Summary
Transplante de intestino delgado tornou-se uma opção de tratamento aceitável para os pacientes com falência intestinal irreversível. Nosso modelo experimental de transplante intestinal ortotópico pequena em ratos serve como uma ferramenta confiável para enfrentar imunológico subjacente e os processos inflamatórios que complicam o transplante intestinal.
Abstract
Transplante de intestino delgado, tornou-se uma opção clínico aceite para doentes com síndrome do intestino curto e insuficiência de nutrição parentérica (insuficiência intestinal irreversível). Em centros especializados melhorou operatório e estratégias de gestão levaram a paciente a curto e médio prazo e excelente sobrevida do enxerto, proporcionando alta qualidade de vida 1,3. Ao contrário do transplante mais comum de outros órgãos sólidos (coração, fígado ou seja,) muitos mecanismos subjacentes da função do enxerto e alterações imunológicas induzidas por transplante intestinal não são totalmente conhecidos 6,7. Episódios de rejeição aguda, septicemia e insuficiência crônica do enxerto são os principais obstáculos ainda contribuem para menos favorável resultado a longo prazo e dificultando um emprego mais amplo do procedimento, apesar de um número crescente de pacientes em nutrição parenteral domiciliar que potencialmente podem beneficiar de um transplante de tal. O intestino delgado contémum grande número de leucócitos passageiros comumente referida como parte do intestino associada sistema linfóide (GALT), esta sendo parte da razão para a alta immunogenity do enxerto intestinal. A presença ea proximidade de muitos comensais e patogénicos no intestino explica a gravidade dos episódios de sépsis, uma vez a integridade da mucosa do enxerto for comprometida (por exemplo, rejeição). Para avançar no campo de dados de múltiplos órgãos intestinais e transplante mais gerados a partir de modelos animais confiáveis e viáveis é necessário. O modelo aqui fornecida combina confiabilidade e viabilidade uma vez estabelecido de forma padronizada e pode fornecer informações valiosas nas subjacentes complexos moleculares, os mecanismos celulares e funcionais que são acionados por transplante intestinal. Nós temos utilizado com sucesso e refinado o procedimento descrito ao longo de mais de 5 anos no nosso laboratório 8-11. O formato de vídeo baseado JoVE é especialmente útil para demonstrar o procedimento complexoDure e evitar as armadilhas iniciais para grupos de planejamento para estabelecer um modelo de roedor ortotópico investigando o transplante intestinal.
Protocol
1. Operação doador
- O rato dador devem ser mantidos em jejum durante 24 horas (acesso livre à água / solução de glicose).
- Para induzir a anestesia inalatória de isoflurano, comece com 2% sobre atomizador padrão, e em seguida, reduzir para 1% após a realização de laparotomia. Realize uma pitada de igual para verificar sedação.
- Raspar o abdômen e limpe com preparação da pele 3 vezes (Kodan). Em seguida, executar uma incisão mediana, após a administração subcutânea do analgésico.
- Após o enxerto ser envolta em gaze embebida salina, separam-se as aderências fisiológicas entre o pâncreas e do cólon ascendente cuidadosamente com um Q-tip (sob o microscópio cirúrgico com ampliação 6x).
- Ligadura e dividir os vasos cólica ileocecal e direita e meio usando 7-0 seda. Após o cólon ascendente foi espalhada para fora para o lado direito da veia mesentérica superior (SMV), os vasos de cólica ileocecal, direita e do meio pode ser identificado por ligadura e divisão usando 7-0 laços.
- Retrair o estômago para cima, de modo que a totalidade SMV é endireitada para fora e exposta. Use uma pinça mosquito para a retração. O dispositivo de fixação é realizada em massa plasticina formado em forma, conforme necessário.
- Ligadura e dividir as veias pancreatico-duodenais provenientes do SMV. Todas as pequenas veias pancreatico-duodenais provenientes do SMV deve ser cuidadosamente identificada, ligada com 7-0 seda e dividida antes do tecido pancreático pode ser removido a partir do enxerto.
