Summary
Vi viser en protokol, hvor administration af genotoksisk stof azoxymethane (AOM) efterfulgt af tre cyklusser af det pro-inflammatoriske middel dextransulfat-natrium (DSS) hurtigt og konsekvent frembringer colontumorer hos mus med morfologiske og molekylære lighed med dem, der ses i human colitis -associeret cancer.
Abstract
Personer med inflammatorisk tarmsygdom (IBD), såsom Crohns sygdom (CD) eller colitis ulcerosa (UC) er i øget risiko for at udvikle kolorektal cancer (CRC) over raske personer. Denne risiko er proportional med varigheden og omfanget af sygdom, med en kumulativ incidens så høj som 30% hos individer med langvarige UC med udbredt colon engagement. 1 Colonic dysplasi i IBD og colitis associeret cancer (CAC) menes at udvikle sig som et resultat af gentagne cykler af epitelial-celle skade og reparation, mens disse celler bades i en kronisk inflammatorisk cytokin miljø. 2 Mens spontane og colitis-associerede cancere deler kvalitet er adenocarcinomer er sekvensen af de underliggende molekylære begivenheder menes at være anderledes. 3. Denne skelnen argumenterer behovet for specifikke dyremodeller for CAC.
Adskillige musemodeller øjeblikket findes for studiet af CAC. Dextransulfat Sodium (DSS), et middel med direkte toksiske virkninger på tyktarmsepitel, kan indgives i drikkevand til mus i flere cyklusser for at skabe en kronisk inflammatorisk tilstand. Med tilstrækkelig varighed, vil nogle af disse mus udvikler tumorer. Fire tumorudviklingen er fremskyndes i denne model hvis den gives i en pro-kræftfremkaldende indstilling. Disse omfatter mus med genetiske mutationer i tumorigenese pathways (APC, p53, MSH2), såvel som mus forbehandlet med genotoksiske midler (azoxymethane [AOM], 1,2-dimethylhydrazin [DMH]). Fem
Kombinationen af DSS med AOM som en model for colitis associeret cancer har vundet popularitet for sin reproducerbarhed, styrke, lav pris, og brugervenlighed. Selv om de har en fælles mekanisme, der AOM vist sig at være mere potente og stabile i opløsning end DMH. Mens tumorudvikling hos andre modeller kræver almindeligvis flere måneder, mus injiceret med AOM og efterfølgende behandlet med DSS udvikle passende tumorer i ens lidt som 7-10 uger. 6, 7 Endelig AOM og DSS kan administreres til mus af alle genetiske baggrund (knock out, transgene osv.) uden krydsning til en specifik tumorigen stamme. Her viser vi en protokol for inflammation drevet colon tumorigenese i mus under anvendelse af en enkelt injektion af AOM efterfulgt af tre syv-dages cyklusser af DSS over en 10 ugers periode. Denne model fremkalder tumorer med histologiske og molekylære forandringer ligger tæt op ad dem, der forekommer i human CAC og giver en meget værdifuld model til undersøgelse af onkogenese og chemoprevention i denne sygdom. 8
Protocol
1. Colitis-associeret cancerinduktion
- Braklægning bure af køn og alder-matchede 6-8 uger gamle mus, der skal anvendes til forsøg og kontrol grupper. Mus kan individuelt mærket med hale markeringer eller øreclips.
- På dag 0, optage baseline vægt og injicere hver mus intraperitonealt (IP) med 10 mg / kg af AOM arbejdsopløsning (1 mg / ml i isotonisk saltvand, fortyndet fra 10 mg / ml stamopløsning i dH2O opbevares ved -20 grader C) . Baseret på erfaring, kan denne dosis justeres mellem 7-14 mg / kg og / eller gentagne tidligt i eksperimentet.
Forsigtig: AOM er en flygtig genotoksisk stof og skal håndteres forsigtigt i henhold til den medfølgende MSDS. Fortyndinger bør udarbejdes i et kemisk hætte, holdes på is, og kasseret efter institution særlige protokoller.
