Summary
巨噬细胞发挥核心作用的动态平衡，并在许多组织的病理。这里介绍的协议描述消耗巨噬细胞的方法
Abstract
巨噬细胞是重要的球员，在传染病的挑战或损伤的先天免疫反应，发起的先天免疫反应和指挥后天免疫反应。巨噬细胞功能障碍可能导致无法安装适当的免疫反应，因此，已在许多疾病的进程，包括炎症性肠病牵连。巨噬细胞显示极化表型大致分为两类。经典活化的巨噬细胞，与干扰素γ或LPS刺激激活，发挥了至关重要的作用，在细菌的挑战，而另外激活的巨噬细胞，IL-4和IL-13激活，参与清除杂物和组织重塑和已在该决议牵连阶段的炎症。在体内的炎症反应，巨噬细胞的免疫细胞浸润的复杂混合物中发现，并可能加剧或resolvin参加Ğ炎症。巨噬细胞的作用，在整个动物模型的定义在原地 ，这是必要的检查消耗从复杂的环境中的巨噬细胞的影响。极化的巨噬细胞表型定义问原位巨噬细胞表型的作用的问题，可以导出体外 ，从骨髓穿刺，并加回或没有事先枯竭的巨噬细胞，小鼠。在这里提出的协议中含有氯膦酸二钠，脂质体，与PBS注射控件，用来消耗结肠巨噬细胞在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎。此外，巨噬细胞的极化，推导出体外，并转移到小鼠静脉注射。这种方法的一个需要注意的是，氯膦酸二钠含脂质体耗尽所有专业的吞噬细胞，包括树突状细胞和巨噬细胞，所以，以确保枯竭所观察到的效果是巨噬细胞特异性，重组ØF的巨噬细胞过继转移表型是必要的。全身巨噬细胞耗竭小鼠也可以通过回交小鼠实现到细胞CD11b-DTR背景，这是一个很好的补充办法。含有氯膦酸二钠脂质体介导的枯竭的优势是，它不参与回交小鼠需要的时间和费用，它可以在小鼠小鼠（C57BL / 6小鼠，BALB / c小鼠，或混合背景的背景下，无论使用）。
Protocol
1。使用含有氯磷酸二钠，脂质体的消耗巨噬细胞
- 脂质体储存在4°C注射前两个小时，从冰箱中取出氯膦酸二钠含脂质体，PBS含脂质体，或无菌PBS（喷射控制），使他们能够适应新环境室温（18℃）。
- 反转管含脂质体的8-10倍，以确保均匀分布，然后装入1 ml注射器200μL。将26号针头注射器顶端。
- 用你的左手，浮渣鼠标，略低于持有足够的皮肤以固定其头部和四肢的耳朵。
- 倾斜的鼠标，所以它的头是朝地面略等内脏器官从注射部位，这是位于腹部在较低的右象限移动。
- 滚你的手掌之间的注射器和倒置的6倍，以散布均匀注射前脂质体的解决方案。 <李>在鼠标腹部的右侧，在30-40度角插入针头。注入200μL脂质体溶液或PBS。
- 引起的炎症模型中，像DSS诱导的结肠炎，注入小鼠实验性炎症的发病4天前，以确保在驻地巨噬细胞和每2天的消耗，消耗新的浸润巨噬细胞的协议。
- 在实验结束后，随着计划中的实验分析，从网站的利益组织与多聚甲醛固定，确认巨噬细胞的免疫组织化学染色枯竭。
2。推导极化巨噬细胞从骨髓穿刺
- 从8至12周龄的小鼠骨髓骨髓来源的巨噬细胞的产量最高。安乐死的鼠标，把它在它的后面，并牵制它的爪子，尽可能伸展四肢。
- 工作无菌胡汉清D，取出股骨和胫骨，尽量削减尽可能多的肌肉。
- 装入装有26号针头5毫升注射器冲洗骨髓的骨头，用10％胎牛血清的IMDM培养。
- 稀释骨髓抽吸至40毫升的IMDM培养与FCS的10％，地方75厘米2组织培养瓶细胞，并于37°C间，5％CO 2 4小时。这一步去除贴壁的造血祖细胞的间质细胞或成熟的巨噬细胞。
