Summary
Dunne darm transplantatie is uitgegroeid tot een geaccepteerde behandeling voor patiënten met onomkeerbare intestinale mislukking. Onze experimenteel model van orthotope dunne darm transplantatie bij ratten dient als een betrouwbaar instrument om de onderliggende immunologische en inflammatoire processen die darmtransplantatie compliceren aan te pakken.
Abstract
Dunne darm transplantatie is uitgegroeid tot een geaccepteerde klinische optie voor patiënten met een korte darm syndroom en het falen van parenterale voeding (onomkeerbare intestinale falen). In gespecialiseerde centra verbeterd operatieve en beheren van strategieën hebben geleid tot een uitstekende korte en middellange termijn de patiënt en transplantaatoverleving, terwijl het verstrekken van hoge kwaliteit van leven 1,3. In tegenstelling tot de meer gebruikelijke transplantatie van andere vaste organen (dwz hart, lever) veel onderliggende mechanismen van graft function en immunologische veranderingen veroorzaakt door intestinale transplantatie zijn niet geheel bekend 6,7. Episodes van acute afstoting, sepsis en chronische graft falen zijn de belangrijkste obstakels op zijn bijdrage aan minder gunstige lange termijn uitkomst en belemmeren een bredere inzet van de procedure ondanks een groeiend aantal patiënten op de startpagina van parenterale voeding, die zou mogelijk profiteren van een dergelijke transplantatie. De dunne darm bevateen groot aantal passagiers leukocyten gewoonlijk aangeduid als deel van de ingewanden geassocieerde lymfoïde systeem (GALT) dit deel uitmaakt van de oorzaak van de hoge immunogenity van de intestinale graft. De aanwezigheid en de nabijheid van vele commensalen en pathogenen in de darm worden de ernst van sepsis episodes eenmaal graft mucosale integriteit is aangetast (bijvoorbeeld afwijzing). Op het gebied van darm-en multi-transplantatie meer gegevens gegenereerd uit betrouwbare en haalbare diermodellen is onmisbaar. Het model hierin combineert zowel de betrouwbaarheid en haalbaarheid eenmaal vastgesteld op een gestandaardiseerde wijze en kunnen waardevolle inzichten geven in de onderliggende complexe moleculaire, cellulaire en functionele mechanismen die worden veroorzaakt door intestinale transplantatie. We hebben met succes gebruikt en verfijnd de beschreven procedure al meer dan 5 jaar in ons laboratorium 8-11. De Jove video-gebaseerd formaat is vooral handig om de complexe procedures te tonenprocedure en vermijden de eerste valkuilen voor groepen van plan om een orthotope knaagdiermodel onderzoeken darmtransplantatie vast te stellen.
Protocol
1. Donor Operatie
- De donor rat moet worden gehouden vasten gedurende 24 uur (vrije toegang tot water / glucose-oplossing).
- Om Isofluraan inhalatie-anesthesie te induceren, te beginnen met 2% op standaard verstuiver, en vervolgens te verminderen tot 1% na het uitvoeren van laparotomie. Voer een teen knijpen om sedatie te controleren.
- Scheer de buik en reinig met de huid prep 3 keer (Kodan). Voer vervolgens een mediane incisie na subcutane toediening van de pijnstiller.
- Nadat het transplantaat is verpakt in zoutoplossing geweekte gaas, scheiden de fysiologische verklevingen tussen de alvleesklier en het colon ascendens voorzichtig met een Q-tip (onder de chirurgische microscoop met 6x vergroting).
- Ligeren en verdeel de Bauhin & rechts & midden koliek vaartuigen die gebruik maken 7-0 zijde. Na het colon ascendens is verspreid naar de rechterkant van de superieure mesenteriale vene (SMV), kan de Bauhin, rechts en midden koliek schepen worden geïdentificeerd voor ligatie en delen met behulp van 7-0 banden.
- Omhoog schuiven de maag, zodat de gehele SMV wordt rechtgetrokken en blootgesteld. Gebruik een Mosquito-klem voor het terugtrekken. De klem is in handen van plasticine massa in vorm gestrooid als dat nodig is.