- Foretag en 2,5% (2,5 g/100 ml) DSS opløsning i destilleret vand og ledes gennem en 0,22 um celluloseacetat filter med vakuum. Denne dosis kan justeres mellem 1-3,5% afhængig musestamme og miljø. De tilberedte DSS opløsning kan opbevares nedkølet i op til 1 uge.
- På dag 7, supply DSS løsning til mus som deres drikkevand. Ca. 250 ml / bur vil være behov for hver gang ny DSS er fastsat et maksimum på 5 mus / bur, men det er kun skøn, og vil variere afhængig af typen af vandflasker, der anvendes i dit dyr facilitet.
- At give en kontinuerlig tilførsel af DSS i syv dage, bør DSS løsning udskiftes i rene flasker tre gange (hver 2-3 dage) i denne periode. Nogle efterforskere måle mængden af DSS forbruges før udskiftning med en ny løsning som et mål for eksponering.
- På dag 14, skifte bure tilbage til standard drikkevand i to uger.
- Gentag trin (1,4) - (1,6) på dag 28 og 49 for at tilvejebringe en anden og tredje cyklus af DSS. En DSS "cyklus" består af en uges DSS i drikkevandetefterfulgt af 2 ugers regelmæssig (autoklaveret) vand.
2. Klinisk vurdering Colitis og tumorprogression
- Mus vejes / observeret 2-3 gange om ugen. Procent vægttab i forhold til baseline anvendes som et surrogat mål for colitis sværhedsgrad. Regelmæssige vurderinger af rektal blødning, diarré, eller prolaps kan gøres afhængig af eksperimentelle mål og rapporteres i henhold til forskellige pointsystemer. 9, 10
- Et vægttab på op til 10% sammen med 2-3 dages diarre og rektal blødning kan forventes i ugen efter en fuld cyklus af DSS (daglig observation kan være nyttige i denne umiddelbart efter DSS periode).
Det er muligt, at nogle mus muligvis ikke får, mus mister mere end 20% af deres vægt er mindre tilbøjelige til at overleve og kan kræve tidlig eutanasi. En enkelt IP-injektion på 0,5 - 1,0 ml saltvand i sådanne mus kan være en nyttig understøttende foranstaltning retning af at korrigere flui d volumen tabt på grund af diarré.
3. Murine Endoskopi (valgfri)
- Endoskopi efter den anden eller tredje cyklus af DSS kan udføres for at bekræfte tumorvækst in vivo før aflivning. Som AOM / DSS model er helt pålidelige i produktion af tumorer, dette trin i almindelighed ikke nødvendigt. Kun et par mus bør vurderes ved hjælp af denne metode, da det har potentiale til at forstyrre musetumorer. 11
- Anesthetize musen med inhaleret eller injicerbar sedation.
- Efter mus er bedøvet, sikre musen til et fladt bræt med tape på halen og brystet.
- Før murine endoskop i musen endetarmen forsigtigt ved hjælp af saltvand for at oppuste og overrisle at forbedre intraluminal visning og fjerne fækale indhold. (Bemærk, at endoskopi kan også udføres under anvendelse af luft insufflation som et alternativ til saltvand og denne teknik kan tilbyde forbedret visualisering af tumoren. 12)
- På dag 70, skal hver AOM / DSS behandlet mus harbor flere colontumorer og være klar til bedømmelse. Denne dato kan blive forsinket uger til måneder, hvis større tumorer ønskes. (Det skal bemærkes, kan mus med svær diskusprolaps rektal skal aflives tidligt for at undgå overdreven gene for dyrene som pr institutionelle dyrene passes udvalg.)
- Forud for obduktion, individuelt aflive mus med isofluran og cervikal dislokation (eller en anden institutionel-godkendt metode). Slutvægt og andre målinger kan foretages på dette tidspunkt.