- 转移培养上清中含有非贴壁祖到50毫升锥形猎鹰管和离心5分钟在1200转。
- 重悬细胞沉淀IMDM培养5毫升，10％FCS和核细胞数在20乙酸稀释细胞悬液1。此过程中溶解的所有细胞，包括红血细胞和余下的核可以在血球计数。
- 在浓度为0.5×10 6细胞/毫升完全培养基重悬细胞; IMDM培养，10％胎牛血清，150微米monothioglycerol胺酶（MTG），10毫微克/毫升要么MCSF，GM-CSF或IL-3。以MCSF衍生的巨噬细胞是经典而GM-CSF或IL-3-衍生的巨噬细胞激活或者激活的巨噬细胞。
- 在4天更换培养基，纺非贴壁细胞，并把他们送回烧瓶，并在第7天，丢弃非贴壁细胞。
- 此外，γ干扰素（10毫微克/毫升）或IL-4（10毫微克/毫升），可以添加到烧瓶包含歪斜巨噬细胞在第7天的派生MCSF-细胞经典激活或交替激活型，分别为。孵育3天的细胞。
- 在10天，除去媒体和解除细胞组织培养瓶使用细胞分离液（GIBCO-BRL）。放置5毫升的缓冲5分钟，在室温（18℃）对细胞，然后与你的手掌根部牢牢几次一鼓作气瓶侧面。确保已解除，细胞通过检查下瓶瓶显微镜。到15毫升锥形猎鹰管吸取悬浮细胞，用IMDM培养，10％FBS的一个额外的10毫升的烧瓶。游泳池和降速在5分钟的300×G细胞。
- 可行的使用浓度在10 7细胞/ ml无菌PBS PH7.4 1血细胞计数和重悬细胞计数。巨噬细胞注射到小鼠体内的准备。
- 储备1.0×10 6巨噬细胞巨噬细胞表型的评估。经典激活巨噬细胞脂多糖分泌高浓度的一氧化氮和IL-10 IL-12p70和低水平的刺激相比，或者激活巨噬细胞。另外激活的巨噬细胞组成性表达YM1和精氨酸我（ArgI）的，可以由西方免疫检测。
3。 Tranferring到小鼠的巨噬细胞
- 在无菌PBS重悬巨噬细胞在10 7细胞/毫升的浓度。这允许在travenous注射巨噬细胞中的总体积100μL，这是一个可以安全，舒适的尾静脉注入小鼠的体积10 6。
- 使用加热垫或热圈的温暖小鼠尾静脉扩张为5-10分钟。监视鼠标热疗的迹象倍。
- 鼠标转让限制设备允许访问的尾静脉。
- 尾部旋转90°，使静脉朝上。脉下来的尾巴两侧横向运行，并可以用来要么静脉。
- 用酒精棉签清洁注射部位，并慢慢注入100μL，巨噬细胞（10 6），使用了26或28号针头的1 ml注射器。插入锥朝上，并在一个很小的角度，几乎平行的静脉针。
- 如果正确插入针应感到无阻力和静脉注射后应成为明确。如果针是不是在静脉，尾巴会凸出。如果发生这种情况，取出针，再试最后一次尝试，或在其他静脉近端。每次注射必须使用一种新的针尾是艰难的，针尾静脉注射过程中迅速变得索然无味。
- 注射后，取出针，适用于温和的压力，直到出血停止注射部位，并监视鼠标额外的5分钟，以确保出血已停止。
- 每4天重复巨噬细胞注射到确保偏光巨噬细胞在实验过程中的连续输送。
- 在实验结束后，随着实验分析，从网站的利益组织，并修复与多聚甲醛或甲醛确认极化的巨噬细胞的免疫组织化学染色的有效交付。
4。代表结果
居民macrop的数量和表型在任何特定的组织hages取决于被检查的组织，将改变在感染或炎症。同样，含有氯膦酸二钠脂质体的能力，从组织的巨噬细胞消耗，将取决于管理和有效的传递到靶组织路线。腹腔注射含有氯膦酸二钠脂质体在DSS诱导的结肠炎明显的巨噬细胞的标记，F4/80的（ 图1A）免疫组化染色过程中的小鼠结肠巨噬细胞在F4/80的减少+结果。也可以被用来组织化学染色，以确定在组织切片中的巨噬细胞数量和表型的数量差异。 图1B显示，没有发现在小鼠结肠枯竭相比，平均55％的巨噬细胞含有氯膦酸二钠脂质体耗尽时，老鼠被注射PBS仅作为喷射控制。每个值由计数F4/80的和ArgI染色编辑序列组织切片的阳性细胞从6小鼠在3分，3节每鼠标，计数被两个人失明的实验条件下进行。这些结果表明，腹腔注射氯膦酸二钠脂质体消耗在小鼠结肠巨噬细胞。