- Ligeren en verdeel de pancreatico-duodenale aders uit de SMV. Alle kleine pancreatico-duodenale aders afkomstig van de SMV zorgvuldig worden geïdentificeerd, geligeerd met 7-0 zijde en verdeeld voor het alvleesklierweefsel kan worden verwijderd uit het transplantaat.
- Ligeren en verdeel de verliezen bindweefsel inclusief alle lymphatics tussen de SMV en de abdominale aorta. Met het transplantaat nog steeds aan de rechterkant van de buik, de verliezen bindweefsel inclusief alle lymphatics tussen de SMV en de abdominale aorta toegankelijk is. Dit bindweefsel wordt geligeerd met 7-0 zijde en verdeeld over postoperatieve lymphorrhea van de intestinale graft te voorkomen.
- Ligeren en verdeel de rechter nierslagader. Na het bindweefsel bestaat, de rechter nierslagader wordt accessible en geligeerd en verdeeld met 7-0 zijde.
- Systemisch heparinise de rat met behulp van 200 eenheden heparine iv via de penis ader.
- Ligeren van het marginale slagaders en verdeel de dunne darm bij de duodeno-jejunale knooppunt en het terminale ileum.
- De aorta proximaal geligeerd aan de oorsprong van de SMA. De poortader wordt doorsneden aan de samenvloeiing met de milt ader. Dan is de graft wordt geoogst met zijn vasculaire pedikel bestaande uit de SMA met een aorta-segment.
2. Backtable Procedure
- Perfuseren het transplantaat met 3 ml van University of Wisconsin-oplossing (UW) bij 4 ° C via de aorta leiding en spoel het darmkanaal van de jejunal uiteinde met 30 ml Uro-Nebacetin N oplossing bij 4 ° C (lumen irrigatie is verplicht) .
Direct na het extraheren van de graft, wordt de aorta leiding voor perfusie met 3 ml gekoelde UW-oplossing. Hiervoor is een 20 G iv catheter opeen 10 ml spuit gebruikt. De perfusaat moet in acht worden genomen vrij stromen uit de verdeelde poortader. Voor de intestinale irrigatie met Nebacetin is een 50 ml spuit gebruikt.
- Bewaar het transplantaat in UW oplossing bij 4 ° C gedurende de bereiding van de ontvanger.
3. Ontvanger Operatie
- De ontvanger rat moet worden gehouden vasten gedurende 24 uur (vrije toegang tot water / glucose-oplossing).
- Om Isofluraan inhalatie-anesthesie te induceren, te beginnen met 2% op standaard verstuiver, en vervolgens te verminderen tot 1% na het uitvoeren van laparotomie. Voer een teen knijpen om sedatie te controleren.
- Scheer de buik en reinig met de huid prep 3 keer (Kodan). Voer vervolgens een mediane incisie na subcutane toediening van Carprofen 5 mg / kg sc voor intraoperatieve analgesie.
- Wikkel de ontvanger darm in een isotone zoutoplossing gedrenkte gaas en plaats het op de borst van de ontvanger.
- Botweg Open het retroperitoneum met Q-tips, en bloot de abdominaal aorta en inferior vena cava net onder de renale bloedvaten tot op het niveau van de iliacale vaten eventueel ook microscissors. Ligeren van het kleine lumbale wervelkolom en tribuaries van de aorta en vena cava met behulp van 7-0 zijde tot bloedverlies te voorkomen. (Om dit te doen, moet u de chirurgische microscoop zoom tot 16x.)
- Cross-klem de aorta en de IVC onder de linker renale bloedvaten proximaal en boven de iliacale bifurcatie distaal met microvaatje clips. Slechts een klem proximaal en distaal gebruikte gelijktijdig spannen beide schepen. Incise beide schepen voren met behulp van een microknife en wassen resterende bloed.
- Maak een end-to-side anastomose tussen het transplantaat aorta segment en de ontvanger infrarenale aorta met behulp van een continu 10-0 Prolene hechtdraad .. Eerst wordt het transplantaat geplaatst op de de rechterkant van de buik (de kop van de rat geplaatst op 12 uur) de achterwand steken van de arteriële anastomose en vastbinden van de onderste verblijf hechtdraad voeren. Then wordt het transplantaat overgedragen aan de linkerkant van de buik (de kop van de rat geplaatst op 9 uur) bloot te leggen en hechten de voorwand van de anastomose.
