Summary
小腸移植は、不可逆的な腸の障害を持つ患者のための受け入れられる治療の選択肢となっています。ラットにおける同所性小腸移植の私達の実験モデルは、腸移植を複雑に基礎免疫および炎症プロセスに対処するための信頼性の高いツールとして機能します。
Abstract
小腸移植は、非経口栄養の短腸症候群と障害（不可逆性腸疾患）の患者さんのために受け入れられている臨床検査オプションになっています。専門センターで手術を改善し、寿命1,3の高品質を提供しながら管理する戦略が優れた短期および中期患者および移植片の生存につながっている。他の固形臓器のより一般的な移植とは異なり（ すなわち心臓、肝臓）腸移植により誘導される腎機能および免疫学的変化の多くの根本的なメカニズムは完全に知られている6,7はありません。急性拒絶反応、敗血症および慢性移植片障害のエピソードはまだ不利な長期転帰に寄与し、潜在的にそのような移植の恩恵を受けるだろう在宅中心静脈栄養法を受けている患者が増えているにもかかわらず、手続きのより広範な雇用を妨げる主な障害となっている。小腸は含まれています乗客の白血球の数が多い一般的に腸関連リンパ系（GALT）腸移植の高いimmunogenity理由のこの部分の一部であると呼ばれる。移植粘膜の整合性が損なわれると、腸内で存在し、多くの共生および病原体の近接している（拒否するなどして）敗血症のエピソードの重症度を説明しています。信頼性と実現可能な動物モデルから生成される腸や臓器移植、より多くのデータのフィールドを進めるために必要とされる。モデルはここに一度標準化された方法で確立された信頼性と実現可能性の両方を兼ね備えていますし、腸の移植によってトリガされ、基礎となる複雑な分子、細胞および機能メカニズムに貴重な洞察を提供することができます提供しました。我々は、正常に我々の研究室で8月11日で5年以上にわたって記載されている手順を使用し、洗練されてきた。 Joveのビデオベースの形式は複雑proceを実証するために特に有用であるdureおよび腸管移植を調査同所齧歯類モデルを確立することを計画してグループのための初期の落とし穴を避けることができます。
Protocol
1。ドナー操作
- ドナーラットを24時間（水/グルコース溶液への無料アクセス）の絶食に保つ必要があります。
- イソフルラン吸入麻酔を誘導するために、標準のアトマイザーで2％で始まり、その後開腹術を行った後、1％まで減らすことができます。鎮静状態をチェックするためにつま先のピンチを実行します。
- 腹部を剃ると皮膚の準備3回（講談）で清掃してください。その後、鎮痛剤の皮下投与後の正中切開を行います。
- 移植片は生理食塩水に浸したガーゼでラップされた後、Q-ティップ（6X倍率の手術用顕微鏡下）で穏やかに膵臓と上行結腸の間の生理的な癒着を分離します。
- 結紮すると7から0シルクを使用した回盲＆真ん中＆右結腸の血管を分割します。上行結腸は腸間膜静脈（SMV）の右側に広げられた後、回盲部、右および中結腸船は7から0の関係を用いてライゲーションおよび除算を識別することができます。
- 全体SMVがまっすぐと露出するように、上向きに胃を縮める。引き込み用の蚊クランプを使用しています。クランプは、必要に応じた形状に形成された粘土の塊によって保持されている。
- SMVから来る膵十二指腸静脈を結紮し、分割します。膵組織が移植から削除することができます前に、SMVから発信されたすべての小さな膵十二指腸静脈は慎重に、識別された7から0シルクで結紮し、分割しなければなりません。
- SMVと腹部大動脈の間のすべてのリンパ管を含む失う結合組織を結紮し、分割します。まだ腹部の右側に移植すると、SMV、腹部大動脈がアクセス可能であるとの間のすべてのリンパ管を含む結合組織を失う。この結合組織は、7から0の絹を用いて連結し、腸移植から術後のリンパ漏を避けるために分割する必要があります。
- 右腎動脈を結紮し、分割します。結合組織が分割された後、右腎動脈はaccessiblになるeと7から0絹を用いて連結し、分割されています。
- 全身陰茎静脈を介してヘパリンIVの200台を用いたラットをheparinise。
- マージナル動脈を結紮し、十二指腸空腸接合時および回腸末端部で小腸を分割します。
- 大動脈は、SMAの原点に近位に連結される。門脈は脾静脈に合流する地点に離断されています。その後、移植片は、大動脈セグメントを持つSMAのその血管茎から成ると収穫されます。
2。 Backtable手順
- 4℃ウィスコンシンソリューション（UW）大学の3ミリリットルを用いて移植片を灌流大動脈導管を介してCと4℃で泌尿Nebacetin Nの溶液30mlと空腸端から腸管腔を灌漑（ルーメン灌漑は必須です） 。
直ちに移植を抽出した後、大動脈導管は3ミリリットルチルドUW液で灌流するために使用されます。で、このため、20G静脈カテーテル10mlの注射器が使用されます。灌流液は門脈から自由に流出することが観察されるべきである。 Nebacetinと腸の灌漑のために、50mlの注射器が使用されます。
