Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Orthotopic tunntarmstransplantation i råttor

Published: November 6, 2012 doi: 10.3791/4102
* These authors contributed equally

Summary

Tunntarmen transplantation har blivit en accepterad behandling för patienter med irreversibel intestinal misslyckande. Vår experimentell modell av ortotopisk tunntarmen transplantation hos råttor fungerar som ett pålitligt verktyg för att hantera den underliggande immunologiska och inflammatoriska processer som komplicerar tarmtransplantation.

Abstract

Tunntarmen transplantation har blivit en accepterad klinisk alternativ för patienter med kort tarm syndrom och misslyckande av parenteral nutrition (irreversibel intestinal misslyckande). I specialiserade centra förbättrade operativa och hantera strategier har lett till utmärkta kort och mellanliggande sikt patient och transplantatöverlevnad samtidigt som hög livskvalitet 1,3. Till skillnad från i mer vanliga transplantation av andra fasta organ (t.ex. hjärta, lever) många bakomliggande mekanismer transplantatfunktion och förändringar immunologiska inducerad av tarmtransplantation är inte helt känd 6,7. Episoder av akut avstötning, sepsis och kronisk graft fel är de största hindren fortfarande bidrar till sämre långsiktig utfall och hindrar en mer utbredd sysselsättning förfarandet trots ett växande antal patienter hem parenteral nutrition som skulle komma att åtnjuta en sådan transplantation. Tunntarmen innehållerett stort antal passagerare leukocyter som vanligen som en del av tarmen associerad lymfoid system (GALT) vilket är en del av orsaken till den höga immunogenity av intestinala transplantatet. Närvaron och närhet av många harmlösa och patogener i tarmen förklarar svårighetsgraden av sepsis episoder gång transplantat mukosal integritet äventyras (t.ex. genom avstötning). Att främja området intestinala-och multiorgansvikt transplantation mer data som genererats från tillförlitliga och genomförbara djurmodeller behövs. Modellen som här kombinerar både tillförlitlighet och genomförbarhet gång etablerat på ett standardiserat sätt och kan ge en värdefull inblick i de underliggande komplexa molekylära, cellulära och funktionella mekanismer som utlöses av tarmtransplantation. Vi har framgångsrikt använt och förfinat den beskrivna proceduren under mer än 5 år i vårt laboratorium 8-11. Den JUPITER video-baserat format är särskilt användbar för att påvisa det komplexa förfaranderande och undvika initiala fallgropar för grupper som planerar att etablera en orthotopic gnagarmodell undersöker tarmtransplantation.

Protocol

1. Donator Drift

  1. Givaren råtta bör förvaras fastat i 24 h (fri tillgång till vatten / glukoslösning).
  2. För att inducera Isofluran inhalationsanestesi, börja med 2% på standard sprejflaska, och sedan minska till 1% efter att ha utfört laparotomi. Gör en tå nypa att kontrollera sedering.
  3. Raka buken och rengör med huden prep 3 gånger (Kodan). Utför sedan en median snitt efter subkutan administrering av smärtstillande.
  4. Efter att transplantatet är insvept i saltlösning indränkt gasbinda, separera de fysiologiska sammanväxningar mellan bukspottkörteln och colon ascendens försiktigt med en tops (under kirurgiska mikroskop med 6x förstoring).
  5. Ligera och dela ileocecal och höger och mellersta kolik fartyg som använder 7-0 silke. Efter den uppåtstigande tjocktarmen sprids ut på höger sida av vena mesenterica superior (SMV), kan ileocecal, höger och mitten kolik fartyg identifieras för ligering och division med 7-0 band.
  6. Dra tillbaka magen uppåt, så att hela SMV rätas ut och exponeras. Använd en mygga klämma för indragning. Klämman hålls av modellera massa formad till formen som behövs.
  7. Ligera och dela pancreatico-duodenala vener som kommer från SMV. Alla små pancreatico-duodenala vener härrör från SMV måste noggrant identifieras, ligerades med 7-0 silke och delades före den pankreatiska vävnaden kan avlägsnas från transplantatet.
  8. Ligera och dela förlorar bindväv inklusive alla lymphatics mellan SMV och bukaortan. Med transplantatet fortfarande på den högra sidan av buken, förlorar bindväv inklusive alla lymphatics mellan SMV och bukaortan är åtkomlig. Denna bindväv måste ligeras med 7-0 silke och delas för att undvika postoperativ Lymphorrhea från mag transplantat.
  9. Ligera och dela den högra njurartären. Efter bindväven delas, blir den högra njurartären accessible och ligeras och delas med 7-0 silke.
  10. Systemiskt heparinise råttan med 200 enheter heparin iv via penis ven.
  11. Ligera de marginella artärer och dela tunntarmen vid duodeno-jejunal korsningen och vid terminala ileum.
  12. Aorta ligeras proximalt till ursprunget av SMA. Portvenen är transekterades vid sammanflödet med mjälten ven. Sedan transplantatet skördas med sin vaskulära BLOMSTJÄLK bestående av SMA med ett aortasegmentet.

