Summary
Wir demonstrieren ein Protokoll, bei dem Verabreichung des genotoxischen Agens Azoxymethan (AOM) durch drei Zyklen des pro-entzündliches Mittel Dextransulfat-Natrium (DSS) rasch und konsequent befolgt erzeugt Dickdarmtumoren in Mäusen mit morphologischen und molekularen Ähnlichkeiten mit den in menschlichen ulcerosa angesehen -assoziierten Krebserkrankungen.
Abstract
Individuen mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), wie Morbus Crohn (CD) oder Colitis ulcerosa (UC) sind mit einem erhöhten Risiko der Entwicklung von Darmkrebs (CRC) über gesunden Individuen. Dieses Risiko ist proportional zur Dauer und Ausmaß der Krankheit, mit einer kumulativen Inzidenz so hoch wie 30% bei Personen mit langjähriger UC mit der weit verbreiteten Kolon Engagement. 1 Colonic Dysplasie in IBD und Colitis assoziiertem Krebs (CAC) wird angenommen, dass als Folge entwickeln von wiederholten Zyklen von Epithelzellen Verletzung und Reparatur während diese Zellen in einer chronisch entzündlichen Zytokinmilieu gebadet werden. 2 Während spontane und Colitis-assoziierten Krebserkrankungen die Qualität des Seins Adenokarzinome Aktien, wird die Reihenfolge der zugrunde liegenden molekularen Ereignisse glaubte, anders zu sein. 3 Diese Unterscheidung argumentiert, die Notwendigkeit spezifischer Tiermodelle CAC.
Mehrere Mausmodellen derzeit für das Studium der CAC existieren. Dextransulfat Natriumum (DSS), ein Mittel mit direkten toxischen Wirkungen auf das Darmepithel, können im Trinkwasser an Mäuse in mehreren Zyklen, um eine chronische entzündliche Zustand erzeugen verabreicht werden. Bei ausreichender Dauer, werden einige dieser Mäuse entwickeln Tumoren. 4 Tumor Entwicklung in diesem Modell wird beschleunigt, wenn in einer pro-karzinogene verabreicht wird. Hierzu gehören Mäuse mit genetischen Mutationen in der Tumorgenese von Pathways (APC, p53, Msh2) sowie Mäuse mit genotoxischen Agentien (Azoxymethan [AOM], 1,2-Dimethylhydrazin [DMH]). 5 vorbehandelt
Die Kombination von DSS mit AOM als Modell für Colitis assoziiertem Krebs hat Popularität für seine Reproduzierbarkeit, Potenz, niedriger Preis, und Benutzerfreundlichkeit gewonnen. Obwohl sie einen gemeinsamen Mechanismus haben, hat AOM sich als wirksamer und stabil in Lösung als DMH. Während Tumor-Entwicklung in anderen Modellen erfordert in der Regel mehrere Monate, entwickeln Mäuse mit AOM injiziert und anschließend mit DSS behandelt ausreichende Tumoren in einems weniger als 7-10 Wochen. 6, 7 Schließlich AOM und DSS kann bei Mäusen jeder genetischen Hintergrund (knock out, transgene, etc.) ohne Kreuzungen werden zu einer bestimmten tumorigenen Belastung verabreicht werden. Hier zeigen wir, ein Protokoll für die Entzündung angetriebenen Kolon Tumorgenese in Mäusen unter Verwendung einer einzigen Injektion von AOM gefolgt von drei Sieben-Tage-Zyklen von DSS über einen Zeitraum von 10 Wochen. Dieses Modell induziert Tumoren mit histologischen und molekularen Veränderungen stark ähneln denjenigen vorkommenden menschlichen CAC und bietet eine sehr wertvolles Modell für die Untersuchung von Onkogenese und Chemoprävention bei dieser Krankheit. 8
Protocol
Ein. Colitis-assoziierten Cancer Induction
- Beiseite Käfigen von Geschlecht und Alter abgestimmt 6-8 Wochen alten Mäusen für Versuchs-und Kontrollgruppen verwendet werden. Mäuse können individuell mit Schwanz Markierungen oder Ohr-Clips markiert werden.