- 受信者の準備中に4℃でUW液で移植を格納します。
3。受信者動作
- レシピエントラットを24時間（水/グルコース溶液への無料アクセス）の絶食に保つ必要があります。
- イソフルラン吸入麻酔を誘導するために、標準のアトマイザーで2％で始まり、その後開腹術を行った後、1％まで減らすことができます。鎮静状態をチェックするためにつま先のピンチを実行します。
- 腹部を剃ると皮膚の準備3回（講談）で清掃してください。その後術中鎮痛カルプロフェン5 mg / kg皮下の皮下投与後の正中切開を行います。
- 生理食塩水に浸したガーゼで受信者の腸をラップして、受信者の胸の上に置きます。
- 綿棒とぶっきらぼうに後腹膜を開き、abdomiを公開ただ、必要に応じてダウン腸骨血管のレベルに腎血管、以下NAL大動脈と下大静脈はまたmicroscissorsを使用しています。血液の損失を避けるために、7から0シルクを使用した大動脈と大静脈から小さな腰と脊椎tribuariesをライゲーションする。 （これを行うには、16倍に手術用顕微鏡のズームを変更してください。）
- 左腎血管近位および遠位微小血管クリップを使用して腸骨分岐上記下大動脈と下大静脈をクロスクランプ。唯一つのクランプを同時に両方の血管をクランプするために遠位ならびに近位使用されています。前方microknifeを使用して両方の血管を切開し、残りの血液を洗い流す。
- 連続10から0 PROLENE縫合糸を用いて移植大動脈セグメントと受信者の大動脈大動脈の間に端側吻合を作成..当初、移植片は下ステー縫合の動脈吻合と抱き合わせの後ろの壁のステッチを実行するために腹部の右側（12時の位置に配置されたラットの頭）に配置されます。木曜日enは、グラフトは吻合部の前壁を露出し、縫合する腹部の左側（9時位置に配置されたラットの頭）に引き渡されます。
- グラフト門脈と受信者の間でIVC端側吻合が10から0 PROLENEを使用して縫合を実行することにより、同様に実行されます。ラットまだ横向きに横たわって（9時の位置でヘッド）と、グラフトは、腹部の左側に配置され、下ステー縫合が配置されます。吻合は血管の内側から後ろの壁を使って起動されます。下ステー縫合糸が結ばれた後は、前壁のステッチは外側から行うことができます。
- アッパークランプ続いた最初の遠位クランプを取り外します。すべて吻合出血は綿棒を使用して直接圧力によって制御される。移植片は、平等かつ迅速な再灌流をチェックする必要があります。
- 腸間膜血管の結紮後全体受取人の小腸を切除。受信者は、プロの2-3センチメートルを維持したまま、小計腸切除を受けるximal空腸及び回腸遠位部の1cm。
- 6から0 Monocrylで中断1層縫合糸を用いて腸吻合を終了するには、エンド·近（空腸空腸吻合術）と遠位（回腸造設）により腸の連続性を復元します。約16の縫合糸は、吻合を完了するために必要とされる。
- きれいになるまでは通常の生理食塩水で腹腔内を洗浄してください。水分補給のために腹腔内に生理食塩水2mlを管理します。その後3から0筋層用VICRYLプラス連続皮膚縫合糸で連続縫合を使用して腹部を閉じます。
- 術後のラットは標準ラット飼料と水を自由に摂取上で再起動し、別の24時間絶食（水とグルコース溶液へのアクセス権を持つ）に保つ必要があります。カルプロフェンと鎮痛は3日（以下の用量を参照）のために投与されるべきである。
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Representative Results
通常の術後経過
移植された動物は約1時間熱ランプ下の手順から迅速に回復する必要があります。低体温は術後死亡の主要な原因であるため、慎重に内および術後に避けるべきである。術中流体損失は2.5ミリリットル生理食塩水の皮下注射プラス2.5ミリリットルグルコース5パーセント最初の24時間毎に8時間に置き換えなければなりません。ラットはまた、術後最初の24時間のためにグルコース溶液（またはゲルダイエット）と水POへの無料アクセスを提供しなければなりません。この期間の後、彼らは標準ラット飼料と水を自由に摂取への無料アクセスを正常な摂食行動を取り戻す必要があります。痛みは麻酔導入時に投与されるべき1枚目の撮影で、三日間カルプロフェン5 mg / kg皮下毎日の投与によって制御されます。周術期の抗生物質の予防的投与は、同種の設定で必要とされ、その5-7日（アンピシリン15 mg / kg皮下、qの12時間）にわたって投与することができます。一般外観、毛皮の条件など、粘膜の外観が正常である必要があります。 PODの1後の活動レベルは、術前の状態に戻す必要があり、無関心のまたは異常な動作が早期手術合併症を示唆している。体重の20％までの初期損失後のラットは、術後6月8日の周りに再び体重を得るために開始され、（拒否されずに同質設定の）術後14日目の周りに普通に自分の術前の体重の約90％に達しています。
術後合併症