- Ligadura e dividir o tecido conjuntivo, incluindo todos os perder linfáticos e SMV entre a aorta abdominal. Com o enxerto ainda está do lado direito do abdómen, o tecido conjuntivo frouxo, incluindo todos os vasos linfáticos e SMV entre a aorta abdominal é acessível. Este tecido conjuntivo devem ser ligados utilizando 7-0 seda e dividido para evitar linforréia pós-operatória do enxerto intestinal.
- Ligadura e dividir a artéria renal direita. Depois que o tecido conjuntivo é dividido, a artéria renal direita torna-se accessible e é ligada e dividida usando 7-0 seda.
- Sistemicamente heparinise o rato, utilizando 200 unidades de heparina iv através da veia peniana.
- Ligar as artérias marginais, e dividir o intestino delgado na junção duodeno-jejuno e no íleo terminal.
- A aorta é ligada proximalmente para a origem da SMA. A veia porta é seccionado na confluência com a veia esplênica. Em seguida, o enxerto é colhida com o seu consistindo pedículo vascular da SMA com um segmento da aorta.
2. Procedimento Backtable
- Perfundir o enxerto com 3 ml de solução da Universidade de Wisconsin (UW), a 4 ° C, através da conduta aórtica e irrigar o lúmen intestinal a partir do final do jejuno, com 30 ml de solução Nebacetin Uro-N, a 4 ° C (a irrigação do lúmen é obrigatório) .
Imediatamente após a extracção do enxerto, o conduto aórtico é utilizada para a perfusão, com 3 ml de solução gelada de UW. Para isto, um cateter de 20 G em ivuma seringa de 10 ml. O perfusato deve ser observada a fluir livremente para fora a partir da veia portal dividido. Para a irrigação intestinal com Nebacetin, uma seringa de 50 ml.
- Armazene a solução de enxerto de UW, a 4 ° C durante a preparação do receptor.
3. Operação destinatário
- O rato receptor devem ser mantidos em jejum durante 24 horas (acesso livre à água / solução de glicose).
- Para induzir a anestesia inalatória de isoflurano, comece com 2% sobre atomizador padrão, e em seguida, reduzir para 1% após a realização de laparotomia. Realize uma pitada de igual para verificar sedação.
- Raspar o abdômen e limpe com preparação da pele 3 vezes (Kodan). Em seguida, executar uma incisão mediana, após a administração subcutânea de carprofeno 5 mg / kg sc de analgesia.
- Enrole o intestino destinatário em gaze embebida soro fisiológico e colocá-lo no peito do destinatário.
- Abra o retroperitônio sem rodeios com Q-dicas, e expor a abdominal aorta ea veia cava inferior, logo abaixo dos vasos renais para baixo para o nível dos vasos ilíacos, se necessário também usar microtesoura. Ligar o tribuaries pequenas e lombar da coluna vertebral da aorta e veia cava usando 7-0 seda para evitar a perda de sangue. (Para fazer isso, altere o zoom microscópio cirúrgico até 16x.)
- Atravesse-braçadeira a aorta ea veia cava inferior abaixo dos vasos renais esquerda proximal e acima da bifurcação ilíaca distalmente usando clipes de microvasos. Apenas uma braçadeira é utilizada proximal distal, bem como para fixar ambos os navios simultaneamente. Incisão ambos os navios anteriormente usando um microlanceta e lavar o sangue restante.
- Criar uma anastomose término-lateral entre o segmento da aorta infra-renal da aorta do enxerto e do destinatário, usando uma sutura continua de prolene 10-0 .. Inicialmente, o enxerto é colocado no lado direito do abdómen (a cabeça do rato posicionado a 12 horas) para realizar os pontos da parede de trás da anastomose arterial e atar o fio de sutura inferior estadia. Then, o enxerto é virado para o lado esquerdo do abdómen (a cabeça do rato posicionado a 09:00), para expor e sutura da parede frontal da anastomose.