- Am Tag 0 Rekord Baseline Gewichten und injizieren Jede Maus intraperitoneal (IP) mit 10 mg / kg des AOM funktionierende Lösung (1 mg / ml in isotonischer Kochsalzlösung, von 10 mg / ml Stammlösung in dH2O verdünnt bei -20 ° C) . Erfahrungsgemäß kann diese Dosis zwischen 7-14 mg / kg und / oder eingestellt werden wiederholt Anfang des Experiments.
Achtung: AOM ist ein flüchtiges genotoxische Agenten und sollte sorgfältig nach dem begleitenden MSDS behandelt werden. Verdünnungen sollten in einer chemischen Haube hergestellt werden, auf Eis gehalten, und verworfen folgenden Organ spezifischen Protokolle.
- Machen Sie eine 2,5% (2,5 g/100 ml) DSS-Lösung in destilliertem Wasser und durchlaufen eine 0,22 um Celluloseacetat filter durch Vakuum. Diese Dosis kann zwischen 1-3,5% je nach Mausstamm und Umwelt angepasst werden. Einmal hergestellt, DSS-Lösung kann im Kühlschrank aufbewahrt werden bis zu 1 Woche.
- Am Tag 7 Versorgung DSS-Lösung, um Mäuse als Trinkwasser. Etwa 250 ml / Käfig wird jedes Mal neue DSS für maximal 5 Mäuse / Käfig vorgesehen ist, benötigt werden, jedoch sind diese nur Schätzungen und variieren je nach Art der Wasser-Flaschen in Ihrem Tierhaltung verwendet.
- Um eine kontinuierliche Versorgung der DSS für sieben Tage bereitzustellen, sollten DSS-Lösung in saubere Flaschen dreimal (alle 2-3 Tage) während dieser Zeit ausgetauscht werden. Einige Forscher messen die Menge der DSS vor dem Austausch mit neuen Lösung als Maß der Belastung verbraucht.
- Am Tag 14, schalten Käfige zurück zu Standard Trinkwasser für zwei Wochen.
- Wiederholen der Schritte (1.4) - (1.6) an den Tagen 28 und 49, um einen zweiten und dritten Zyklus der DSS. Ein DSS "Zyklus" besteht aus einer Woche DSS im Trinkwassergefolgt von 2 Wochen regelmäßiger (autoklaviert) Wasser.
2. Clinical Assessment Colitis und Tumorprogression
- Mäuse sollten gewogen / beobachtet werden 2-3 mal pro Woche. Gewichtsverlust in Prozent im Vergleich zum Ausgangswert wird als Surrogat Maßnahme von Colitis Schweregrad eingesetzt. Regelmäßige Bewertungen der rektalen Blutungen, Durchfall oder Prolaps kann man je nach experimentellen Ziele und berichtet werden nach verschiedenen Scoring-Systeme. 9, 10
- Ein Gewichtsverlust von bis zu 10% mit 2-3 Tagen Durchfall und rektale Blutungen können in der Woche nach einem vollen Zyklus der DSS (tägliche Beobachtung kann während dieser Zeit unmittelbar nach dem DSS Zeitraum nützlich) erwartet werden.
Es ist möglich, dass einige Mäuse können nicht wiederhergestellt werden; Mäusen verlieren größer als 20% ihres Gewichtes sind weniger wahrscheinlich, überleben und können frühe Euthanasie erfordern. Eine einzelne IP-Injektion von 0,5 - 1,0 ml Kochsalzlösung in solchen Mäusen kann eine nützliche unterstützende Maßnahme zur Korrektur flui d Volumen verloren aufgrund von Durchfall.
3. Murine Endoskopie (Optional)
- Endoskopie nach dem zweiten oder dritten Zyklus der DSS kann durchgeführt werden, um das Tumorwachstum in vivo vor der Tötung zu bestätigen. Da die AOM / DSS Modell ist recht zuverlässig in produzierenden Tumoren, ist dieser Schritt in der Regel nicht erforderlich. Nur ein paar Mäuse sollte unter Verwendung dieser Methode, da sie das Potenzial, Mäusetumoren stören muss. 11
- Anesthetize die Maus mit inhalativen oder injizierbare Sedierung.
- Nach Maus betäubt, sichern Sie die Maus auf einer flachen Platte mit Klebeband am Schwanz und Brust.