- Een end-to-side anastomose tussen het transplantaat poortader en de ontvanger IVC wordt eveneens uitgevoerd door het uitvoeren van hechtingen met behulp van 10-0 Prolene. De rat blijven liggen zijdelings (head in 9 uur), wordt het transplantaat geplaatst aan de linkerzijde van de buik en een onderste verblijf hechtdraad geplaatst. De anastomose wordt gestart met de achterwand van binnen het vat. Nadat de onderste verblijf hechtdraad is verbonden, kan de voorwand steken worden uitgevoerd buiten.
- Verwijder de distale klemmen, gevolgd door de bovenste klemmen. Elke anastomose bloeding onder controle is door middel van directe druk met behulp van Q-tips. De ent moet worden gecontroleerd voor gelijke en snelle reperfusie.
- Resectie van de gehele ontvanger dunne darm na ligatie van de mesenteriale vaten. Ontvangers ondergaan subtotaal enterectomy, met behoud van 2-3 cm van proximal jejunum en 1 cm van het distale ileum.
- Herstel enterische continuïteit door proximale (jejuno-jejunostomie) en distale (ileo-ileostoma) end-to intestinale anastomosen met behulp van een onderbroken one-layer hechtdraad met 6-0 Monocryl beëindigen. Ongeveer 16 hechtingen nodig zijn anastomosen voltooien.
- Spoel de buikholte met een fysiologische zoutoplossing tot er schoon. Dien 2 ml normale zoutoplossing intraperitoneaal voor vloeistofvervanging. Sluit vervolgens de buik met behulp van een continue hechting met 3-0 Vicryl voor de spierlaag en een continue huid hechtdraad.
- In de postoperatieve periode de ratten worden gehouden vasten (met toegang tot water en glucoseoplossing) nog 24 uur opnieuw gestart op standaard rattenvoer en water ad libitum. Analgesie met carprofen dient te worden toegediend gedurende 3 dagen (zie dosering hieronder).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normaal postoperatieve beloop
De getransplanteerde dieren moeten snel te herstellen van de procedure van een warmtelamp voor ongeveer 1 uur. Hypothermie is een belangrijke oorzaak van postoperatieve mortaliteit en moeten zorgvuldig worden intra-en postoperatief vermeden. Intraoperatieve vochtverlies moeten worden vervangen door sc injectie van 2,5 ml normale zoutoplossing plus 2,5 ml Glucose 5% om de 8 uur gedurende de eerste 24 uur. De ratten moeten ook gratis toegang tot glucose-oplossing (of gel dieet) en water po voor de eerste 24 uur na de operatie. Na deze periode moeten ze weer normaal eetgedrag met gratis toegang tot de standaard rattenvoer en water ad libitum. Pijn wordt door toediening van carprofen 5 mg / kg sc daags gedurende drie dagen met het eerste schot te worden toegediend anesthesie inductie. PO profylaxe is alleen nodig in de allogene instelling en kunnen worden toegediend gedurende 5-7 dagen (15 mg ampicilline / kg sc, q. 12 uur). Algemeenuiterlijk, vacht conditie en mucosale verschijning zou normaal moeten zijn. Na POD 1 het activiteitenniveau moet terugkeren naar preoperatieve status, apathisch of abnormaal gedrag suggereert vroege chirurgische complicaties. Na aanvankelijke verlies van 20% van het lichaamsgewicht de ratten weer gaan gewicht in postoperatieve dag 6-8 en bereikt ongeveer 90% van hun gewicht preoperatieve normaal rond postoperatieve dag 14 (in de isogene instelling zonder afstoting).