- Anastomose término-lateral entre a veia porta do doador e do receptor IVC é realizada do mesmo modo, executando usando suturas 10-0 Prolene. Com o rato ainda lateralmente deitadas (cabeça na posição 9 horas), o enxerto é colocado no lado esquerdo do abdómen inferior e um fio de sutura é colocado estadia. A anastomose é iniciado com a parede do fundo do interior do vaso. Após a sutura está ligada estadia inferior, os pontos da parede frontal podem ser executadas a partir do exterior.
- Remover os grampos distais primeiro lugar, seguido pelos grampos superiores. Qualquer sangramento anastomótico é controlada pela pressão direta usando Q-dicas. O enxerto deve ser verificado para igual e reperfusão rápida.
- Ressecar intestino delgado do destinatário inteiro após a ligadura dos vasos mesentéricos. Destinatários enterectomizados subtotal, preservando 2-3 cm de projejuno ximal e 1 cm do íleo terminal.
- Restaurar a continuidade entérico por proximal (jejuno-jejunostomia) e distal (íleo-ileostomia) de ponta a ponta anastomoses intestinais utilizando uma sutura interrompida uma camada com 6-0 Monocryl. Cerca de 16 pontos são necessários para completar as anastomoses.
- Irrigar a cavidade peritoneal com solução salina normal até ficar limpo. Administrar 2 ml de soro fisiológico por via intraperitoneal para a reposição de líquidos. Em seguida, feche o abdômen com uma sutura contínua com Vicryl 3-0 para a camada muscular, mais uma sutura da pele contínua.
- No pós-operatório os ratos devem ser mantidos em jejum (com acesso a água e uma solução de glucose) para um outro 24 hr depois reiniciado em dieta padrão e água ad libitum. Analgesia com carprofeno deve ser administrada durante 3 dias (ver dosagem abaixo).
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Representative Results
Evolução pós-operatória normal
Os animais transplantados deve se recuperar rapidamente do procedimento sob uma lâmpada de calor por cerca de 1 hora. A hipotermia é uma das principais causas de mortalidade no pós-operatório e devem ser evitados intra e pós-operatório. As perdas de fluido intra-operatória deve ser substituído por injeção subcutânea de 2,5 ml de solução salina normal mais 2,5 ml de glicose 5% a cada 8 horas para a primeira hora 24. Os ratos também devem ter livre acesso à solução de glicose (ou dieta gel) e po de água para a 24 hr primeiro pós-operatório. Após esse período, deve recuperar comportamento alimentar normal com acesso livre à ração e água à vontade. Dor é controlada através da administração de carprofeno 5 mg / kg sc diariamente durante três dias, com o primeiro tiro a ser administrada na indução da anestesia. Profilaxia antibiótica perioperatória só é necessária na configuração alogénico, e pode ser administrada ao longo de 5-7 dias (ampicilina 15 mg / kg sc, q. 12 hr). Geralaparência, a condição da pele, bem como a aparência da mucosa deve ser normal. Depois de um POD o nível de atividade deve voltar ao estado pré-operatório, o comportamento apatia ou anormal sugere complicações cirúrgica precoce. Após a perda inicial de até 20% do peso corporal dos ratos vai começar a ganhar peso novamente por volta do dia pós-operatório 6-8 e terá atingido cerca de 90% do seu peso pré-operatória normalmente por volta do dia pós-operatório 14 (na configuração isogénica sem rejeição).
Complicações pós-operatórias
Como indicado acima, um abdómen distendido, comportamento apatia, a suspensão de alimentação e as alterações na aparência geral (pele enrugada, secreção dos olhos) devem ser consideradas como sintomas de possíveis complicações. Os animais devem ser vistos pelo cirurgião e um médico veterinário. Condições como estado, desidratação inflamatória devido à peritonite, íleo paralítico devido a estenose da anastomose intestinal, medicação para dor insuficientes e outros devem ser regrad fora e tratada. Se o animal não se recuperar, apesar do tratamento, a descontinuação do experimento deve ser avaliada caso a caso de acordo com a aplicação dos regulamentos em animais.