- Schieben Sie den Maus-Endoskop in die Maus Mastdarm vorsichtig mit Kochsalzlösung zu füllen und zu bewässern, um intraluminale Sicht zu verbessern und zu entfernen fäkale Inhalt. (Beachte, dass die Endoskopie können auch mit Lufteinblaseinrichtung als Alternative zu Kochsalzlösung und dieser Technik werden kann bieten eine verbesserte Visualisierung des Tumors. 12)
- Am Tag 70, sollte jeder AOM / DSS behandelten Maus beherbergen mehrere Kolontumoren und bereit sein, für die Beurteilung. Dieses Datum kann verzögert Wochen bis Monate, wenn größere Tumoren gewünscht werden. (Zu beachten ist, können Mäuse mit schwerer rektale vorgefallene müssen früh eingeschläfert werden, um übermäßige Schmerzen zu Tieren vermeiden, da pro institutionellen animal care Ausschüsse.)
- Vor seziert, individuell einschläfern Mäuse mit Isofluran und Genickbruch (oder andere institutionell anerkannte Methode). Endgewicht und andere Messungen kann zu diesem Zeitpunkt vorgenommen werden.
- Legen Sie die Maus mit ihrer Bauchseite auf ein Schneidebrett ausgesetzt. Bedecken Sie den Bauch mit 70% Ethanol, um Haare verunreinigen die Bauch-Inhalte während der Extraktion des Dickdarms verhindern.
- Verwenden einer Pinzette, um die Mittellinie des Bauches zu erfassen und einen kleinen Einschnitt, um das Bauchfell aussetzen.
- Erweitern diese Schnitt auf jeder Seite des Bauches entlang der Küsten margin.
- Mit einer Schere durch das Becken so geschnitten, dass der Darm kann bis zum anorektalen Übergang geerntet werden. Dies ist wichtig, da DSS ulcerosa Schädigung am größten ist an der distalen Rektum und dementsprechend ist dies der Bereich größter Tumorentwicklung.
- Zusätzliche Geweben wie mesenterischen Lymphknoten kann ebenfalls zu diesem Zeitpunkt geerntet werden.
5. Vorbereiten des Colon für makroskopische Analyse
- Mit einer 18G Magensonde Nadel an einer 5-ml-Spritze, spülen Sie den Doppelpunkt mit eiskaltem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), so dass Flüssigkeit austritt in der physiologischen Richtung. Wenn Kolongewebe für RNA oder Protein-basierte Analyse verwendet wird, kann sie durch Einsatz gehalten vorgekühlte Arbeit Trays kalt werden.
- Öffnen Sie die gespülten Darm längs sein Mesenterium und Farbe auf den kalten Fach. Tumoren sind einfach visualisiert, wenn der Doppelpunkt auf eine dunkle Oberfläche platziert wird. Alternativ kann 1% Alcian blauen Farbstoff angewendet t hervorzuhebenumors. Bewerten Tumors Anzahl und Größe mit einem Lineal oder digitalen Messschieber.
- Kleine Abschnitte des Tumors und benachbarten normalen Gewebe kann zu diesem Zeitpunkt für eine zukünftige Analyse werden durch RNA-, Protein oder immunhistochemische (IHC) Methoden ausgeschnitten, so dass einige Teil des verbleibenden Dickdarms zur histologischen Beurteilung.
Digitale Fotografie der Brutto-Darm-Proben unmittelbar nach dem Schritt 5,2 hilfreich sein kann für eine präzise Analyse der Tumorlast, vor allem, wenn wesentliche Teile der Doppelpunkte für andere Formen der Analyse ausgeschnitten wie oben beschrieben. Tumorlast (%) kann als Tumor-Währungsgebiet / insgesamt Darm-Bereich mit freier Software wie ImageJ berechnet werden.
6. Vorbereiten des Colon für die histologische Beurteilung
- Übernehmen 10% Formalin, um die restlichen Doppelpunkt auf dem kalten Behälter über eine Spritze oder einen Finger. Wodurch das Gewebe für mindestens 30 sec auf diese Weise erleichtert die Übertragung zu fixieren, um die Fixierung Becken. Stellen Sie sicher, restliche Formalin ist wiped off vor dem Lackieren eine neue eröffnet Doppelpunkt auf dem gleichen Tablett.