2. Backtable förfarande

  1. Perfundera transplantatet med 3 ml av University of Wisconsin-lösning (UW) vid 4 ° C via aorta ledningen och vattna tarmlumen från jejunala änden med 30 ml Uro-Nebacetin N lösning vid 4 ° C (lumen bevattning är obligatorisk) .

Omedelbart efter extraktion av transplantatet, den aorta ledningen används för perfusion med 3 ml kyld UW-lösning. För detta, en 20 g IV kateter påen 10 ml spruta används. Perfusatet bör observeras att strömma ut fritt från den delade portvenen. För den intestinala bevattning med Nebacetin, är en 50 ml spruta används.

  1. Förvara transplantatet i UW-lösning vid 4 ° C under framställningen av mottagaren.

3. Mottagare Drift

  1. Mottagaren råttan bör förvaras fasta i 24 h (fri tillgång till vatten / glukoslösning).
  2. För att inducera Isofluran inhalationsanestesi, börja med 2% på standard sprejflaska, och sedan minska till 1% efter att ha utfört laparotomi. Gör en tå nypa att kontrollera sedering.
  3. Raka buken och rengör med huden prep 3 gånger (Kodan). Utför sedan en median snitt efter subkutan administrering av Karprofen 5 mg / kg sc för intraoperativ smärtlindring.
  4. Linda mottagande tarmen i normal koksaltlösning blöt kompress och placera den på mottagarens bröst.
  5. Öppna retroperitoneum rent med Q-tips och exponera abdomiNAL aorta och vena cava inferior strax under njurkärl ner till nivån för iliaca fartyg vid behov också använda microscissors. Ligera de små länd och spinal tribuaries från aorta och vena cava med 7-0 silke för att undvika blodförlust. (För att göra detta genom att ändra operationsmikroskop zoomen till 16x.)
  6. Cross-klämma aortan och IVC under den vänstra njurkärl proximalt och ovanför höftbifurkationen distalt med microvessel klipp. Endast en klämma används proximalt samt distalt att klämma båda fartygen samtidigt. Incise båda fartygen anteriort med en microknife och tvätta ur resterande blod.
  7. Skapa en end-to-sida anastomos mellan transplantatet aortasegmentet och mottagarens infrarenala aorta med hjälp av en kontinuerlig 10-0 Prolene sutur .. Initialt transplantatet placeras på höger sida av buken (chefen för råtta placerad vid klockan 12) för att utföra den bakre väggen stygn i den arteriella anastomos och binda den undre vistelsen sutur. Thsv, är transplantatet vänds till den vänstra sidan av buken (huvud råtta placerad vid klockan 9) för att exponera och sutur främre vägg anastomosen.
  8. Ett slut-till-sida anastomos mellan transplantatet portvenen och mottagarens IVC utförs på samma sätt genom att köra suturer med 10-0 Prolene. Med råttan fortfarande ligger i sidled (huvudet i klockan 9), är graften placerad på vänster sida av buken och en lägre vistelse sutur placeras. Anastomosen startas med den bakre väggen från insidan av kärlet. Efter den nedre vistelsen suturen knyts, kan de främre väggen stygnen göras utifrån.
  9. Ta de distala klämmorna först, följt av de övre klämmorna. Varje anastomotiskt blödning styrs av direkt tryck med Q-tips. Transplantatet bör kontrolleras för lika och snabb reperfusion.
  10. Resekera hela mottagarens tunntarm efter ligering av mesenteriala fartyg. Mottagare genomgår delsumma enterectomy, bevara 2-3 cm av proximal jejunum och 1 cm av distala ileum.
  11. Återställ enterisk kontinuitet genom proximala (jejuno-jejunostomi) och distal (ileo-ileostomi) end-till slut intestinala anastomoser med en avbruten en lager sutur med 6-0 Monocryl. Cirka 16 suturer behövs för att slutföra anastomoser.
  12. Vattna peritonealhålan med normal saltlösning tills de är rena. Administrera 2 ml fysiologisk koksaltlösning intraperitonealt för vätskeersättning. Stäng sedan buken med hjälp av en kontinuerlig sutur med 3-0 Vicryl för muskel lagret samt en kontinuerlig hud sutur.
  13. Under den postoperativa perioden råttorna bör hållas fastande (med tillgång till vatten och glukos-lösning) för en annan 24 timmar sedan startas på standard råttföda och vatten ad libitum. Analgesi med karprofen ges under 3 dagar (se dosering nedan).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Normal postoperativ kurs