巨噬细胞从骨髓中存在不同的生长因子的产量是经典激活（MCSF-派生或，MCSF衍生与γ干扰素治疗），或者激活巨噬细胞（GM-CSF或IL-3-派生或MCSF派生和推导与IL-4处理）。法拉盛2从8周龄小鼠股骨和2胫骨骨髓产生鼠标6×10 7个有核细胞和产量8×10 6 MCSF源性巨噬细胞，10×10 6 GM-CSF源性巨噬细胞，或12× 10 6，IL-3-源性巨噬细胞。图2A显示IL-12p70/IL-10比在巨噬细胞和亚硝酸盐支持治疗与ernatants 图2B显示了一个典型的免疫印迹分析0.5×10 6的 MCSF巨噬细胞的+ / - 24小时内毒素，IL-4衍生条件与抗体或者激活的巨噬细胞标记，ArgI，YM1探测，或作为一个GAPDH的装载控制。这些数据表明，骨髓来源的巨噬细胞可以扭曲一个推导过程中的极化型。
体外的极化巨噬细胞的有效转移到组织是依赖于管理和组织路线。在DSS诱导的结肠炎，巨噬细胞注入静脉前往炎症部位 和另外激活的巨噬细胞减少疾病的严重程度。 图3A显示巨噬细胞总数和组织切片计数小鼠ArgI +（或者激活）的巨噬细胞的数量与极化注入骨髓衍生的巨噬细胞。极化的巨噬细胞的影响转移到了在DSS诱导的结肠炎结肠疾病活动指数，体重减轻，直肠出血，减少粪便的一致性（ 图3B）根据添加剂得分。这些结果表明， 离体派生，继转移的巨噬细胞可以交通结肠和影响引起的炎症。不影响货币供应量M1巨噬细胞炎症，而M2巨噬细胞显着减少疾病活动指数。
图1。氯磷酸二钠，含有脂质体有效地消耗F4/80的+和F480的+ ArgI +细胞在小鼠体内冒号。给出一个混合的C57BL / 6×129Sv背景的野生型小鼠F2代7天，腹腔注射5％DSS的PBS（管制）或氯膦酸二钠含脂质体（氯磷酸二钠）4天前DSS处理0天，2，4和6 DSS处理过程中。冒号（一）被拆除，固定，切片，免疫组化染色为成熟的巨噬细胞（F4/80的）和M2巨噬细胞标记，ArgI。 （二）定量F4/80 + ArgI +巨噬细胞的。阳性染色细胞计数由蒙蔽倍率在40×6 /鼠标3个部分，从6小鼠/组领域的实验条件下的两个人。 * P <0.01;
图2。以 MCSF衍生的巨噬细胞表达经典激活型和IL-4治疗MCSF源性巨噬细胞表达或者激活的巨噬细胞表型。 （一）与经典激活的表型一致，MCSF源性巨噬细胞产生脂多糖，一氧化氮水平较高，并可以测量的的格里斯检测，检测其下游代谢产物，亚硝酸盐。他们ALSO产生更高的比例IL-12p70/IL-10，可以用ELISA法测定。 * N = 3，P <0.01。 （二）或者激活的表型一致，MCSF-源性巨噬细胞，IL-4组成明示YM1和ArgI治疗，可以由西方免疫印迹检测。数据代表3独立的实验结果类似。