- Übertragen Doppelpunkte in ein Becken mit 10% Formalin gefüllt und festzunageln an den Rändern.
- Nach 3 Stunden der Fixierung, zu übertragen Doppelpunkte bis 70% Ethanol. Doppelpunkte kann in 70% Ethanol unbegrenzt beibehalten.
- Drei Längsschnitte Doppelpunkt (proximal, Mitte, distal / Rektum) kann in 2% Agar stabilisiert werden und von Paraffineinbettung. Sicherzustellen, dass die proximalen und distalen Kolons Kolon / Rektum ausgerichtet sind einheitlich für jede Maus.
- Dysplasie, Krypta Schäden und Entzündungen können beschrieben und von einer erfahrenen Person beurteilt werden nach zuvor veröffentlichten Protokollen. 10, 13-15 Mäuse kann vor Tag 70 geopfert werden, wenn der Experimentator in Früherkennung dysplastischen Veranstaltungen interessiert ist.
7. Repräsentative Ergebnisse
Der AOM / DSS-Modell beschrieben erlaubt dem Forscher, um zuverlässig zu generieren Darm-Tumoren in Mäusen.Tumorwachstum in diesem Modell wird direkt durch den zugehörigen Entzündungsprozess beeinflusst. Colitis Schwere sollte klinisch nach Gewichtsverlust und das Vorhandensein von Durchfall / Hämatochezie (Abbildung 2) überwacht werden. Diese Zeichen der Krankheitsaktivität neigen dazu, von Tag 5 des DSS-Zyklus und für vier oder mehr Tage beginnen, nachdem DSS entfernt wird. Selten können Mäuse mit einer signifikanten rektale Tumorlast zu entwickeln Rektumprolaps. Nach dem zweiten oder dritten DSS-Zyklus Durchfall kann sich hartnäckig. Typischerweise Tumoren vorhanden sind und identifizierbar durch murine Koloskopie vor dem dritten Zyklus der DSS (Abbildung 3). Zusätzliche Zeit und einen dritten Verlauf DSS bewirkt größere Tumore zum Zeitpunkt der Ernte (Abbildung 4). Verwenden von topisch applizierten Alcianblau Beize verwendet werden, um Tumore (Abbildung 5) hervorzuheben. Photographien von Dickdarmtumoren in Erzeugen Tumormessungen die verwendet werden können, um quantitativ zu unterstützen vergleiche Tumor Produktion und Größezwischen experimentellen Gruppen (Abbildung 6). Fixierten und in Paraffin eingebetteten Doppelpunkt Proben können dann für die Histologie oder mit der Verwendung von immunhistochemischen (Abbildung 7 und 8) ausgewertet werden.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des AOM und DSS Verwaltung. AOM (10 mg / kg) wird am Tag 0 injiziert. Zu Beginn der zweiten Woche (Tag 7), wurde mit 2,5% DSS-Lösung an Mäuse in ihrem Trinkwasser verabreicht. Sieben Tage von DSS wird von zwei Wochen der autoklavierten Wasser. Zwei weitere Zyklen von DSS sind vor der Tötung verabreicht werden.
Abbildung 2. Mausgewicht im Vergleich zum Ausgangswert bei der AOM-und DSS-Verwaltung. Beachten Sie, dass in der Woche nach jeder DSS-Zyklus, Mäuse los e 5-10% ihres Körpergewichts. Gewichtsverlust in diesem Experiment ist ein Surrogat-Marker für Colitis Schweregrad.
Abbildung 3. Von Tumoren anzeigen in distalen Kolon über murine Endoskopie am Tag 50 von AOM / DSS Behandlung. Man beachte die mehrfache polypoide Massen Behinderung der Lumen des distalen Kolon (b, c) im Vergleich zur normalen Kolon (a).
Abbildung 4. Longitudinally eröffnet Maus Doppelpunkt Veranschaulichung grobe Auftreten von Tumoren. Beachten die höhere Tumorlast im distalen Kolon / Rektum (linken oberen Bild), und die charakteristische rugated Textur des proximalen Kolon (rechts oberen Bild) mit wenig Tumorwachstum. Eine Nahaufnahme des distalen Kolon zeigt zahlreiche Tumoren in verschiedenen Größen (siehe unten).