De transplanterade djur bör återhämta sig snabbt från förfarandet under en värmelampa under ca 1 timme. Hypotermi är en viktig orsak till postoperativ mortalitet och bör noga undvikas intra-och postoperativt. Intraoperativa vätska förluster måste ersättas av subkutan injektion av 2,5 ml fysiologisk koksaltlösning plus 2,5 ml glukos 5% varje 8 timmar för den första 24 tim. Råttorna bör också ha fri tillgång till glukos-lösning (eller gel diet) och vatten po för den första 24 timmar postoperativt. Efter denna period bör de återfå normal ätbeteende med fri tillgång till standard råttfoder och vatten ad libitum. Smärta styrs av administration av karprofen 5 mg / kg sc dagligen under tre dagar, med det första skottet som ska administreras vid anestesi induktion. Perioperativ antibiotikaprofylax behövs endast i allogen inställning och kan administreras under 5-7 dagar (ampicillin 15 mg / kg SC, q. 12 timmar). Allmäntutseende, päls kondition samt slemhinnor utseende bör vara normal. Efter POD 1 aktivitetsnivån bör återgå till preoperativ status, föreslår apathic eller onormalt beteende tidigt kirurgiska komplikationer. Efter den första förlusten av upp till 20% av kroppsvikten råttorna börjar gå upp i vikt igen runt postoperativ dag 6-8 och kommer att ha nått cirka 90% av sin preoperativ vikt normalt runt postoperativ dag 14 (i isogena inställning utan avslag).

Postoperativa komplikationer

Som nämnts ovan, en utspänd buk, apathic beteende, avbrytande av utfodring och förändringar i allmänna utseendet (ruggig päls, utsöndring från ögonen) bör betraktas som symptom på möjliga komplikationer. Djuren bör ses av kirurgen och en veterinär. Tillstånd som uttorkning, inflammatoriskt tillstånd på grund av peritonit, ileus grund stenos i tarmen anastomos måste otillräcklig smärtstillande och andra vara regeld ut och behandlas. Om djuret inte återhämta trots behandling måste avbrytande av försöket utvärderas från fall till fall enligt tillämpa regler djurförsök.