前述のように、膨らんだ腹部、無関心の振る舞い、給餌の中止および一般的な外観（フリル毛皮、目からの分泌）の変化が起こりうる合併症の症状として考慮されるべきである。動物は外科医と獣医によって見られるべきである。腸吻合部の狭窄による腹膜炎、腸閉塞のために脱水、炎症状態のような条件は、不十分な鎮痛薬などがルールでなければなりませんD OUTと扱われます。動物が治療にもかかわらず回復しない場合は、実験の中止を動物実験の規制を適用することに基づいてケースバイケースで評価する必要があります。
図1a。楽器。
1。顕微鏡（Leica）
2。麻酔装置（EICKEMEYER）
図1b。楽器。
3。シェーバー
4。電子メス（ガイガー）
5。外科手術用鉗子
6。 DeBakey鉗子は、湾曲
7。小さな湾曲鉗子
8。マイクロ鉗子は、湾曲
9。 Microはストレート1鉗子
10。 Microはストレート2鉗子
11。マイクロニードルホルダー
12。ニードルホルダー
13。モスキート鉗子
14。はさみ1
15。はさみ2
16。 Microscissors
17。マイクロメス
図1c。楽器。
18。 Microclamps
19。カニューレとQティップ（図示せず）
20。シリンジ（50ミリリットル、10ミリリットル、2.5ミリリットル、1ミリリットル）
図1c。楽器。
21。移植ストレージ用UW液
22。グラフト内腔の灌漑のための抗生物質（URO-nebacetin N）
23。グラフト灌流用UW
24。生理食塩水
25。生理食塩水で皿（backtable用）
図2。平均術後の体重（累積データ）。図2は、同所小腸移植後の平均術後の重量を示しています。体重の20％までの初期損失後のラットは、術後6月8日の周りに再び体重を得るために開始し、その術前の90％に達しています術後14日目の周りの正常erative重量（拒否/免疫抑制せずに同質の設定で） 図2ではない生存、減量のデータを表し、減量を測定するために利用可能な動物の減少数は、実験のための動物のsacrifingが主な要因です。
図3：膵臓組織（矢印）が大腸から除去されなければならない。
図4結紮とSMVと腹部大動脈の間のすべてのリンパ管を含む結合組織を失い、右腎動脈（矢印）は絹の合字間で分割された後に分割する。
図5大動脈導管を介してUW液とグラフトの灌流。
図6受信者下大静脈と大動脈を調製した後血管が露出しており、クランプするための準備が整いました。
図7：クロスクランプは上大静脈と同時に大動脈microclampsを使用して実行されます。
図8（a）は大動脈大動脈吻合滞在縫合糸を使用して実行されます。 （b）は大動脈大動脈吻合終了後、門脈大静脈吻合は、次が実行されます。下ステー縫合が記述されています。
図9（a）は門脈大静脈吻合は縫合糸が所定の位置にある第二滞在後に開始されます。 （b）はCの後門脈大静脈吻合のompletion。
図10移植がうまくreperfusesクランプを除去した後。
図11（）腸吻合のための滞在縫合糸の配置。 （b）は腸吻合を完了しました。
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Discussion
ラットにおける腸移植モデルが1970ies 5のように早く説明してきたが、最近採用のモデルのほとんどは、さまざまなテクニックを13を用いて異所性腸移植を伴う。一般的に異手順は簡単顕微技術や評価のための移植の容易なアクセス可能性の利点を持っているが、異所性腸移植が考慮移植小腸と収縮活性のように、その機能面の複数の相互作用を考慮しないという大きな欠点を持っており、共生と病原菌の広大なホストのコンテキストに同所移植を特徴付ける粘膜のバリア機能。当社グループは、本明細書に記載され同所性モデルと我々の知見を持つ大規模な経験を得ていることは、炎症性および適応免疫応答によって引き起こされる特定の変化の多くは、機能的なプロのコンテキスト内で評価されなければならないことを示唆している収縮や粘膜の整合性のような、移植された小腸のperties。注目すべきは、ここで用いた吻合技術は手続きを容易にし、特にmultivisceral移植12,14のモデルでは、重要な温虚血時間を短縮することが示されているそのうちのいくつかは動脈または静脈の袖口、の使用が含まれていません。それはmultivisceral移植の齧歯類モデルでカフの技術を採用する必要があるかもしれませんが、袖口の複雑になりがちな可能性は、単一の腸移植のこのモデルでは、同様の技術を回避するために、私たちをリードしてきました。我々はこのモデルでは、ポータル排水技術を使用しようとしていない。別に技術的に困難であることから（小さい門脈径は静脈流出の問題につながる可能性があります）、それは確立して、モデル全体がより困難になるだろう - それは、臨床腸移植全身排水で大多数の症例で使用されているという事実である。したがって、記載された技術のREFL技術的な実現可能性と組み合わせる臨床実践をECTS。移植片のポータル排水は2,4いくつかの臨床的および実験的研究で優れた成果に関連付けられていることが示されていない。安定した動物の生存のために必要な約35分の十分短い虚血時間は、このモデルの学習曲線の終了後に達成することができます。