Postoperatieve complicaties
Zoals hierboven vermeld, een opgezette buik, apathisch gedrag, beëindiging van voeding en veranderingen in algemene uiterlijk (gegolfde fur, afscheiding uit de ogen) moet worden beschouwd als symptomen van mogelijke complicaties. De dieren worden gezien door de chirurg en een dierenarts. Voorwaarden zoals uitdroging, inflammatoire toestand als gevolg van peritonitis, ileus als gevolg van stenose van de darm anastomose, moet voldoende pijnmedicatie en anderen regeld uit en behandeld. Als het dier zich niet herstelt, ondanks de behandeling, moet stopzetting van het experiment worden geëvalueerd op een geval per geval op basis van het toepassen van dierproeven regelgeving.
Figuur 1a. Instrumenten.
1. Microscoop (Leica)
2. Anesthesie apparatuur (EICKEMEYER)
Figuur 1b. Instrumenten.
3. Scheerapparaat
4. Elektronische scalpel (GEIGER)
5. Chirurgische pincetten
6. DeBakey pincet gebogen
7. Gebogen pincet kleine
8. Micro pincet gebogen
9. Micro pincet recht 1
10. Micro pincet recht 2
11. Micro naaldhouder
12. Naaldhouder
13. Mosquito-klem
14. Schaar 1
15. Schaar 2
16. Microscissors
17. Micro Scalpel
Figuur 1c. Instrumenten.
18. Microclamps
19. Canules en Q-Tips (niet afgebeeld)
20. Spuiten (50 ml, 10 ml, 2,5 ml, 1 ml)
Figuur 1c. Instrumenten.
21. UW oplossing voor opslag graft
22. Antibiotica (Uro-nebacetin N) voor graft lumen irrigatie
23. UW voor graft perfusie
24. Fysiologische zoutoplossing
25. Schotel met een fysiologische zoutoplossing (voor backtable)
Figuur 2. Gemiddelde postoperatieve gewicht (cumulatieve gegevens). Figuur 2 toont de gemiddelde postoperatieve gewicht na orthotope dunne darm. Na aanvankelijke verlies van 20% van het lichaamsgewicht de ratten weer gaan gewicht in postoperatieve dag 6-8 en voor 90% van de Preoperative gewicht dat normaal gesproken rond postoperatieve dag 14 (in de isogene instelling zonder afwijzing / immunosuppressie). Figuur 2 geeft gewichtsverlies gegevens, niet overleven, het afnemende aantal beschikbare dieren te meten gewichtsverlies is vooral te wijten aan sacrifing van dieren voor proeven.
Figuur 3. De pancreas (pijl) moet worden verwijderd uit de colon.
Figuur 4. Na ligeren en de verdeling van de verliezen bindweefsel met inbegrip van alle lymfevaten tussen SMV en de abdominale aorta, de rechter nierslagader (pijl) is verdeeld tussen de zijde ligaturen.
Figuur 5. Perfusie van het transplantaat met UW-oplossing via de leiding aorta.
Figuur 6. Na bereiding van de ontvanger vena cava en aorta de vaten blootgesteld, klaar te klemmen.
Figuur 7. Kruisklem wordt uitgevoerd op vena cava en aorta gelijktijdig gebruik microclamps.
Figuur 8. (A) de aorto-aorta anastomose wordt uitgevoerd met verblijf hechtingen. (B) Na voltooiing van de aorto-aorta anastomose zal de anastomose worden uitgevoerd portocaval volgende. De onderste verblijf hechtdraad is al op zijn plaats.
Figuur 9. (A) De portocaval anastomose wordt gestart na de tweede verblijf hechtdraad op zijn plaats. (B) Na completion de portocaval anastomose.
Figuur 10. Na verwijdering van de klemmen het transplantaat reperfuses goed.