图3。静脉注射， 体外派生或者激活巨噬细胞结肠交通，减少肠道炎症。混合C57BL / 6×129Sv背景的野生型小鼠F2代六天分别给予5％的饮用水决策支持系统。 M1和M2巨噬细胞静脉注射DSS处理0和4天期间。冒号（一）被拆除，固定的，成熟的巨噬细胞（F4/80的）和M2巨噬细胞标记（ArgI）免疫组化染色切片。定量控制PBS注射小鼠（三）巨噬细胞，与货币供应量M1巨噬细胞（M1）余额（M2），M2巨噬细胞注入小鼠注射的小鼠进行计数阳性染色细胞在6个领域40×放大倍率从3节/鼠标从6只/组。计数是由两个人失明的实验条件。 （二）疾病活动的监测和治疗期间每天打进体重减轻，直肠出血，大便一致性下降，是一种添加剂得分。 *，P <0.05为n = 6 2个独立的实验小鼠。
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Discussion
巨噬细胞的吞噬细胞在免疫系统中发挥重要作用。他们是负责发起的先天免疫反应和指挥后天免疫反应。通常情况下，经典激活巨噬细胞被激活IFNγ的或LPS，并有责任为消除病原体和安装的炎症反应1。相反，IL-4和IL-13激活或者激活巨噬细胞和炎症的决议过程中发挥在碎片中的作用，清除和组织重塑。专门的巨噬细胞在肠道保留其杀菌活性，但不装入一个亲炎症反应2。这种有益菌群和食物抗原的耐受性，使材料的间隙，没有发起不适当的和潜在的病理免疫反应的上皮屏障破坏。异常结肠巨噬细胞功能，可以促进病理条件下，包括炎症性肠病，肠易激综合症，大肠癌3-5。巨噬细胞的表型是依赖于当地的微环境，以便确定其健康或疾病中的作用可以是具有挑战性。这里描述的协议允许从体内环境的复杂巨 噬细胞耗竭。此外，研究原位巨噬细胞表型的作用，极化巨噬细胞表型定义可以来自骨髓抽吸体外过继转移或没有事先枯竭的巨噬细胞，小鼠。
含有氯膦酸二钠脂质体促进巨噬细胞“自杀”，并已用于消耗巨噬细胞在各种组织6。巨噬细胞吞噬含氯膦酸二钠脂质体，随后被释放到细胞和诱导凋亡12氯膦酸二钠的溶酶体磷脂降解12个月稳定在4°C。脂质体必须均匀分布在解决方案之前加载到注射器注射到老鼠前，无论行政或靶组织路线。 PBS注射和注射PBS含脂质体需要控制消耗体内含有氯膦酸二钠脂质体7时，巨噬细胞。 PBS含脂质体似乎是一个更好的控制仅比PBS注射。然而，重要的是要注意到，虽然一些报告已经成功地使用PBS含脂质体作为对照，我们和其他人，有报道称，PBS含脂质体可以消耗巨噬细胞在一些实验条件下，8，9。此外，单独脂质体已暂时10抑制吞噬。 PBS含脂质的巨噬细胞耗竭可能是依赖于phagocytic能力可能会有所不同小鼠品系，遗传背景，组织，和/或实验条件。使用PBS含有脂质体作为控制和巨噬细胞耗尽他们的作用，在一个特定的应用需要通过实验确定。因此，我们建议，PBS及PBS含脂质体在最初的实验中使用的注射控制。
在巨噬细胞耗竭实验设计的一个重要的考虑因素是含有氯膦酸二钠脂质体管理的路线。我们已经成功地针对结肠巨噬细胞在小鼠腹腔注射8。他人已经使用直肠内给药或静脉注射9，11。直肠内和腹腔的管理都据报道，结肠巨噬细胞消耗约50％，而静脉注射已消耗从90％的巨噬细胞层固有8，9，11。我们选择进行腹腔注射，提供含有氯膦酸二钠脂质体，由于技术简单，因为类似我们的研究已经成功地使用这种路线管理7。然而，如果实验需要消耗较高的水平在结肠，静脉注射可改善枯竭。