Abbildung 5. Tumoren durch Anwendung Alcianblau markiert Fleck. Man beachte, wie der Farbstoff die normale Textur der Darm sowie die Grenzen jedes einzelnen Tumors betont. Solche Färbung kann hilfreich sein, in der genauen Messung von Tumor Gebieten Lineal oder digitale Messung.
Abbildung 6. Repräsentative Verteilung der durchschnittlichen Anzahl von Tumoren pro Maus mit AOM / DSS behandelt. Man beachte die Mehrzahl der Tumoren im distalen Kolon befinden und <2 mm Größe.
Abbildung 7. Paraffin eingebetteten Längsschnitte Doppelpunkt in Kassette (oben) eind auf Schlitten nach H & E-Färbung (unten). Beachten Sie, dass Rest-Alcianblau Fleck nicht mit H & E-Färbung stören. Ein großer Tumor auf der Folie Bild (eingekreist) eingekreist. Die Bezeichnungen "distal", "Mitte" und "proximal" Ergebnis aus Schneiden den gesamten Dickdarm in Terzen zwischen dem Blinddarm und Anus.
Abbildung 8. Repräsentative Histologie des Tumors durch AOM / DSS Verabreichung im distalen Colon. H & E, BrdU und β-Catenin gefärbten Objektträger bei 50X (oben) und 400X (Bodenplatte) bzw. demonstrieren dysplastische Veränderungen ähnlich dem menschlichen Adenokarzinomen des Dickdarms.
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Discussion
Behandlung von Mäusen mit AOM und DSS rasch und wirksam Modelle menschlichen ulcerosa-assoziierten Krebses. Hypothesen bezüglich erbliche Faktoren, Colitis-assoziierten Krebsarten kann leicht mit gentechnisch veränderten Mäusen studiert werden. 13, 16 Alternativ kann die pharmakologische Wirkung von Targets in ulcerosa-assoziiertem Krebs durch Verwendung Wildtyp-Mäuse können studiert werden.
Während dieses Modell wird von Interessenten in der Studie von Kolontumor Entwicklung in der Einstellung der Entzündung geschätztes bestehen Einschränkungen. Das Ausmaß der Krankheit in Mäusen in diesem Modell beobachtet variieren erheblich, je nachdem Mausstamm und Wohnverhältnisse (Käfighaltung, Fütterung, Mikroflora, etc.). Suzuki et. al, daß Balb / c-Mäusen am empfindlichsten auf AOM / DSS, gefolgt von waren (in der Reihenfolge abnehmender Tumorinzidenz und Vielheit) C57BL/6N, C3H/HeN und DBA/2N Mäusen. 17 Experimente mit DSS und AOM allein in 129 / Sv Mäusen vorhersagen würde einen ModusFrequenzanpassung um kombinierte Behandlung, ähnlich C57/BL6J Mäusen 18, 19. Daher kann Pilotversuche notwendig sein, um die wirksamsten Dosierung Protokollen abhängig von der verfügbaren Einrichtungen und Ressourcen zu bestimmen. Während AOM / DSS Tumoren im Darm menschliche Darmkrebs ähneln histologisch, sie zeigen selten Metastasen. Auf molekularer Ebene wurden Änderungen in β-Catenin, COX-2 und iNOS, aber nicht p53 berichtet. 20 Kanneganti et. al. bietet einen umfassenden Überblick über alternative Modelle für die Induktion der CAC für Interessierte. 5
Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erhöhen, empfehlen wir, dass die Mäuse unterschiedlichen genetischen Hintergründen (wie WT und genspezifischen knock out Mäuse) in einem spezifischen Pathogen freien (SPF)-Anlage 3-4 Wochen vor Beginn Experiment werden zusammen eingesperrt, das ist besonders wichtig, wenn Mäuse sind neu von einer kommerziellen Zuchtanlage geliefert. Obwohl jedes Geschlecht und Alter passende Mäuse können verwendet werden, we haben die meisten konsistente Ergebnisse mit allen weiblichen Mäusen beobachtet. AOM Stammlösungen sollten nicht verwendet werden, wenn älter als ein Jahr sein, und es ist wichtig zu mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen dieser Lösungen zu vermeiden. Colitis Schweregrad kann durch die Art der Maus Futtermittel verwendet als auch DSS in Mitleidenschaft gezogen werden, sollten diese Faktoren konsistent gehalten zwischen den Experimenten werden. Wir haben Trübung in DSS Flaschen in Mäusekäfige für lange Zeiträume (> 4 Tage) hindeuten Kontamination links beobachtet, daher Kühlen und Herstellen frischer DSS zu Beginn jeder Verabreichung wird diese Komplikation zu vermeiden. Wenn einige Tumoren entwickeln oder Mäuse sterben vorzeitig, Neufert et. al. in ihrer AOM / DSS-Protokoll Zusammenfassend bieten eine ausgezeichnete Tabelle der Fehlerbehebung. 6