Figura 1a. Instrumentos.
1. Microscópio (LEICA)
2. Aparelho de anestesia (EICKEMEYER)
Figura 1b. Instrumentos.
3. Barbeador
4. Bisturi eletrônico (GEIGER)
5. Pinça cirúrgica
6. DeBakey fórceps curvado
7. Fórceps curvos pequena
8. Fórceps micro curvo
9. Micro pinça reta 1
10. Micro pinça reta 2
11. Suporte da agulha micro
12. Suporte da agulha
13. Pinça mosquito
14. Tesoura 1
15. Tesoura 2
16. Microtesoura
17. Micro Bisturi
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Figura 1c. Instrumentos.
18. Microclamps
19. Cânulas e Q-Tips (não descrito)
20. As seringas (50 ml, 10 ml, 2,5 ml, 1 ml)
Figura 1c. Instrumentos.
21. UW solução para armazenamento de enxerto
22. Antibióticos (Uro-nebacetin N) para irrigação luz do enxerto
23. UW para perfusão do enxerto
24. Solução salina normal
25. Prato com soro fisiológico (para backtable)
Figura 2. Peso pós-operatória média (dados cumulativos). A Figura 2 mostra o peso médio pós-operatória após transplante ortotópico de intestino pequeno. Após a perda inicial de até 20% do peso corporal dos ratos começar a ganhar peso novamente por volta do dia pós-operatório 6-8 e terá atingido 90% da sua preoppeso operatória normalmente por volta do dia pós-operatório 14 (na configuração isogénica sem rejeição / imunossupressão). Figura 2 representa os dados de perda de peso, nem a sobrevivência, do número decrescente de animais disponíveis para medir a perda de peso se deve principalmente à sacrifing de animais para experiências.
Figura 3. O tecido pancreático (seta) tem que ser removido a partir do cólon.
Figura 4. Após ligando e dividindo-se o tecido conjuntivo frouxo, incluindo todos os vasos linfáticos e SMV entre a aorta abdominal, a artéria renal direita (seta) é dividido entre ligaduras de seda.
Figura 5. Perfusão do enxerto com uma solução de UW, via a conduta aórtica.
Figura 6. Após a preparação do receptor da veia cava e aorta vasos estão expostos, prontos para a fixação.
Figura 7. Braçadeira cruzada é realizada em veia cava e aorta utilizando simultaneamente microclamps.
Figura 8. (A) A anastomose aorto-aórtica é realizada utilizando suturas de ancoragem. (B) Após a conclusão da anastomose aorto-aórtica, a anastomose será realizada portocaval seguinte. A sutura inferior estadia já está em vigor.
Figura 9. (A) A anastomose portocaval é iniciado após a sutura segundo estadia está no lugar. (B) Depois de cEALIZAÇÃO da anastomose porto-cava.
Figura 10. Após a remoção dos grampos do enxerto reperfuses bem.
Figura 11. (A) Colocação de suturas de ancoragem para a anastomose do intestino. (B) Concluído anastomose intestinal.