Figuur 11. (A) Plaatsing van verblijf hechtingen voor de darm anastomosis. (B) Aangevuld darm anastomose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl intestinale transplantatie modellen in ratten zijn beschreven zo vroeg in de 1970ies 5 meeste van de onlangs in dienst modellen te betrekken heterotope darmtransplantatie met behulp van verschillende technieken 13. Terwijl de heterotope procedures in het algemeen het voordeel gemakkelijker microchirurgische technieken en betere toegankelijkheid van het transplantaat voor de beoordeling, heterotope darmtransplantatie heeft het grote nadeel dat ze niet rekening houdend met de verschillende interacties van de getransplanteerde dunne darm en de functionele aspecten zoals contractiele activiteit en slijmvliesbarrière functie die een orthotope transplantaat kenmerkend in de context van een groot scala aan commensalen en pathogenen. Onze groep heeft opgedaan een ruime ervaring met de hierin beschreven orthotope model en onze gegevens blijkt dat veel van de specifieke veranderingen veroorzaakt door ontstekingen en adaptieve immuunreacties moeten worden beoordeeld in samenhang met de functionele progenschappen van de getransplanteerde dunne darm, zoals de contractiliteit en mucosale integriteit. Van belang zijn de anastomose technieken hier gebruikt niet het gebruik van arteriële of veneuze manchetten, waarvan is aangetoond dat de procedure vergemakkelijken en de kritische ischemie te verminderen, vooral in modellen van multiviscerale transplantatie 12,14. Hoewel het nodig kan zijn manchet technieken gebruiken in diermodellen multiviscerale transplantatie, de mogelijke complicative van de manchetten heeft geleid tot soortgelijke technieken voorkomen in dit model van enkele darmtransplantatie. We hebben niet geprobeerd om portaal drainage technieken te gebruiken in dit model. Behalve technisch ingewikkeld (kleine poortader diameter kan leiden tot problemen veneuze uitstroom) zou waardoor het hele model moeilijker te stellen - het is een feit dat in klinische darmtransplantatie systemische drainage wordt in de meeste gevallen. Dus de beschreven techniek reflects klinische praktijk in combinatie met de technische haalbaarheid. Portaal drainage van de grafts is niet aangetoond geassocieerd met superieure resultaten in verschillende klinische en experimentele studies 2,4. Voldoende korte ischemie tijden van ongeveer 35 minuten nodig voor een stabiele dier overleving kan worden bereikt na voltooiing van de leercurve voor dit model.
Orthotope dunne darm transplantatie volgens dit protocol kan worden geleerd door een microchirurgisch ervaren onderzoeker na het uitvoeren van ongeveer 30-40 procedures. De visualisatie zo ver als de Jupiter-indeling zorgt voor een directe visuele waarneming en nauwkeurige weergave van de gebruikte technieken die mogelijk leidt tot snellere invoering van de methode en minder het offeren van dieren. Kritische punten zijn bloeden, koude en warme ischemie tijd en darm anastomose stenose / insufficiëntie. De koude ischemie tijd in deze experimentele opstelling is niet zo cruciaal als warm ischemia tijd, maar mag niet meer dan 45 minuten. De warme ischemie tijd moet ongeveer 35 minuten en ook niet meer dan 45 minuten, want dit kan een hogere postoperatieve sterfte veroorzaken. De ideale donor en ontvanger gewicht is ongeveer 200 g, omdat kleinere ratten niet tolereren van de procedure goed en het gewicht meer dan 300 gram wordt in verband gebracht met overmatige intra-abdominale vet. De ratten verliezen tot 20% van het lichaamsgewicht in de postoperatieve periode direct maar moet beginnen weer gewicht na 6-8 dagen na de operatie (figuur 2). Dagelijkse health checks (alertheid, bont en mucosale uiterlijk, gewicht, kwaliteit van de ontlasting en de frequentie) moet worden uitgevoerd totdat het dier is geslacht. We aanbevolen dagelijkse toediening van antibiotica en analgesie gedurende minstens de eerste drie dagen zoals hierboven beschreven. Na de eerste praktijk, met name van de microvasculaire en darmen anastomosen, dit model biedt een betrouwbare en stabiele lange termijn overleving van circa 80-90% in de isogene instelling. In de allogenic instelling overleving doorgaans lager, vooral afhankelijk immunologische verschijnselen als acute en chronische afstoting en kunnen sterk variëren afhankelijk van de immunosuppressieve behandeling gebruikt en getest.
Technische noot: De donor werkingstijd moet ongeveer 45 minuten. De ontvanger operatie moet niet veel hoger zijn dan 1,5 uur. Een warmtekussen dient regelmatig te worden gebruikt om onderkoeling te vermijden in de ontvanger. Voor gemakkelijke vasculaire toegang kan de laterale staartader van de geadresseerde canule aan het begin van de procedure met een 22 G intraveneuze katheter. Irrigatie van de intestinale lumen, zoals hierboven beschreven niet nodig, weglaten deze stap voor zover bekend geen negatieve effecten op resultaten en mortaliteit.