Figur 1a
Figur 1a. Instrument.
1. Mikroskop (Leica)
2. Anestesi apparater (EICKEMEYER)

Figur 1b
Figur 1b. Instrument.
3. Rakapparat
4. Elektronisk skalpell (GEIGER)
5. Kirurgisk tång
6. DeBakey Tång böjd
7. Böjda pincett små
8. Micro pincett böjda
9. Micro pincett rak 1
10. Micro Tång rak 2
11. Micro nålhållare
12. Nålhållare
13. Peang
14. Sax 1
15. Sax 2
16. Microscissors
17. Micro Skalpell

"Figur Figur 1c. Instrument.
18. Microclamps
19. Kanyler och Q-tips (ej visad)
20. Sprutor (50 ml, 10 ml, 2,5 ml, 1 ml)

Figur 1d
Figur 1c. Instrument.
21. UW-lösning för transplantat lagring
22. Antibiotika (Uro-nebacetin N) för transplantat lumen bevattning
23. UW för transplantat perfusion
24. Normal saltlösning
25. Skål med normal saltlösning (för backtable)

Figur 2
Figur 2. Genomsnittlig postoperativ vikt (kumulativa data). Figur 2 visar den genomsnittliga postoperativa vikt efter ortotopisk tunntarmen transplantation. Efter den första förlusten av upp till 20% av kroppsvikten råttorna börjar gå upp i vikt igen runt postoperativ dag 6-8 och kommer att ha nått 90% av sin Preoperative vikt normalt ca postoperativ dag 14 (i isogena inställning utan avslag / immunsuppression). Figur 2 representerar data viktminskning, inte överlevnad, det minskade antalet tillgängliga djur för att mäta viktminskning beror främst på sacrifing av djur för försök.

Figur 3
Figur 3. Den pankreatiska vävnaden (pil) måste avlägsnas från kolon.

Figur 4
Figur 4. Efter ligering och dela förlorar bindväv inklusive alla lymphatics mellan SMV och bukaorta är rätten njurartären (pil) fördelat på siden ligaturer.

Figur 5
Figur 5. Perfusion av transplantatet med UW-lösning via aorta ledningen.

Figur 6
Figur 6. Efter beredning av mottagande vena cava och aorta fartygen utsätts, redo för fastspänning.

Figur 7
Figur 7. Cross klämman utförs på vena cava och aorta samtidigt med microclamps.

Figur 8
Figur 8. (A) aorto-aortic anastomos utförs med användning vistelse suturer. (B) Efter slutförandet av aorto-aorta anastomos kommer portocaval anastomos ske härnäst. Den lägre vistelse suturen är redan på plats.

Figur 9
Figur 9. (A) portocaval anastomos startas efter den andra vistelsen suturen är på plats. (B) Efter completion av portocaval anastomos.

Figur 10
Figur 10. Efter avlägsnande av klämmorna transplantatet reperfuses väl.

Figur 11
Figur 11. (A) Placering av vistelse suturer för tarm anastomos. (B) Avslutat tarm anastomos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Medan intestinala transplantation modeller i råttor har beskrivits redan i 1970-talet 5 de flesta av de nyanställda modellerna innebär heterotop tarmtransplantation med olika tekniker 13. Medan heterotopiska förfaranden i allmänhet har fördelen av enklare mikrokirurgiska tekniker och enklare tillgänglighet av transplantatet för bedömning, har heterotop tarmtransplantation stora nackdelen att inte ta hänsyn till flera interaktioner av de transplanterade tunntarmen och dess funktionella aspekter som kontraktil aktivitet och slemhinnor barriärfunktion som kännetecknar en ortotop transplantat inom ramen för en stor mängd harmlösa och patogener. Vår grupp har fått en stor erfarenhet av den här beskrivna orthotopic modell och våra resultat tyder på att många av de specifika förändringar som orsakas av inflammatoriska och adaptiva immunsvar måste bedömas i sitt sammanhang med den funktionella profastigheter av de transplanterade tunntarmen som kontraktilitet och slemhinnor integritet. Att notera, inkluderar de anastomotiska tekniker som används här inte användning av arteriella eller venösa manschetter, en del av dem har visat sig underlätta förfarandet och minska den kritiska varma ischemi tid, särskilt på modeller av multiorgan transplantation 12,14. Även om det kan vara nödvändigt att använda manschetten tekniker i gnagarmodeller av multiorgan transplantation den FÖRKOMPLICERANDE potential manschetter har fått oss att undvika liknande tekniker i denna modell av en enda tarmtransplantation. Vi har inte försökt använda portalen dränering tekniker i denna modell. Förutom att tekniskt utmanande (den lilla portvenen diameter kan leda till problem venösa utflöde), vilket skulle göra hela modellen svårare att - det är ett faktum att i klinisk tarmtransplantation systemisk dränering används i de flesta fall. Sålunda, den beskrivna tekniken refljekt klinisk praxis i kombination med teknisk genomförbarhet. Portal dränering av transplantaten har inte visat sig vara associerad med överlägsna resultat i flera kliniska och experimentella studier 2,4. Tillräckligt kort ischemi tider av runt 35 minuter som krävs för stabil djuröverlevnad kan uppnås efter avslutad inlärningskurvan för denna modell.

