגורמים הנדרשים (glutamax, B27, PenStrep) אל בארות העליון

הערה: התקנים ניתן מודגרות לילה ו מצופה עם תאים למחרת, או מודגרות מינימום של 3 שעות עם גורמים NMB + לפני ציפוי התאים.

הכנת הנוירונים לטעינה לתוך התקני

אנו משתמשים היום בן 18 בקליפת עוברי העכברים שאנחנו גם לקנות מחברה בשם Bits המוח או כי הוא מוכן כאן בשבילנו בקמפוס. אנו מעדיפים לקבל את הרקמה טריים.

1. השג 1 קליפת המוח של העובר (2 פיסות הרקמה) המאוחסן שינה E
2. קח 3 pipettes זכוכית ארוך אש לכל אחד מהם לתוך בגדלים קטנים יותר ברציפות באמצעות מנורת אלכוהול
3. להסיר את הרקמות של שינה E עם טפטפת זכוכית מקום 2 מ"ל של גורמים NMB + בצינור 15 מ"ל סטרילי.
4. טחינה דקה: בעזרת פיפטה הנורה וזכוכית קליפת המוח היא עברה למעלה ולמטה על 5 עד 10 פעמים. ואז, פיפטה קטן הבא משמש פיפטה במעלה ובמורד רקמות. לבסוף, פיפטה הקטן משמש פיפטה במעלה ובמורד רקמות. אנחנו רוצים לוודא שאין גושים נראים לעין.
   
   הערה: לאחרונה, החלה המעבדה Jeon השוואת תאים מרקמות מאוחסנים שינה E תאים שהוכנו מרקמות שטופלו תחילה 50% עם טריפסין 0.125% Ca + + בחינם Mg + + חוצץ לנתיחה חינם. הקונצנזוס הוא כי רקמת מוכן באמצעות טריפסין תשואה תאים קיימא יותר מאשר רקמת להציב תחילה שינה E. אם אתה לא הולך להשתמש ברקמות מיד, אז אתה צריך לאחסן את הרקמה שינה E.
   
   אם אתה הולך להשתמש ברקמות מיד רוצה כדאיות מוגברת, ואז לטפל הרקמה עם טריפסין לפני טחינה דקה מכני כדלקמן: 1) לדלל 1 מ"ל טריפסין 0.25% (Gibco, Invitrogen) עם 1 מ"ל של Ca + + חינם Mg + + חינם חיץ דיסקציה (טריפסין הסופי = 0.125%) לתוך צינור 15 מ"ל (לשמור קר קרח) 2) רקמת מקום חיץ לדגור מיד 37 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות, 3) להוסיף 10 מ"ל DMEM/10% FBS לעצור את טריפסין התגובה ולהמשיך פרוטוקול להלן.
   
   
5. צנטריפוגה תאים בסל"ד 1100 למשך דקה 1
6. התקשורת aspirated בזהירות את התא גלולה
7. הוסף 1 מ"ל של גורמים NMB + על גלולה מחדש על תנאי זה על ידי pipetting למעלה ולמטה
8. Pass מחדש תאים מושעה על ידי זרימת הכבידה דרך מסנן להסיר גושים (BD פלקון תא מסננת 40 ניילון אממ)
9. ספירת תאים בצלחת:
   • לתוך צינור microfuge, להוסיף 60 + NMB μl גורמים, 20 μl של השעיה תא, 20 μl של trypan כחול ואז לערבב
   • הוסף על μl 10 של פתרון זה hemocytometer ולספור את תאים חיים (לא כחול)
   • התאם את הריכוז 2.5-4.5 x10 ⁶ תאים / מ"ל
     
     הערה: אנו בדרך כלל לקבל ריכוז של כ 2.5-4.5 x 106 תאים / מ"ל. בהתאם לכמות התאים resuspended ב (בדרך כלל 1 מ"ל NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex). אם הרקמה הוכנה עם טריפסין, התשואה צפויה להיות מוגברת.

ציפוי התקנים

1. טען תאים (נוירונים העיקרי) לתוך אחד טוב של המכשיר
2. 5 פלייט μl לכל מכשיר קטן ו 20 μl לכל מכשיר גדול
   
   הערה: ניתן לטעון 10 μl של תאים בחלק העליון של המכשיר 10 μl על החלק התחתון של המכשיר (הנפח הכולל וחצי), או ישירות את כל 20 μl של תאים בבאר somal העליון (5 μl ב somal בראש טוב עבור מכשירים קטנים).
   
   
3. דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה כל כך התאים יכולים להתחיל לצרף
4. הוסף μl 150/30 כ גורמים NMB + זה גם תלוי בגודל המכשיר
   
   הערה: כרכים עשוי להשתנות בהתאם לעובי של PDMS. כל מה שחשוב הוא כי בארות מלאים.

משלימה על שימוש בהתקני ללא פלזמה Bonding

ללא טיפול פלזמה, כריסטינה ט"ו, טכנאי, אשר עושה זאת בהצלחה כל שבוע ללא פלזמה, אומר רק לטעון את התאים מיד.

זכור להסיר את התקשורת משני בארות בצד סומה (צד האקסון לא משנה אם אתה משאיר את התקשורת). זה זרימת נוזל המאפשר לתאים להיכנס לערוץ הראשי. אם יש לך מדיה הבארות, לא תקבל זרימת הנוזל.

Discussion

הנה הראינו כיצד להשתמש במכשיר ללא צורך נוירון microfluidic שואב פלזמה. אנו מתייחסים מליטה זה כלא פלזמה.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass	Cover Glass	Corning	Corning No. X2935 244	Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-13A	60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P-1274
BD Falcon 50 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C