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Discussion
Embora os modelos de transplante de intestino de ratos têm sido descritos, o mais cedo no 5 1970ies a maioria dos modelos recentemente utilizados envolvem transplante heterotópico intestinal utilizando diferentes técnicas 13. Enquanto os procedimentos heterotópico em geral, têm a vantagem de técnicas de microcirurgia mais fáceis e mais fácil acessibilidade do enxerto para a avaliação, o transplante heterotópico intestinal tem a grande desvantagem de não levar em conta as múltiplas interações do intestino transplantado pequeno e seus aspectos funcionais, como a atividade contrátil e a função da barreira da mucosa, que caracteriza um transplante ortotópico no contexto de um conjunto vasto de comensais e patogénicos. Nosso grupo ganhou uma grande experiência com o aqui descrito modelo ortotópico e nossos resultados sugerem que muitas das alterações específicas causadas por inflamatórias e respostas imunes adaptativas têm de ser avaliados no contexto com o pró funcionalperties do intestino transplantado pequena como a contratilidade ea integridade da mucosa. Digno de nota, as técnicas empregues aqui anastomóticos não incluem a utilização de bainhas arteriais ou venosos, alguns dos quais têm sido mostrados para facilitar o processo e reduzir o tempo de isquemia quente crítico, especialmente em modelos de transplante multivisceral 12,14. Embora possa ser necessário utilizar técnicas de punho em modelos de roedores de transplante multivisceral, o potencial complicativo das bainhas levou-nos a evitar técnicas semelhantes neste modelo de transplante de intestino único. Nós não tentamos usar técnicas de drenagem portal neste modelo. Para além de ser um desafio técnico (o diâmetro da veia portal pequeno poderia conduzir a problemas de fluxo venoso), o que tornaria todo o modelo mais difícil de estabelecer - é um facto que no escoamento transplante clínico intestinal sistémica é utilizado na maioria dos casos. Assim, a técnica descrita reflECTS prática clínica combinada com viabilidade técnica. Drenagem portal dos enxertos não tem sido mostrado para ser associado com resultados superiores em vários estudos clínicos e experimentais 2,4. Tempos de isquemia suficientemente curtas de cerca de 35 minutos necessários para a sobrevivência dos animais estável pode ser obtida após a conclusão do processo de aprendizagem para este modelo.
Transplante de intestino ortotópico pequeno de acordo com este protocolo pode ser aprendido por um pesquisador experiente microcirurgicamente após realizar procedimentos de aproximadamente 30-40. A visualização como conseguido pelo formato JoVE permite a observação visual directa e reprodução exacta das técnicas empregues que eventualmente conduz a mais rápido estabelecimento do método e do sacrifício menos animal. Os pontos críticos são sangramento, tempo de isquemia fria e quente e insuficiência intestinal anastomótica estenose /. O tempo de isquemia fria neste cenário experimental não é tão crucial como isquemia quentemia tempo, mas não deve exceder 45 minutos. O tempo de isquemia quente deve ser em torno de 35 minutos e também não pode exceder 45 minutos, pois isso pode causar maior mortalidade pós-operatória. O doador ideal e peso destinatário é de cerca de 200 g, porque os ratos menores não toleram bem o procedimento e peso acima de 300 g está associada com excesso de gordura intra-abdominal. Os ratos perder até 20% do peso do corpo no período pós-operatório directa mas deve começar a ganhar peso novamente após 6-8 dias de pós-operatório (Figura 2). Exames de saúde diários (de pele, alerta e aparência da mucosa, peso, qualidade das fezes e frequência) deve ser realizado até que o animal é sacrificado. Recomendamos administração diária de antibióticos e analgesia durante pelo menos os três primeiros dias, conforme descrito acima. Após a prática inicial, particularmente do microvascular e anastomoses intestinais, este modelo proporciona fiável e estável de sobrevivência a longo prazo de cerca de 80-90% na configuração isogénica. No allogenic sobrevivência configuração é geralmente inferior, depende principalmente de fenómenos imunológicos como a rejeição aguda e crónica e podem variar largamente de acordo com o regime imunossupressor utilizado e testado.
Notas técnicas: O tempo de operação do doador deve ser de cerca de 45 minutos. A operação destinatário não deve exceder muito 1,5 horas. A almofada de aquecimento deve ser usado rotineiramente para evitar a hipotermia no receptor. Para fácil acesso vascular, a veia lateral da cauda do receptor pode ser canulada no início do procedimento, utilizando um cateter de 22 G por via intravenosa. Irrigação do lúmen intestinal, tal como descrito acima pode não ser necessário, omitir este passo tem para o nosso conhecimento, não há efeitos negativos sobre o resultado e mortalidade.
Exigências do estudo de animais: Os animais foram mantidos de acordo com as leis aplicáveis e regulamentos da República Federal da Alemanha, Estado Renânia do Norte-Westfalia. Os números de documento em que tele experimentos foram aprovados pode ser solicitado ao autor correspondente.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| University of Wisconsin (UW) solution (ViaSpan) | Bristol-Myers Squibb | ||
| Uro-Nebacetin N solution | Nycomed | 6967855 | |
| Ampicillin | Ratiopharm | ||
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer | ||
| Prolene 10-0 unresorbable suture | Ethicon | ||
| Monocryl 6-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| Vicryl 3-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| i.v. Catheter G 20 1.1x33 mm | Braun | ||
| i.v. Catheter G 22 0.9x25 mm | Braun | ||
| Kodan Skin Prep | Schülke | ||
| NaCl 0.9% Infusion solution | Braun | ||
| Curved forceps small | FineScienceTools | 11009-13 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | BD 333 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | FD281R | |
| Micro forceps straight 1 | WPI | 5 | |
| Micro forceps straight 2 | WPI | 2 | |
| Micro needle holder | WPI | 14081 | |
| Micro scissors | FineScienceTools | 15006-09 | |
| Micro scalpel | MANI | Ophthalmic knife | |
| Micro clamps | AESCULAP | FB329R |
References
- Abu-Elmagd, K. M., et al. Five Hundred Intestinal and Multivisceral Transplantations at a Single Center: Major Advances With New Challenges. Ann. Surg. 250 (4), 567-56 (2009).
- Berney, T., et al. Portal versus systemic drainage of small bowel allografts: comparative assessment of survival, function, rejection, and bacterial translocation. J. Am. Coll. Surg. 195 (6), 804 (2002).
- Fishbein, T. M. Intestinal transplantation. N. Engl. J. Med. 361 (10), 998 (2009).
- Hernandez, F., et al. Is portal venous outflow better than systemic venous outflow in small bowel transplantation? Experimental study in syngeneic rats. J. Pediatr. Surg. 40 (2), 336 (2005).
- Monchik, G. J., Russell, P. S. Transplantation of small bowel in the rat: technical and immunological considerations. Surgery. 70 (5), 693 (1971).
- Murase, N., et al. Graft-versus-host disease after brown Norway-to-Lewis and Lewis-to-Brown Norway rat intestinal transplantation under FK506. Transplantation. 55 (1), 1 (1993).
- Murase, N., et al. Immunomodulation of intestinal transplant with allograft irradiation and simultaneous donor bone marrow infusion. Transplant Proc. 31 (1-2), 565 (1999).
- Pech, T., et al. Perioperative infliximab application ameliorates acute rejection associated inflammation after intestinal transplantation. Am. J. Transplant. 10 (11), 2431 (2010).
- Schaefer, N., et al. Resident macrophages are involved in intestinal transplantation-associated inflammation and motoric dysfunction of the graft muscularis. Am J Transplant. 7 (5), 1062 (2007).
- Schaefer, N., et al. Mechanism and impact of organ harvesting and ischemia-reperfusion injury within the graft muscularis in rat small bowel transplantation. Transplant. Proc. 38 (6), 1821 (2006).
- Schaefer, N., et al. Acute rejection and the muscularis propria after intestinal transplantation: the alloresponse, inflammation, and smooth muscle function. Transplantation. 85 (10), 1465 (2008).
- Xue, L., et al. Surgical experience of refined 3-cuff technique for orthotopic small-bowel transplantation in rat: a report of 270 cases. Am. J. Surg. 198 (1), 110 (2009).
- Zhang, X. Q., et al. Simplified techniques in rat heterotopic small bowel transplantation. Transplant. Proc. 38 (6), 1840 (2006).
- Zhao, Y., et al. The establishment of a new en bloc combined liver-small bowel transplantation model in rats. Transplant. Proc. 39 (1), 278 (2007).