- Læg musen med sin ventrale side eksponeret på et skærebræt. Dække underlivet med 70% ethanol for at forhindre hår i at kontaminere de abdominale indhold under ekstraktion af tyktarmen.
- Pincet for forstå midterlinjen af maven og lave et lille snit for at blotlægge peritoneum.
- Forlænge dette snit på hver side af underlivet langs costal Margin.
- Bruge saks til at klippe gennem bækkenet, således at colon kan høstes ned til anorektal junction. Dette er vigtigt, fordi DSS colitis skade er størst ved den distale rektum og tilsvarende, er området af størst tumorudvikling.
- Yderligere væv, såsom mesenteriske lymfeknuder kan også høstes på dette tidspunkt.
5. Klargøring af Colon for Makroskopisk Analysis
- Under anvendelse af en 18G gavage nål fastgjort til en 5 ml sprøjte, colon skylles med iskold phosphatpufret saltvand (PBS), således at væske kommer ud i det fysiologiske retning. Hvis tyktarmen væv vil blive anvendt til RNA eller protein-baseret analyse, kan den holdes kold ved anvendelse af præ-kølet arbejde bakker.
- Åbne flushed colon længderetningen langs sin mesenterium og maling på den kolde bakke. Tumorer er lettere visualiseres, når tyktarmen placeres på en mørk overflade. Alternativt kan 1% Alcian blåt farvestof skal anvendes til at fremhæve tumors. Vurdere tumor antal og størrelse med en lineal eller digital skydelære.
- Mindre dele af tumoren og det tilstødende normale væv kan udskæres ved dette punkt til senere analyse af RNA, protein eller immunohistokemiske (IHC) metoder, hvorved en del af det resterende colon til histologisk vurdering.
Digital fotografering af brutto colon prøver umiddelbart efter trin 5,2 kan være nyttigt for præcis analyse af tumor byrde, især hvis væsentlige dele af kolon, udskæres til andre former for analyse som beskrevet ovenfor. Tumorbyrde (%) kan beregnes som tumor område / totalt colon areal ved hjælp af gratis software som ImageJ.
6. Klargøring af Colon for histologisk vurdering
- Anvendes 10% formalin til den resterende colon på den kolde bakke via sprøjte eller finger. Tillade vævet at fastsætte i mindst 30 sekunder på denne måde letter overførsel til fiksering bassinet. Sikre resterende formalin er WIPed off forud for maling af en ny åbnet kolon på den samme bakke.
- Overfør koloner til et bassin fyldt med 10% formalin og pin ned på kanterne.
- Efter 3 timer til optagelse, overfører koloner til 70% ethanol. Koloner kan opbevares i 70% ethanol på ubestemt tid.
- Tre længdesnit af kolon (proksimal, mid, distal / endetarm) kan stabiliseres i 2% agar og forelægges til paraffin indlejring. At sikre, at den proximale colon og distal colon / rectum er orienteret på samme måde for hver mus.
- Dysplasi, crypt skader, og betændelse kan beskrives og vurderes af en erfaren person i henhold til tidligere offentliggjorte protokoller. 10, kan 13-15 Mus må ofres før dag 70, hvis forsøgslederen er interesseret i at opdage tidlige dysplastiske begivenheder.