Dierstudie eisen: De dieren zijn volgens de geldende wetten en voorschriften van de Bondsrepubliek Duitsland, staat Nordrhein-Westfalen. De documentnummers waarbij thij experimenten werden goedgekeurd kan worden opgevraagd bij de betreffende auteur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| University of Wisconsin (UW) solution (ViaSpan) | Bristol-Myers Squibb | ||
| Uro-Nebacetin N solution | Nycomed | 6967855 | |
| Ampicillin | Ratiopharm | ||
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer | ||
| Prolene 10-0 unresorbable suture | Ethicon | ||
| Monocryl 6-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| Vicryl 3-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| i.v. Catheter G 20 1.1x33 mm | Braun | ||
| i.v. Catheter G 22 0.9x25 mm | Braun | ||
| Kodan Skin Prep | Schülke | ||
| NaCl 0.9% Infusion solution | Braun | ||
| Curved forceps small | FineScienceTools | 11009-13 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | BD 333 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | FD281R | |
| Micro forceps straight 1 | WPI | 5 | |
| Micro forceps straight 2 | WPI | 2 | |
| Micro needle holder | WPI | 14081 | |
| Micro scissors | FineScienceTools | 15006-09 | |
| Micro scalpel | MANI | Ophthalmic knife | |
| Micro clamps | AESCULAP | FB329R |
References
- Abu-Elmagd, K. M., et al. Five Hundred Intestinal and Multivisceral Transplantations at a Single Center: Major Advances With New Challenges. Ann. Surg. 250 (4), 567-56 (2009).
- Berney, T., et al. Portal versus systemic drainage of small bowel allografts: comparative assessment of survival, function, rejection, and bacterial translocation. J. Am. Coll. Surg. 195 (6), 804 (2002).
- Fishbein, T. M. Intestinal transplantation. N. Engl. J. Med. 361 (10), 998 (2009).
- Hernandez, F., et al. Is portal venous outflow better than systemic venous outflow in small bowel transplantation? Experimental study in syngeneic rats. J. Pediatr. Surg. 40 (2), 336 (2005).
- Monchik, G. J., Russell, P. S. Transplantation of small bowel in the rat: technical and immunological considerations. Surgery. 70 (5), 693 (1971).
- Murase, N., et al. Graft-versus-host disease after brown Norway-to-Lewis and Lewis-to-Brown Norway rat intestinal transplantation under FK506. Transplantation. 55 (1), 1 (1993).
- Murase, N., et al. Immunomodulation of intestinal transplant with allograft irradiation and simultaneous donor bone marrow infusion. Transplant Proc. 31 (1-2), 565 (1999).
- Pech, T., et al. Perioperative infliximab application ameliorates acute rejection associated inflammation after intestinal transplantation. Am. J. Transplant. 10 (11), 2431 (2010).
- Schaefer, N., et al. Resident macrophages are involved in intestinal transplantation-associated inflammation and motoric dysfunction of the graft muscularis. Am J Transplant. 7 (5), 1062 (2007).
- Schaefer, N., et al. Mechanism and impact of organ harvesting and ischemia-reperfusion injury within the graft muscularis in rat small bowel transplantation. Transplant. Proc. 38 (6), 1821 (2006).
- Schaefer, N., et al. Acute rejection and the muscularis propria after intestinal transplantation: the alloresponse, inflammation, and smooth muscle function. Transplantation. 85 (10), 1465 (2008).
- Xue, L., et al. Surgical experience of refined 3-cuff technique for orthotopic small-bowel transplantation in rat: a report of 270 cases. Am. J. Surg. 198 (1), 110 (2009).
- Zhang, X. Q., et al. Simplified techniques in rat heterotopic small bowel transplantation. Transplant. Proc. 38 (6), 1840 (2006).
- Zhao, Y., et al. The establishment of a new en bloc combined liver-small bowel transplantation model in rats. Transplant. Proc. 39 (1), 278 (2007).