このプロトコルに従って、同所小腸移植は約30から40の手順を実行した後microsurgicallyベテランの研究者によって習得することができます。 Joveの形式によって達成されるような可視化は、直接目視やおそらく方法の少ない動物の犠牲の迅速確立につながる技法を正確に再現することができます。臨界点は、寒さと暖かい虚血時間と腸吻合部狭窄/不全、出血しています。この実験設定で寒い虚血時間は暖かいischeほど重要ではないMIAは、時間が、45分を超えてはいけません。温虚血時間は35分前後になると、これはより高い術後死亡の原因となることがあり、また、45分を超えてはいけません。小さなネズミが300グラムを優に超えると重量手順を容認しないため、理想的なドナーとレシピエントの体重は200グラム前後であるが、過度の腹腔内脂肪に関連付けられています。ラットは直接術後の期間に体重の20％まで失うが、術後6-8日（ 図2）した後に再び体重を得るために開始する必要があります。動物が殺されるまで、毎日の健康チェックが（覚醒、毛皮や粘膜の外観、重量、便の質と周波数）を実行する必要があります。我々は、上記のように、少なくとも最初の3日間、抗生物質や鎮痛剤の連日投与をお勧めします。最初の練習の後で、特に微小血管および腸吻合の、このモデルは同質の設定で80から90％程度の信頼性と安定した長期生存を提供しています。 allogeでNIC設定の生存率は、一般的に低い急性および慢性拒絶反応のような免疫学的現象に主に依存しており、使用およびテスト免疫抑制療法によると大きく異なることがあります。
テクニカルノート：ドナー手術時間は約45分であるべきである。受信者動作がはるかに1.5時間を超えてはいけません。加熱パッドは、受信者に低体温症を避けるために、日常的に使用されるべきである。簡単に血管アクセスについては、受信者の外側尾静脈は22 G静脈カテーテルを使用して、プロシージャの先頭にカニューレを挿入することができます。上記のように腸管腔の灌漑は必要でないかもしれません、このステップを省略すると、我々の知識に転帰と死亡率には負の効果を持っていません。
動物実験の要件：動物はドイツ連邦共和国、国家ノルトラインウェストファリアの適用法令に従って維持された。トン下の文書番号彼の実験はそれに対応する者から要求することができます承認された。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| University of Wisconsin (UW) solution (ViaSpan) | Bristol-Myers Squibb | ||
| Uro-Nebacetin N solution | Nycomed | 6967855 | |
| Ampicillin | Ratiopharm | ||
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer | ||
| Prolene 10-0 unresorbable suture | Ethicon | ||
| Monocryl 6-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| Vicryl 3-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| i.v. Catheter G 20 1.1x33 mm | Braun | ||
| i.v. Catheter G 22 0.9x25 mm | Braun | ||
| Kodan Skin Prep | Schülke | ||
| NaCl 0.9% Infusion solution | Braun | ||
| Curved forceps small | FineScienceTools | 11009-13 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | BD 333 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | FD281R | |
| Micro forceps straight 1 | WPI | 5 | |
| Micro forceps straight 2 | WPI | 2 | |
| Micro needle holder | WPI | 14081 | |
| Micro scissors | FineScienceTools | 15006-09 | |
| Micro scalpel | MANI | Ophthalmic knife | |
| Micro clamps | AESCULAP | FB329R |
References
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