Sobald das AOM / DSS Technik für die Entwicklung einer Kolitis-assoziierten Krebses beherrscht wird, können verschiedene zusätzliche Untersuchungen dieser Mäuse durchgeführt. Werden 21 Die Expression von KandidatenGene können in Tumor vs Tumor-freien Abschnitten des Dickdarms mittels quantitativer PCR-Amplifikation der extrahierten RNA untersucht werden. Da DSS sich mit diesem Prozess stören können, empfehlen wir Poly-A-Reinigung vor der Verstärkung. 22 Teile des Dickdarms können schockgefroren, um für die Proteinexpression mittels Western Blot untersucht werden können. Ermittler von Colitis-assoziierten Krebserkrankungen können visuelle Marker der Zellproliferation interessiert sein. Zu diesem Zweck kann AOM / DSS behandelten Mäusen mit Bromdesoxyuridin (BrdU) 90 min vor der Tötung injiziert werden; Immunhistochemie für diese Kerne markierten Dokumenten auch den Bereichen, in den Dickdarm mit der größten Epithelproliferation sowohl innerhalb Tumor und tumorfrei Abschnitte. 23
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch DK089016 und L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS) und P30-DK52574 (der Washington University Digestive Diseases Forschung Core) finanziert. AIT war ein Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma Aldrich | A5486-100MG | Stock solution: dilute to 10 mg/ml in distilled water to be kept at -20 °C as 0.5 - 1 ml aliquots. Working solution: dilute stock to 1 mg/ml in isotonic (0.9%) saline |
| Dextran Sulfate Sodium (DSS) | TdB Consultancy | DB001 | MW 40 kDa (36-50 kDa preparations from other sources are acceptable; The same lot should be used for a single experiment)6 |
| Coloview miniendoscopic system | Karl Storz | Multiple | See Becker et al. for detailed explanation of equipment and setup.11 |
| TPP Rapid FILTERMAX 500 ml Bottle-Filter, 0.22 μm PES | Midwest Scientific | TP99500 | Any standard tissue culture filter is acceptable |
| Ethyl Alcohol 200 Proof ASC/USP | Pharmaco-AAPER (or other) | 11ACS200 | Dilute to 70% in distilled water |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 4029405 | Place mouse in glass jar with gauze or a small cloth soaked in anesthetic |
| 18G Straight Gavage Needle | Braintree Scientific | N-008 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | Dilute to 1X (0.01 M) in distilled water |
| Cold Tray (Tissue Tek II Cold Plate) | Fisher Scientific | NC9491941 | Store at -20 °C |
| ImageJ Software | NIH (free download) | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Scientific | F79-500 | Dilute to 10% in PBS |
| BD Bacto Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Use hotplate to create 2% solution in distilled water |
| Miltex Eye Dressing Forceps | MedPlus Inc. | 18-780 | |
| Miltex Eye Scissors | MedPlus Inc. | 18-1430 | Curved points prevent damage to colon during opening. |
| Alcian Blue 8GX (powder) | Sigma Aldrich | A5268 | Add 1 g powder to 100 ml 3% acetic acid (3 ml glacial acetic acid + 97 ml distilled water) |
| 1 mL Tuberculin syringe with attached 26 G x 3/8 in intradermal bevel needle | BD | 305946 | For injection of AOM |
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