Orthotopic tunntarmen transplantation enligt detta protokoll kan läras genom en microsurgically erfaren forskare efter att ha utfört ungefär 30-40 procedurer. Visualiseringen som uppnås genom JUPITER-formatet möjliggör direkt visuell observation och exakt återgivande av de metoder som eventuellt leder till snabbare etablering av metoden och mindre djuroffer. Kritiska punkter blöder, kallt och varmt ischemi tid och tarm anastomotisk stenos / insufficiens. Den kalla ischemi tid i denna experimentella inställning är inte lika viktigt som varm ischemia tid, men bör inte överstiga 45 minuter. Den varma ischemi tid bör ligga runt 35 minuter och inte heller överstiga 45 minuter, eftersom detta kan orsaka högre postoperativ mortalitet. Den idealiska givare och mottagare vikt är ca 200 g eftersom mindre råttor inte tål proceduren väl och vikt över 300 g förknippas med överdriven intraabdominalt fett. Råttorna förlorar upp till 20% av kroppsvikten i direkt postoperativa perioden, men ska börja gå upp i vikt igen efter 6-8 dagar postoperativt (Figur 2). Dagliga hälsokontroller (vakenhet, päls och slemhinnor utseende, vikt, avföring kvalitet och frekvens) ska utföras till dess att djuret offras. Vi rekommenderar daglig administrering av antibiotika och analgesi under åtminstone de första tre dagarna som beskrivits ovan. Efter inledande praktik, särskilt i mikrovaskulära och anastomoser tarm, ger denna modell tillförlitlig och stabil långsiktig överlevnad på cirka 80-90% i isogena inställning. I allogenic inställning överlevnad är generellt lägre, beror huvudsakligen på immunologiska fenomen som akut och kronisk avstötning och kan variera mycket beroende på den immunsuppressiva regimen används och testas.

Tekniska noter: Givaren drifttid bör vara ca 45 minuter. Mottagaren, bör denna inte mycket större än 1,5 timmar. En värmedyna bör användas rutinmässigt för att undvika hypotermi i mottagaren. För enkel vaskulär access, kan den laterala svansvenen hos mottagaren ska kanyl i början av förfarandet med hjälp av en 22 g intravenös kateter. Bevattning av de intestinala lumen, såsom beskrivs ovan kan inte vara nödvändigt, utelämnar detta steg har till vår kännedom inga negativa effekter på resultatet och dödlighet.