7. Repræsentative resultater
Den AOM / DSS-model beskrevet heri tillader forskeren til pålideligt at generere colontumorer hos mus.Tumorvækst i denne model er direkte påvirket af den tilhørende inflammatorisk proces. Colitis sværhedsgrad skal monitoreres klinisk ved at følge vægttab og tilstedeværelse af diarré / hematochezia (fig. 2). Disse tegn på sygdom aktivitet tendens til at begynde på dag 5 i DSS cyklus og for fire eller flere dage efter DSS er fjernet. Sjældent, kan mus med en betydelig rektal tumorbyrde udvikle rektal prolaps. Efter den anden eller tredje DSS cyklus diarré kan blive vedholdende. Typisk tumorer er til stede og kan identificeres af murine koloskopi inden den tredje cyklus af DSS (figur 3). Yderligere tid og en tredje forløb DSS resulterer i større tumorer på tidspunktet for høst (figur 4). Anvendelse af lokalt anvendt Alcian Blue farvning kan anvendes til at fremhæve tumorer (figur 5). Fotografier af colon tumorer vil hjælpe til at generere tumormålinger som kan anvendes til kvantitativt at sammenligne tumor-produktion og størrelsenmellem forsøgsgrupper (fig. 6). Faste og paraffinindlejret kolon prøver kan derefter undersøges for histologi eller ved hjælp af immunohistokemisk farvning (fig. 7 og 8).
Figur 1. Skematisk af AOM og DSS administration. AOM (10 mg / kg) injiceres på dag 0.. Ved begyndelsen af den anden uge (dag 7), er 2,5% DSS opløsning administreres til mus i deres drikkevand. Syv dage efter DSS efterfølges af to ugers autoklaveret vand. Yderligere to cyklusser af DSS administreres før aflivning.
Figur 2. Mouse vægt i forhold til baseline i løbet af AOM og DSS administration. Bemærk, at i ugen efter hver DSS cyklus, mus los e 5-10% af deres kropsvægt. Vægttab ved dette forsøg er en surrogatmarkør for colitis sværhedsgrad.
Figur 3. View af tumorer i distal colon via murin endoskopi på dag 50 i AOM / DSS behandling. Bemærk de multiple polypoid masser hæmmede lumen af den distale colon (b, c) i sammenligning med den normal colon (a).
Fig. 4. Vandret åbnet muse colon illustrerer grov forekomsten af tumorer. Bemærk den højere tumorbelastning i den distale colon / rectum (øverste venstre billede), og den karakteristiske rugated tekstur af den proximale colon (højre øverste billede) med lille tumorvækst. Et nærbillede af den distale colon viser mange tumorer af forskellig størrelse (nedenfor).
Figur 5. Tumorer fremhævet ved anvendelse af Alcian blåsplint. Bemærk hvordan farvestoffet understreger den normale struktur af tyktarmen såvel som grænser enkelte tumor. En sådan farvning kan være nyttig i den præcise måling af tumor områder ved lineal eller digital måling.
Figur 6. Repræsentativ fordeling af det gennemsnitlige antal tumorer per mus behandlet med AOM / DSS. Bemærk de fleste tumorer er placeret i den distale colon og er <2 mm i størrelse.
Figur 7. Paraffinindlejret længdesnit af colon i kassetten (ovenfor) end på dias efter H & E stain (nedenfor). Bemærk, at resterende Alcian Blue farvning ikke interfererer med H & E farvning. En stor tumor er omgivet på lysbillede (i cirkel). Betegnelserne "distal", "middle" og "proximal" Resultat af sektionering hele tyktarmen i tredjedele mellem coecum og anus.
Figur 8. Repræsentant histologi af en tumor som følge af AOM / DSS administration i den distale colon. H & E, BrdU, og β-catenin farvede objektglas ved 50X (toppanel) og 400X (bundpanel) henholdsvis viser dysplastiske ændringer svarende til humane adenocarcinomer i colon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behandling af mus med AOM og DSS hurtigt og effektivt modeller human colitis-associeret cancer. Hypoteser vedrørende arvelige faktorer, colitis-associerede cancere er let studeret med genetisk modificerede mus. 13, 16 Alternativt kan virkningen af farmakologiske mål i colitis-associeret cancer blive undersøgt ved anvendelse af vild-type mus.