给药途径，是一个重要的考虑因素，在不同组织中的巨噬细胞耗竭。腹腔注射已使用消耗腹膜，大网膜，parathymic淋巴结，肝，脾巨噬细胞和12。已被用于静脉注射消耗巨噬细胞在肝脏，脾脏，骨髓12。脑室注射含有的氯膦酸二钠脂质体已消耗血管周围及脑膜的巨噬细胞，小脑，大脑和脊髓12。气管并含有氯膦酸二钠脂质体鼻腔给药已消耗肺泡巨噬细胞。最后，地方当局已成功地用于消耗睾丸和玻璃体的巨噬细胞12，13。必须确定目标组织中的巨噬细胞枯竭的疗效和实验验证染色，免疫组化法（ 图1A）或组织流式细胞仪。在某些情况下可能有必要增加巨噬细胞的损耗率。可以优化，以增加消耗的变量包括改变含有氯膦酸二钠脂质体管理的路线，含有氯膦酸二钠脂质体每次注射和/或注射的频率。
含有氯膦酸二钠脂质体的巨噬细胞时消耗的数据解释一个重要的考虑因素是，所有专业的吞噬细胞被耗尽，包括树突状细胞。为了确保生物效应是巨噬细胞依赖，优势互补的重组实验需要。来自骨髓穿刺的巨噬细胞是有用的工具，以及为重建实验调查巨噬细胞功能的研究。我们已成功地用于在体外研究探索在14巨噬细胞替代激活PI3K信号通路的作用，这一协议。在推导过程中有两个关键步骤。第一，坚持枯竭的一步是至关重要的，以去除贴壁细胞从骨髓穿刺，无论是污染的间质细胞或成熟的造血细胞。第二，巨噬细胞表型应被确认之前，他们在实验过程中的使用。此协议的修改是不同的遗传模型，可用于巨噬细胞衍生和重组，巨噬细胞的表型和体外的功能，允许在特定基因的作用进行调查在体内 。对于重建实验，静脉注射是最常见的巨噬细胞传递的模式，但两种细胞的数量和注射频率可以优化一个特定的研究。眼窝注射可用于重建，并应提供类似的结果。值得注意的是，巨噬细胞被招募到炎症部位及其表型可以从他们的微信号改变。最后，继转移可能足够提供目标的组织，但之前耗尽的居民组织的巨噬细胞可能是必要的，以允许建立的巨噬细胞过继转移的巨噬细胞。
这里提出的协议具有与现有方法相比的优势。耗尽巨噬细胞的另一种方法是通过使用条件消融转基因小鼠，细胞CD11b-DTR 15。在这种鼠标，人类白喉毒素（DT）受体表达下控制输出f的巨噬细胞特异性CD11b的启动。这赋予毒素的敏感性和DT注射引起巨噬细胞耗尽15。虽然百分比巨噬细胞的损耗是在这个模型中，含有氯膦酸二钠脂质体提供了两个重要的优势。可以使用含有氯膦酸二钠脂质体注射消耗任何小鼠品系中的巨噬细胞。没有回交所需的时间和成本，需要使用鼠标的CD11b-DTR方法从转基因小鼠巨噬细胞可被耗尽。出于同样的原因，巨噬细胞可以从任何背景的小鼠枯竭，这是一个重要的考虑因素，如果被调查的模式需要一个独特的或混合的背景。同样，使用鼠标线前体内巨噬细胞衍生的过继转移实验避免与alloreactivity的任何问题。
这里描述的协议，可应用于各种研究问题。我们已经使用了日ESE技术研究结肠巨噬细胞在炎症的作用。可以使用含有氯膦酸二钠脂质体介导的巨噬细胞的消耗和巨噬细胞过继转移，针对大量的组织。巨噬细胞过继转移可用于重建枯竭的巨噬细胞或巨噬细胞炎症部位炎症的基因或诱导模型直接。该协议还为巨噬细胞或它们的极化与病理相关疾病模型的研究巨噬细胞的靶向治疗提供了一个平台。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了1“的研究资助津贴”的克隆氏病的和结肠炎加拿大基金会的LMS，谁是1消化科/加拿大协会健康研究/克罗恩的小号和结肠炎加拿大新研究者奖基金会加拿大协会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
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References
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