Djurstudie krav: Djuren hölls enligt tillämpning lagar och andra författningar i Förbundsrepubliken Tyskland, statliga Nordrhein-Westfalen. Dokumentnumren enligt vilken tHan experiment godkändes kan begäras från motsvarande författare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
University of Wisconsin (UW) solution (ViaSpan) Bristol-Myers Squibb
Uro-Nebacetin N solution Nycomed 6967855
Ampicillin Ratiopharm
Carprofen (Rimadyl) Pfizer
Prolene 10-0 unresorbable suture Ethicon
Monocryl 6-0 resorbable suture Ethicon
Vicryl 3-0 resorbable suture Ethicon
i.v. Catheter G 20 1.1x33 mm Braun
i.v. Catheter G 22 0.9x25 mm Braun
Kodan Skin Prep Schülke
NaCl 0.9% Infusion solution Braun
Curved forceps small FineScienceTools 11009-13
Micro forceps curved AESCULAP BD 333
Micro forceps curved AESCULAP FD281R
Micro forceps straight 1 WPI 5
Micro forceps straight 2 WPI 2
Micro needle holder WPI 14081
Micro scissors FineScienceTools 15006-09
Micro scalpel MANI Ophthalmic knife
Micro clamps AESCULAP FB329R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abu-Elmagd, K. M., et al. Five Hundred Intestinal and Multivisceral Transplantations at a Single Center: Major Advances With New Challenges. Ann. Surg. 250 (4), 567-56 (2009).
  2. Berney, T., et al. Portal versus systemic drainage of small bowel allografts: comparative assessment of survival, function, rejection, and bacterial translocation. J. Am. Coll. Surg. 195 (6), 804 (2002).
  3. Fishbein, T. M. Intestinal transplantation. N. Engl. J. Med. 361 (10), 998 (2009).
  4. Hernandez, F., et al. Is portal venous outflow better than systemic venous outflow in small bowel transplantation? Experimental study in syngeneic rats. J. Pediatr. Surg. 40 (2), 336 (2005).
  5. Monchik, G. J., Russell, P. S. Transplantation of small bowel in the rat: technical and immunological considerations. Surgery. 70 (5), 693 (1971).
  6. Murase, N., et al. Graft-versus-host disease after brown Norway-to-Lewis and Lewis-to-Brown Norway rat intestinal transplantation under FK506. Transplantation. 55 (1), 1 (1993).
  7. Murase, N., et al. Immunomodulation of intestinal transplant with allograft irradiation and simultaneous donor bone marrow infusion. Transplant Proc. 31 (1-2), 565 (1999).
  8. Pech, T., et al. Perioperative infliximab application ameliorates acute rejection associated inflammation after intestinal transplantation. Am. J. Transplant. 10 (11), 2431 (2010).
  9. Schaefer, N., et al. Resident macrophages are involved in intestinal transplantation-associated inflammation and motoric dysfunction of the graft muscularis. Am J Transplant. 7 (5), 1062 (2007).
  10. Schaefer, N., et al. Mechanism and impact of organ harvesting and ischemia-reperfusion injury within the graft muscularis in rat small bowel transplantation. Transplant. Proc. 38 (6), 1821 (2006).
  11. Schaefer, N., et al. Acute rejection and the muscularis propria after intestinal transplantation: the alloresponse, inflammation, and smooth muscle function. Transplantation. 85 (10), 1465 (2008).
  12. Xue, L., et al. Surgical experience of refined 3-cuff technique for orthotopic small-bowel transplantation in rat: a report of 270 cases. Am. J. Surg. 198 (1), 110 (2009).
  13. Zhang, X. Q., et al. Simplified techniques in rat heterotopic small bowel transplantation. Transplant. Proc. 38 (6), 1840 (2006).
  14. Zhao, Y., et al. The establishment of a new en bloc combined liver-small bowel transplantation model in rats. Transplant. Proc. 39 (1), 278 (2007).

Tags

Medicin anatomi fysiologi immunologi tarmtransplantation ortotopisk tunntarmen transplantation akut avstötning tunntarmen kirurgi drift råtta
Orthotopic tunntarmstransplantation i råttor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kitamura, K., von Websky, M. W.,More

Kitamura, K., von Websky, M. W., Ohsawa, I., Jaffari, A., Pech, T. C., Vilz, T., Wehner, S., Uemoto, S., Kalff, J. C., Schaefer, N. Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats. J. Vis. Exp. (69), e4102, doi:10.3791/4102 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter