Summary
Малый трансплантации кишечника стало общепринятым вариантом лечения для пациентов с необратимыми кишечной недостаточности. Наши экспериментальные модели ортотопической небольшой трансплантации кишечника у крыс служит надежным инструментом для решения основных иммунологических и воспалительных процессов, которые усложняют кишечного трансплантации.
Abstract
Малый трансплантации кишечника стало общепринятым клиническим вариантом для пациентов с синдромом короткой кишки и недостаточности парентерального питания (необратимое кишечной недостаточности). В специализированных центрах улучшить оперативное управление и стратегии привели к отличным кратко-и среднесрочной пациентов и выживаемость трансплантата, обеспечивая при этом высокое качество жизни 1,3. В отличие от более распространенных трансплантации других солидных органов (например, сердца, печени), многие основные механизмы функция трансплантата и иммунологические изменения индуцированные кишечные трансплантации не совсем известно 6,7. Случаи острого отторжения, сепсис и хронической сердечной недостаточности трансплантата являются основными препятствиями по-прежнему способствует менее благоприятных долгосрочных результатов и препятствует более широкому занятости процедуру, несмотря на растущее число пациентов на дому парентерального питания тех, кто может извлечь выгоду из такой пересадки. В тонком кишечнике содержитсяБольшое количество пассажирских лейкоцитов обычно упоминается как часть кишечника лимфоидной системы (GALT) это является частью причиной высокой иммуногенности кишечного трансплантата. Наличие и близость многих комменсалы и патогенных микроорганизмов в кишечнике объясняется тяжести сепсиса эпизоды раз трансплантата слизистой целостность находится под угрозой (например, путем отказа). Для продвижения области кишечные и полиорганной трансплантации больше данных, полученных из надежных и возможные модели на животных необходимы. Модель предоставлена здесь сочетает в себе надежность и технико-экономическое когда она будет создана в стандартной форме и могут предоставить ценную информацию в базовой сложные молекулярные, клеточные и функциональные механизмы, которые вызваны кишечной трансплантации. Мы успешно использовали и уточнена процедура описана более чем на 5 лет в нашей лаборатории 8-11. Юпитер видео-формат особенно полезен для демонстрации комплексных процедурДюре и избежать ловушек для начальной группы планируют создать ортотопической грызунов исследования кишечного трансплантации.
Protocol
1. Донор операции
- Донор крысы должны быть поста в течение 24 ч (свободный доступ к воде / растворе глюкозы).
- Для индукции анестезии Isoflurane ингаляции, начните с 2% на стандартные форсунки, а затем уменьшить до 1% после выполнения лапаротомии. Выполните ноги щепотку, чтобы проверить седативный эффект.
- Бритье живот и очистить кожу Подготовка 3 раза (Kodan). Затем выполните средний разрез после подкожного введения анальгетиков.
- После прививки, завернутый в солевом растворе пропитанной марли, отделить физиологические спайки между поджелудочной железой и восходящей ободочной кишки осторожно Q-наконечник (под операционным микроскопом с 6-кратным увеличением).
- Лигируют и разделить илеоцекального и права и среднего колики судов, использующих 7-0 шелка. После восходящей ободочной кишки распространено на правой стороне верхней брыжеечной вены (SMV), илеоцекальной, правой и средней суда колики могут быть определены для перевязки и разделения использованием 7-0 связей.
- Втяните живот вверх, так что весь SMV, расправляют, а подвергается. Использование комаров зажим для отвода. Зажим проводится пластилин масса формируется в форму по мере необходимости.
- Лигируют и разделить pancreatico-перстной вены Исходя из SMV. Все мелкие pancreatico-перстной вены, происходящих из SMV должны быть тщательно определены, лигировали с 7-0 шелка и разделен перед ткани поджелудочной железы может быть удалена из трансплантата.
- Лигируют и разделить потерять соединительной ткани, в том числе все лимфатические между SMV и брюшной аорты. С трансплантата все еще на правой стороне живота, теряют соединительной ткани, в том числе все лимфатические между SMV и брюшной аорты является доступным. Эта соединительная ткань должна быть лигировали использованием 7-0 шелка и разделить, чтобы избежать послеоперационных лимфореи из желудочно-кишечного трансплантата.
- Лигируют и разделить правой почечной артерии. После того, как соединительная ткань делится, правой почечной артерии становится accessiblе и лигируют и разделил 7-0 использованием шелка.
- Системно heparinise крысы с использованием 200 единиц гепарина IV через вену полового члена.
- Лигируют предельной артерий, и разделить тонкой кишки при дуодено-соединения и тощей кишки в подвздошной кишки.
- Аорты лигируют проксимальнее происхождения SMA. Воротной вены перерезана в месте слияния с селезеночной вены. Затем трансплантат собирают с сосудистой ножке, состоящей из SMA с аорты сегменте.
2. Процедура Backtable
- Заливать трансплантата с использованием 3 мл Университета Висконсина решение (UW) при 4 ° С через аортальный трубопровода и орошения просвете кишечника от тощей кишки конца 30 мл Уро-Nebacetin решение N при 4 ° С (люмен орошения является обязательным) .
Сразу же после извлечения протеза, аорты трубопровод используется для перфузии с 3 мл охлажденной решение UW. Для этого 20 G IV катетер на10 мл шприц используется. Перфузат должны быть соблюдены, чтобы свободно вытекать из разделили воротной вены. Для кишечные орошения с Nebacetin, 50 мл шприц используется.
- Хранить трансплантата в решении UW при 4 ° C в ходе подготовки получателя.
3. Получатель операции
- Получатель крысы должны быть поститься в течение 24 ч (свободный доступ к воде / растворе глюкозы).
- Для индукции анестезии Isoflurane ингаляции, начните с 2% на стандартные форсунки, а затем уменьшить до 1% после выполнения лапаротомии. Выполните ноги щепотку, чтобы проверить седативный эффект.
- Бритье живот и очистить кожу Подготовка 3 раза (Kodan). Затем выполните средний разрез после подкожного введения Carprofen 5 мг / кг подкожно для интраоперационного обезболивания.
- Оберните получателя кишечника в нормальном физиологическом растворе пропитанной марли и положите его на грудь получателя.
- Откройте забрюшинного пространства прямо с Q-подсказки, и подвергать брюшнойвнутренней аорты и нижней полой вены чуть ниже почечных сосудов до уровня подвздошных сосудов, в случае необходимости также использовать microscissors. Лигируют небольшой поясничный и спинной tribuaries от аорты и полой вены 7-0 использованием шелка, чтобы избежать потери крови. (Для этого, изменения масштаба хирургического микроскопа 16x).
- Крест-зажим аорты и нижней полой вены ниже левой почечных сосудов проксимальнее и выше подвздошной бифуркации дистально использованием микрососудов клипов. Только один зажим используется проксимально, так и дистально зажать оба судна одновременно. Надрезать оба судна вперед использованием microknife и промыть оставшиеся крови.
- Создание конца в сторону анастомоза между трансплантатом сегмента аорты и инфраренальной аорты получателя с использованием непрерывного 10-0 Prolene шва .. Первоначально трансплантат находится на правой стороне живота (глава крысы расположен в 12 часов) для выполнения стежков назад стенке артериальных анастомозов и связывая нижней пребывания шва. Thан, трансплантат переданы в левой части живота (глава крысы расположены в 9 часов) для выявления и ушивания передней стенки анастомоза.
- Конец-в-бок анастомоза между трансплантатом воротной вены и нижней полой вены реципиента осуществляется также путем запуска швов использованием 10-0 Prolene. С крыса все еще лежала боком (голова в 9 часов), трансплантат расположены на левой стороне живота и нижней пребывания шва находится. Анастомоза начал с задней стенки изнутри судна. После того, как нижняя пребывания шва связано, передние стежки стены могут быть выполнены из вне.
- Снимите зажимы дистальных первой, а затем верхний зажимы. Любое кровотечение анастомоза находится под контролем прямого давления с помощью Q-Tips. Трансплантат должен быть проверен на равный и быстрый реперфузии.
- Резекции тонкой кишки всей получателя после перевязки сосудов брыжейки. Получатели пройти промежуточные итоги резекция тонкой кишки, сохранение 2-3 см проximal тощей кишки и 1 см дистального отдела подвздошной кишки.
- Восстановление кишечной непрерывности проксимальных (еюно-эюностомия) и дистальных (подвздошно-илеостомия) из конца в конец кишечного анастомоза использованием прервал один слой шва с 6-0 Monocryl. Около 16 швов, необходимых для завершения анастомоза.
- Промывать в брюшную полость с физиологическим раствором до полной очистки. Администрирование 2 мл физиологического раствора внутрибрюшинно для замены жидкости. Затем закройте живот с помощью непрерывного шва с 3-0 Викрил для мышечного слоя плюс непрерывного шва кожи.
- В послеоперационном периоде у крыс должна быть поста (с доступом к воде и раствора глюкозы) в течение еще 24 ч, затем перезапущен на стандартных крыс корма и воды вволю. Обезболивание с карпрофена следует вводить в течение 3 дней (см. дозировку ниже).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Нормальное течение послеоперационного периода
Пересаженных животные должны быстро восстановиться от процедуры, предусмотренной тепла лампы в течение примерно 1 часа. Гипотермия является одной из основных причин послеоперационной летальности и должны быть тщательно избегал внутри-и послеоперационном периоде. Потери Интраоперационная жидкость должна быть заменена подкожная инъекция 2,5 мл физиологического раствора плюс 2,5 мл Глюкоза 5% каждые 8 ч в течение первых 24 часов. Крысы также должны иметь свободный доступ к раствор глюкозы (или гель диеты) и воды ро в течение первых 24 часов после операции. По истечении этого срока они должны восстановить нормальное поведение кормлении со свободным доступом к стандартным крысы корма и воды вволю. Боль находится под контролем администрации карпрофена 5 мг / кг подкожно ежедневно в течение трех дней, с первого выстрела, чтобы вводить в наркоз индукции. Периоперационной антибиотикопрофилактики необходимо только в аллогенных установки, и может быть введен в течение 5-7 дней (ампициллин 15 мг / кг подкожно, д. 12 ч). Общийвнешний вид, мех состоянии, а также слизистой оболочки внешний вид должен быть нормальным. После POD 1 уровень активности должен вернуться в предоперационном состоянии, апатической или ненормального поведения предполагает ранних послеоперационных осложнений. После первоначальных потерь до 20% от массы тела крысы начнут набирать вес снова около 6-8 день после операции и достигнет около 90% от их веса предоперационной обычно около суток послеоперационного периода 14 (в изогенных настройки без отказа).
Послеоперационных осложнений
Как указывалось выше, вздутие живота, апатической поведения, прекращение кормления и изменения в общем виде (взъерошенные меха, выделения из глаз) следует рассматривать как признаки возможных осложнений. Животных должно быть видно хирург и ветеринар. Условия, как обезвоживание, воспалительные состояния из-за перитонита, непроходимости кишечника из-за стеноза анастомоза кишечника, недостаточность обезболивающие и другие должны быть правилаг, и лечиться. Если животное не восстанавливается, несмотря на лечение, прекращение эксперимента должны быть оценены на индивидуальной основе в соответствии с применением правил животного эксперимент.
На рисунке 1а. Инструменты.
1. Микроскопа (Leica)
2. Анестезия аппарата (EICKEMEYER)
Рисунок 1б. Инструменты.
3. Бритва
4. Электронный скальпель (Geiger)
5. Хирургические щипцы
6. Дебейки щипцы изогнутые
7. Изогнутый пинцет малый
8. Micro щипцы изогнутые
9. Micro щипцы прямой 1
10. Micro щипцы прямой 2
11. Микро-иглодержатель
12. Иглодержатель
13. Mosquito зажим
14. Ножницы 1
15. Ножницы 2
16. Microscissors
17. Micro скальпеля
Рисунок 1в. Инструменты.
18. Microclamps
19. Канюли и Q-Tips (не показан)
20. Шприцы (50 мл, 10 мл, 2,5 мл, 1 мл)
Рисунок 1в. Инструменты.
21. UW решение для хранения трансплантата
22. Антибиотики (Уро-nebacetin N) для орошения полости трансплантат
23. UW за взяточничество перфузии
24. Физиологический
25. Блюдо с физиологическим раствором (для backtable)
Рисунок 2. Средний послеоперационный вес (кумулятивные данные). На рисунке 2 показаны средние послеоперационных вес после ортотопической небольшой трансплантации кишечника. После первоначальных потерь до 20% от массы тела крысы начинают набирать вес снова около 6-8 день после операции и достигнет 90% от их preoperative вес обычно составляет около день после операции 14 (в изогенных настройки без отказа / иммунодефицитом). Рисунок 2 представляет потеря веса данных, а не выживания, уменьшение количества доступных животных для измерения потери веса происходит главным образом из-за sacrifing животных для экспериментов.
Рисунок 3. Ткани поджелудочной железы (стрелка) должна быть удалена из толстой кишки.
Рисунок 4. После лигирования и делением потерять соединительной ткани, в том числе все лимфатические между SMV и брюшной аорты, правой почечной артерии (стрелка) делится между шелковые лигатуры.
Рисунок 5. Кровоснабжение трансплантата с решением UW через аортальный трубопровод.
Рисунок 6. После подготовки получателей полую вену и аорту сосуды подвергаются, готовые для зажима.
Рисунок 7. Креста зажим осуществляется на полую вену и аорту одновременно, используя microclamps.
Рисунок 8. (А) аорто-аортального анастомоза осуществляется с использованием пребывания швов. (Б) После завершения аорто-аортального анастомоза, портокавальные анастомоза будет выполняться следующей. Нижний пребывания шов уже на месте.
Рисунок 9. (А) портокавальные анастомоза началось после второй шов пребывания на месте. (Б) После Completion из портокавальные анастомоза.
Рисунок 10. После снятия зажимов трансплантата reperfuses хорошо.
Рисунок 11. (А) Размещение пребывания швы на кишечнике анастомоза. (Б) Завершено кишечника анастомоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как кишечная модели трансплантации у крыс были описаны еще в 1970-е годы 5 наиболее недавно занятых модели включают гетеротопической кишечного трансплантации с использованием различных методов 13. В то время как гетеротопической процедур в целом имеют то преимущество, легче микрохирургической техники и легче доступность трансплантата для оценки, кишечные гетеротопической трансплантации имеет большой недостаток, не принимая во внимание многочисленные взаимодействия пересаженной тонкой кишки и ее функциональных аспектах, как сократительную активность и функции слизистой барьер, который характеризует ортотопической трансплантата в контексте огромное множество комменсалы и патогенных микроорганизмов. Наша группа приобрела большой опыт работы с описанными здесь ортотопической и наши результаты показывают, что многие конкретные изменения, вызванные воспалительными и адаптивного иммунного ответа, должны оцениваться в контексте с функциональными проperties трансплантированных тонкой кишки, как сократимость и целостности слизистой. Следует отметить, что анастомоза методы, используемые здесь, не включают в себя использование артериальной или венозной манжеты, некоторые из которых были показаны для облегчения процедуры и снизить критические теплое время ишемии, особенно в моделях multivisceral трансплантации 12,14. Хотя это может быть необходимо использовать манжету методы грызунов моделей multivisceral трансплантации, усложняющий потенциал манжеты привел нас, чтобы избежать подобных методов в этой модели одна кишечная трансплантации. Мы не пытались использовать портал методов дренажа в этой модели. Помимо того, что технически сложных (малый диаметр воротной вены может привести к проблемам венозного оттока), что сделает все модели более трудно установить, - это то, что в клинической трансплантации кишечного системный дренаж используется в большинстве случаев. Таким образом, описанная методика Reflектов клинической практике в сочетании с технической осуществимости. Портал дренаж прививок не было показано, связано с более высоких результатов в нескольких клинических и экспериментальных исследованиях 2,4. Достаточно короткого ишемии раз около 35 минут необходимо для стабильного выживания животных может быть достигнут после завершения обучения для этой модели.
Ортотопическая небольшой трансплантации кишечника в соответствии с этим протоколом можно узнать по микрохирургически опытного исследователя после выполнения примерно 30-40 процедур. Визуализации, как достигается Юпитера формат позволяет прямое визуальное наблюдение и точное воспроизведение занятых методы, которые, возможно, приводит к более быстрому созданию метода и менее жертвоприношения животных. Критические точки кровотечение, холодного и теплого времени ишемии кишечника и стеноз анастомоза / недостаточности. Холодное время ишемии в этой экспериментальной установки не так важны, как теплый ищемия времени, но не должно превышать 45 минут. Теплое время ишемии должна быть около 35 минут, а также не превышать 45 минут, так как это может привести к повышению послеоперационной летальности. Идеальный донор и реципиент вес составляет около 200 г меньше, потому что крысы не переносят процедуру хорошо и весом более 300 г связано с чрезмерным внутрибрюшного жира. Крысы теряют до 20% массы тела в прямой послеоперационный период, но должны начать набирать вес снова через 6-8 дней после операции (рис. 2). Ежедневные медицинские осмотры (настороженность, меха и слизистых внешний вид, вес, качество стула и частоты) должны быть выполнены, пока животное приносится в жертву. Мы рекомендуем ежедневное применение антибиотиков и обезболивания, по крайней мере в первые три дня, как описано выше. После первоначальной практике, в частности микрососудистых анастомозов и кишечника, эта модель обеспечивает надежное и стабильное долгосрочное выживание в пределах 80-90% в изогенных настройки. В allogeвыживание NIC настройки, как правило, ниже, в основном зависит от иммунологических явлений, таких как острый и хронический отказ и может широко варьироваться в зависимости от иммуносупрессивной терапии использованы и испытаны.
Техническое примечание: время донором операция должна быть около 45 минут. Получатель операция не должна намного превышать 1,5 часа. Грелку следует использовать регулярно, чтобы избежать переохлаждения у реципиента. Для удобства сосудистого доступа, латеральную хвостовую вену получателя может быть канюлю в начале процедуры с использованием 22 G внутривенного катетера. Орошение просвете кишечника, как описано выше, может не потребоваться, минуя этот шаг, чтобы наше знание не оказывает негативного воздействия на результат и смертности.
Требования исследования на животных: животных держали в соответствии с применением законов и правил Федеративной Республики Германии, Государственный Северный Рейн-Вестфалия. В документе номера, под которыми тОн эксперименты были одобрены можно запросить у соответствующего автора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| University of Wisconsin (UW) solution (ViaSpan) | Bristol-Myers Squibb | ||
| Uro-Nebacetin N solution | Nycomed | 6967855 | |
| Ampicillin | Ratiopharm | ||
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer | ||
| Prolene 10-0 unresorbable suture | Ethicon | ||
| Monocryl 6-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| Vicryl 3-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| i.v. Catheter G 20 1.1x33 mm | Braun | ||
| i.v. Catheter G 22 0.9x25 mm | Braun | ||
| Kodan Skin Prep | Schülke | ||
| NaCl 0.9% Infusion solution | Braun | ||
| Curved forceps small | FineScienceTools | 11009-13 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | BD 333 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | FD281R | |
| Micro forceps straight 1 | WPI | 5 | |
| Micro forceps straight 2 | WPI | 2 | |
| Micro needle holder | WPI | 14081 | |
| Micro scissors | FineScienceTools | 15006-09 | |
| Micro scalpel | MANI | Ophthalmic knife | |
| Micro clamps | AESCULAP | FB329R |
References
- Abu-Elmagd, K. M., et al. Five Hundred Intestinal and Multivisceral Transplantations at a Single Center: Major Advances With New Challenges. Ann. Surg. 250 (4), 567-56 (2009).
- Berney, T., et al. Portal versus systemic drainage of small bowel allografts: comparative assessment of survival, function, rejection, and bacterial translocation. J. Am. Coll. Surg. 195 (6), 804 (2002).
- Fishbein, T. M. Intestinal transplantation. N. Engl. J. Med. 361 (10), 998 (2009).
- Hernandez, F., et al. Is portal venous outflow better than systemic venous outflow in small bowel transplantation? Experimental study in syngeneic rats. J. Pediatr. Surg. 40 (2), 336 (2005).
- Monchik, G. J., Russell, P. S. Transplantation of small bowel in the rat: technical and immunological considerations. Surgery. 70 (5), 693 (1971).
- Murase, N., et al. Graft-versus-host disease after brown Norway-to-Lewis and Lewis-to-Brown Norway rat intestinal transplantation under FK506. Transplantation. 55 (1), 1 (1993).
- Murase, N., et al. Immunomodulation of intestinal transplant with allograft irradiation and simultaneous donor bone marrow infusion. Transplant Proc. 31 (1-2), 565 (1999).
- Pech, T., et al. Perioperative infliximab application ameliorates acute rejection associated inflammation after intestinal transplantation. Am. J. Transplant. 10 (11), 2431 (2010).
- Schaefer, N., et al. Resident macrophages are involved in intestinal transplantation-associated inflammation and motoric dysfunction of the graft muscularis. Am J Transplant. 7 (5), 1062 (2007).
- Schaefer, N., et al. Mechanism and impact of organ harvesting and ischemia-reperfusion injury within the graft muscularis in rat small bowel transplantation. Transplant. Proc. 38 (6), 1821 (2006).
- Schaefer, N., et al. Acute rejection and the muscularis propria after intestinal transplantation: the alloresponse, inflammation, and smooth muscle function. Transplantation. 85 (10), 1465 (2008).
- Xue, L., et al. Surgical experience of refined 3-cuff technique for orthotopic small-bowel transplantation in rat: a report of 270 cases. Am. J. Surg. 198 (1), 110 (2009).
- Zhang, X. Q., et al. Simplified techniques in rat heterotopic small bowel transplantation. Transplant. Proc. 38 (6), 1840 (2006).
- Zhao, Y., et al. The establishment of a new en bloc combined liver-small bowel transplantation model in rats. Transplant. Proc. 39 (1), 278 (2007).