Mens denne model er stærkt værdsat af dem interesseret i studiet af colontumor udvikling i fastsættelsen af inflammation, findes der begrænsninger. Omfanget af sygdom hos mus i denne model kan variere betydeligt afhængigt musestamme og boligforhold (anbringelse i bur, fodring, mikrobiota osv.). Suzuki et. al rapporterede, at Balb / c mus var mest følsomme over for AOM / DSS, efterfulgt af (i rækkefølge faldende tumorhyppighed og multiplicitet) C57BL/6N, C3H/HeN og DBA/2N mus. 17 Eksperimenter med DSS og AOM alene i 129 / sv mus ville forudsige en tilstandrate respons på kombineret behandling, svarende til C57/BL6J mus 18, 19. Derfor kan pilotforsøg være nødvendigt at bestemme de mest effektive dosering protokoller afhængigt af tilgængelige faciliteter og ressourcer. Mens AOM / DSS tumorer i tyktarmen ligne menneskelige tyktarms-og endetarmskræft histologisk, de sjældent udviser metastaser. På molekylært niveau er ændringer i β-catenin, COX-2, og iNOS, men ikke p53 blevet rapporteret. 20 Kanneganti et. al. giver en grundig oversigt over alternative modeller for induktion af CAC for de interesserede. 5
For at øge reproducerbarheden af resultater, anbefaler vi, at mus af forskellige genetiske baggrunde (såsom WT og genspecifik knock out mus) co-bur i en SPF (SPF) facilitet 3-4 uger før eksperimentere start; dette er især vigtigt, hvis mus er nyligt leveret fra et kommercielt opdræt facilitet. Selvom enhver køn og alder-matchede mus kan anvendes, we har iagttaget de mest konsistente resultater med alle hunmus. AOM stamopløsninger bør ikke anvendes, hvis ældre end et år, og det er vigtigt at undgå gentagne fryse-tø cykler af disse opløsninger. Colitis sværhedsgrad kan påvirkes af den type mus foder, der anvendes, samt DSS kilde, og disse faktorer bør holdes konsistent mellem forsøgene. Vi har observeret turbiditet i DSS flasker tilbage i muse bure i lange perioder (> 4 dage), der tyder på forurening, og derfor køle og forberede friske DSS ved starten af hver administration vil undgå denne komplikation. Hvis nogle tumorer udvikle eller mus dør for tidligt, Neufert et. al. i deres AOM / DSS protokol resumé giver en fremragende oversigt over fejlfinding rådgivning. 6
Når AOM / DSS teknik til udvikling af colitis-associeret cancer beherskes, kan forskellige yderligere undersøgelser af disse mus udføres. 21. ekspression af kandidatgener kan undersøges i tumor vs tumorfri dele af kolon via kvantitativ PCR-amplifikation af ekstraherede RNA. Fordi DSS selv kan påvirke denne proces, anbefales poly-A-oprensning før amplifikation. 22 Dele af colon kan være lynfrosset skal undersøges for proteinekspression ved western blot. Efterforskere i colitis-associeret cancer kan være interesseret i visuelle markører af celleproliferation. Til dette formål kan AOM / DSS-behandlede mus injiceres med bromdeoxyuridin (BrdU) 90 min før aflivning, immunhistokemi for disse mærkede kerner dokumenter samt de områder i tyktarmen med den største epitelproliferation, både i tumor og tumorfri sektioner. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret delvist af DK089016 og L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS), og P30-DK52574 (til Washington University Digestive Diseases Research Core). AIT var en Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma Aldrich | A5486-100MG | Stock solution: dilute to 10 mg/ml in distilled water to be kept at -20 °C as 0.5 - 1 ml aliquots. Working solution: dilute stock to 1 mg/ml in isotonic (0.9%) saline |
| Dextran Sulfate Sodium (DSS) | TdB Consultancy | DB001 | MW 40 kDa (36-50 kDa preparations from other sources are acceptable; The same lot should be used for a single experiment)6 |
| Coloview miniendoscopic system | Karl Storz | Multiple | See Becker et al. for detailed explanation of equipment and setup.11 |
| TPP Rapid FILTERMAX 500 ml Bottle-Filter, 0.22 μm PES | Midwest Scientific | TP99500 | Any standard tissue culture filter is acceptable |
| Ethyl Alcohol 200 Proof ASC/USP | Pharmaco-AAPER (or other) | 11ACS200 | Dilute to 70% in distilled water |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 4029405 | Place mouse in glass jar with gauze or a small cloth soaked in anesthetic |
| 18G Straight Gavage Needle | Braintree Scientific | N-008 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | Dilute to 1X (0.01 M) in distilled water |
| Cold Tray (Tissue Tek II Cold Plate) | Fisher Scientific | NC9491941 | Store at -20 °C |
| ImageJ Software | NIH (free download) | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Scientific | F79-500 | Dilute to 10% in PBS |
| BD Bacto Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Use hotplate to create 2% solution in distilled water |
| Miltex Eye Dressing Forceps | MedPlus Inc. | 18-780 | |
| Miltex Eye Scissors | MedPlus Inc. | 18-1430 | Curved points prevent damage to colon during opening. |
| Alcian Blue 8GX (powder) | Sigma Aldrich | A5268 | Add 1 g powder to 100 ml 3% acetic acid (3 ml glacial acetic acid + 97 ml distilled water) |
| 1 mL Tuberculin syringe with attached 26 G x 3/8 in intradermal bevel needle | BD | 305946 | For injection of AOM |
References
- Ekbom, A. Ulcerative colitis and colorectal cancer. A population-based study. N. Engl. J. Med. 323, 1228-1233 (1990).
- Terzic, J. Inflammation and colon cancer. Gastroenterology. 138, 2101-2114 (2010).
- Ullman, T. A., Itzkowitz, S. H. Intestinal inflammation and cancer. Gastroenterology. 140, 1807-1816 (2011).
- Okayasu, I. Dysplasia and carcinoma development in a repeated dextran sulfate sodium-induced colitis model. J. Gastroenterol. Hepatol. 17, 1078-1083 (2002).
- Kanneganti, M., Mino-Kenudson, M., Mizoguchi, E. Animal models of colitis-associated carcinogenesis. J. Biomed. Biotechnol. 342637, (2011).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat. Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
- Tanaka, T. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94, 965-973 (2003).
- De Robertis, M. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J. Carcinog. 10, 9 (2011).
- Wirtz, S. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
- Cooper, H. S. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest. 69, 238-249 (1993).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat. Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
- Becker, C., Fantini, M. C., Wirtz, S., Nikolaev, A., Kiesslich, R., Lehr, H. A., Galle, P. R., Neurath, M. F. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
- Shaker, A. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. J. Clin. Invest. 120, 2081-2093 (2010).
- Boivin, G. P. Pathology of mouse models of intestinal cancer: consensus report and recommendations. Gastroenterology. 124, 762-777 (2003).
- Cooper, H. S. Dysplasia and cancer in the dextran sulfate sodium mouse colitis model. Relevance to colitis-associated neoplasia in the human: a study of histopathology, B-catenin and p53 expression and the role of inflammation. Carcinogenesis. 21, 757-768 (2000).
- Yoshida, Y. The forkhead box M1 transcription factor contributes to the development and growth of mouse colorectal cancer. Gastroenterology. 132, 1420-1431 (2007).
- Suzuki, R. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27, 162-169 (2006).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, 544-551 (1998).
- Nambiar, P. R. Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors. Int. J. Oncol. 22, 145-150 (2003).
- Tanaka, T. Colorectal carcinogenesis: Review of human and experimental animal studies. J Carcinog. 8, (2009).
- Ciorba, M. A. Induction of IDO-1 by immunostimulatory DNA limits severity of experimental colitis. J. Immunol. 184, 3907-3916 (2010).
- Kerr, T. A. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: A poly-A purification solution. Inflamm. Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
- Tang, Y. is required for resection-induced changes in apoptosis, proliferation, and members of the extrinsic cell death pathways. Gastroenterology. 126, 220-230 (2004).
