Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Udtømning og Rekonstituering af makrofager i mus

Published: August 1, 2012 doi: 10.3791/4105

Summary

Makrofager spiller en central rolle i homeostase og patologi i mange væv. Protokollen præsenteres her beskriver metoder til nedbrydende makrofager

Abstract

Makrofager er kritiske aktører i den medfødte immunrespons til infektiøs udfordring eller skade, indlede det medfødte immunforsvar og lede den erhvervede immunreaktion. Makrofag dysfunktion kan føre til en manglende evne til at montere en passende immunrespons, og som sådan er blevet impliceret i mange sygdomsforløb, herunder inflammatoriske tarmsygdomme. Makrofager vise polariserede fænotyper, der er groft inddeles i to kategorier. Klassisk aktiverede makrofager, aktiverede ved stimulering med IFNy eller LPS, spiller en vigtig rolle som reaktion på bakteriel provokation henviser alternativt aktiverede makrofager, aktiveret med IL-4 eller IL-13 deltager i debris skylning og vævsremodellering og har været impliceret i opløsning fase inflammation. Under en inflammatorisk reaktion in vivo, er makrofager ligger midt en kompleks blanding af infiltrerende immunceller og kan deltage i forværre eller resolving inflammation. For at definere den rolle, makrofager in situ i et helt dyr model, er det nødvendigt at undersøge effekten af ozonlagsnedbrydende makrofager fra komplekst miljø. At stille spørgsmål om den rolle, makrofag fænotype in situ, kan fænotypisk definerede polariserede makrofager udledes ex vivo, fra knoglemarvsaspirater og sat tilbage til mus, med eller uden forudgående udtynding af makrofager. I protokollen præsenteret her clodronat-holdige liposomer, versus PBS injicerede kontroller blev anvendt til at udtømme colon makrofager under dextrannatriumsulfat (DSS)-induceret colitis hos mus. Desuden blev polariserede makrofager afledt ex vivo og overført til mus ved intravenøs injektion. En advarsel til denne fremgangsmåde er, at clodronat-holdige liposomer udtømme alle professionelle fagocytter, herunder både dendritiske celler og makrofager, så for at sikre den effekt observeret ved nedbrydningen er makrofag-specifik, rekonstitution of fænotype ved adoptiv overførsel af makrofager er nødvendig. Systemisk makrofag udtømning hos mus kan også opnås ved tilbagekrydsning mus på en CD11b-DTR baggrund, som er en fremragende komplementær tilgang. Den fordel, clodronat-holdig liposomdispersions-medieret nedbrydning er, at det ikke kræver tid og de omkostninger der er involveret i tilbagekrydsning mus, og det kan anvendes i mus, uanset om baggrunden for mus (C57BL / 6, BALB / c eller blandet baggrund ).

Protocol

1. Ozonlagsnedbrydende Makrofager Brug Clodronat-holdige liposomer

  1. Liposomer opbevares ved 4 ° C. To timer forud for injektion, fjernes clodronat-holdige liposomer, PBS-holdige liposomer, eller sterilt PBS (injektion kontrol) fra køleskabet for at tillade dem at akklimatisere sig til stuetemperatur (18 ° C).
  2. Vend rørene indeholdende liposomer 8-10 gange for at sikre en jævn fordeling før lastning 200 pi i en 1 ml sprøjte. Vedhæfte en 26 gauge nål til toppen af ​​sprøjten.
  3. Brug din venstre hånd, Scruff musen lige under ørerne holder nok hud til at immobilisere sit hoved og lemmer.
  4. Vip musen, så hovedet er lidt mod jorden, så de indre organer bevæge sig væk fra injektionsstedet, som er placeret i nederste højre kvadrant af maven.
  5. Rul sprøjten mellem håndfladerne og vend det 6 gange for at fordele liposomopløsningen jævnt før injektion.
  6. <li> Stik nålen i nederste højre side af musen maven i en 30-40 graders vinkel. Injicer 200 ul liposom opløsning eller PBS.
  7. Under en induceret inflammation model, ligesom DSS-induceret colitis injicere mus 4 dage før starten af ​​eksperimentel inflammation for at sikre nedbrydning af residente makrofager og hver 2 dage i løbet af protokollen til at udtømme nye infiltrerende makrofager.
  8. Ved slutningen af ​​eksperimentet, sammen med planlagte eksperimentelle undersøgelser fjerne væv fra stedet af interesse og fastgøres med paraformaldehyd for at bekræfte makrofag depletering ved immunhistokemisk farvning.

2. Udledningen af ​​polariseret Makrofager fra knoglemarvsaspirater

  1. Knoglemarv fra mus mellem 8 og 12 ugers alderen giver den højeste udbytte af knoglemarv-afledte makrofager. Afliv musen, lægge den på ryggen, og pin ned dens poter, der strækker sine lemmer i videst muligt omfang.
  2. Arbejde i en steril hood, fjern lårben og skinneben, skære væk så meget muskel som muligt.
  3. Flush marv fra knoglerne ved hjælp af IMDM med 10% FCS fyldes i en 5 ml sprøjte forsynet med en 26 gauge nål.
  4. Fortynd knoglemarvsaspirater til 40 ml i IMDM med 10% FCS, anbringes celler i en 75 cm2 vævsdyrkningskolbe og inkuberet ved 37 ° C, 5% CO2 i 4 timer. Dette trin fjerner adhærente mesenchymale celler eller modne makrofager fra hæmatopoietiske progenitorer.
  5. Overførsel dyrkningssupernatant indeholdende ikke-adhærente progenitorer til et 50 ml konisk Falcon-rør og centrifugeres i 5 minutter ved 1200 rpm.
  6. Resuspender celler pellet i 5 ml IMDM, 10% FCS og tælle kerneholdige celler ved at fortynde cellesuspension 1 til 20 i eddikesyre. Denne fremgangsmåde lyserer alle celler, herunder røde blodlegemer og den resterende kerner kan tælles på et hæmocytometer.
  7. Resuspender cellerne i en koncentration på 0,5 x 10 6 celler / ml i komplet medium; IMDM, 10% FCS, 150 uM monothioglycerol (MTG), og 10 ng / ml af enten MCSF, GM-CSF eller IL-3. MCSF-afledte makrofager er klassisk aktiverede makrofager henviser GM-CSF-eller IL-3-afledte makrofager alternativt aktiveres.
  8. Udskifte mediet på dag 4, spinding ned non-adhærente celler og returnere dem til kolben, og på dag 7, ikke-adhærente kassere celler.
  9. Desuden kan IFNy (10 ng / ml) eller IL-4 (10 ng / ml) sættes til kolber indeholdende MCSF-afledte celler på dag 7 til skråt makrofager til en klassisk aktiveres eller en alternativt aktiveret fænotype, hhv. Cellerne inkuberes i yderligere 3 dage.
  10. På dag 10, fjernes mediet og løfte celler ud af vævsdyrkningskolben celledissociering buffer (Gibco-BRL). 5 ml puffer på celler i 5 minutter ved stuetemperatur (18 ° C) og derefter slår siden af ​​kolben med hælen af ​​hånden fast adskillige gange. Sikre, at cellerne er løftet ud af kolben ved at undersøge kolbe under enmikroskop. Pipette resuspenderet celler i en 15 ml konisk Falcon-rør og Kolben skylles med yderligere 10 ml IMDM, 10% FBS. Pool og spin ned cellerne i 5 minutter ved 300 x g.
  11. Tælle levedygtige celler under anvendelse af et hæmocytometer og resuspender i en koncentration på 10 7 celler / ml i sterilt PBS pH 7,4. Makrofager er klar til injektion i mus.
  12. Reserve 1,0 × 10 6 makrofager til vurdering af makrofag fænotype. Klassisk aktiverede makrofager stimuleret med lipopolysaccharid udskiller høje niveauer af nitrogenoxid og IL-12p70 og lave niveauer af IL-10 i forhold til alternativt aktiverede makrofager. Alternativt aktiverede makrofager konstitutivt udtrykker YM1 og arginase I (Argi), som kan detekteres ved Western immunoblotting.

3. Tranferring makrofager i mus

  1. Resuspender makrofager i sterilt PBS til en koncentration på 10 7 celler / ml. Dette muliggør entravenous injektion af 10 6 makrofager i et totalvolumen på 100 ul, hvilket er en mængde, der kan anvendes sikkert og bekvemt injiceret i mus ved halevenen.
  2. Varme mus med en varmepude eller varme lap i 5-10 minutter for at dilatere halevenen. Overvåge mus på alle tidspunkter for tegn på hypertermi.
  3. Overføre mus til en fastholdende indretning, som tillader adgang til halevenerne.
  4. Rotere halen 90 °, således at venen vender opad. Vener løber lateralt ned på begge sider af halen og begge vene kan anvendes.
  5. Rens injektionsstedet med en desinficerende serviet og langsomt injicere 100 ul (10 6 makrofager) med en 1 ml sprøjte med en 26 eller 28 gauge nål. Kanylen med den skrå kant opad og i en lille vinkel, næsten parallelt venen.
  6. Hvis nålen er sat rigtigt ingen modstand skal mærkes, og venen skulle blive klar efter injektion. Hvis nålen ikke er ivene, halen vil bule. Hvis dette sker, fjernes kanylen, og prøv igen proksimalt til det sidste forsøg eller i anden vene. En ny nål skal anvendes til hver injektion som halen er hård og nålene bliver sløve hurtigt under haleveneinjektion.
  7. Efter injektion, nålen fjernes, anvendes let tryk på injektionsstedet indtil blødningen stopper, og overvåge mus i yderligere 5 minutter for at sikre, blødning er standset.
  8. Gentag makrofagceller injektioner hver 4 dage for at sikre en kontinuerlig levering af polariserede makrofager under forsøget.
  9. Ved slutningen af ​​eksperimentet, sammen med eksperimentelle undersøgelser fjerne væv fra stedet af interesse og fastgøres med paraformaldehyd eller formalin for at bekræfte effektiv levering af polariserede makrofager ved immunhistokemisk farvning.

4. Repræsentative resultater

Antallet og fænotypen af ​​residente macrophages i ethvert givet væv afhænger vævet, der undersøges, og vil ændre sig under infektion eller inflammation. Tilsvarende vil evnen af ​​clodronat-holdige liposomer for at udtømme makrofager fra et væv afhænge af administrationsvejen og effektiv levering til målvævet. Intraperitoneal injektion af clodronat-holdige liposomer resulterer i et fald i F4/80 + makrofager i muse colon under DSS-induceret colitis tydeligt ved immunohistokemisk farvning for makrofagen markør, F4/80 (figur 1A). Histologisk farvning kan også anvendes til at bestemme kvantitative forskelle i makrofag antal og fænotype i vævssnit. Figur 1B viser, at et gennemsnit på 55% af makrofager er forårsaget af clodronat-holdige liposomer sammenlignet med ingen nedbrydning påvist i muse-kolon, når mus injiceres med PBS alene som en injektion kontrol. Hver værdi bestemmes ved at tælle F4/80 og Argi pletteed positive celler i serielle vævssnit fra 6 mus på 3 point i 3 sektioner per mus med at tælle, der udføres af to personer blindet for eksperimentel tilstand. Disse resultater viser, at intraperitoneale injektioner af clodronatpræparater liposomer nedbryder colon makrofager i musene.

Afledning af makrofager fra knoglemarv i nærvær af forskellige vækstfaktorer udbytter makrofager, der klassisk aktiveret (MCSF afledt eller MCSF-afledt og behandlet med IFNy) eller alternativt aktiveres (GM-CSF eller IL-3-afledte eller MCSF-afledt og behandlet med IL-4). Skylning knoglemarv fra 2 lårben og skinneben 2 fra en 8 uger gamle mus typisk giver 6 x 10 7 kerneholdige celler per mus og udbytter 8 × 10 6 MCSF-afledte makrofager, 10 × 10 6 GM-CSF-afledte makrofager eller 12 x 10 6 IL-3-afledte makrofager. Figur 2A viser nitrit og IL-12p70/IL-10 forholdet i makrofag supernatants behandlet med lipopolysaccharid i 24 timer Figur 2B viser en typisk Western blot-analyse af 0,5 x 10 6 makrofager fra MCSF + / -. IL-4 afledning betingelser probet med antistoffer for alternativt aktiverede makrofager markører, Argi og YM1, eller med GAPDH som lastning kontrol. Disse data viser, at knoglemarv-afledte makrofager kan være skråtstillet til en polariseret fænotype under udledningen.

Effektiv overførsel af ex vivo-producerede polariserede makrofager til et væv er afhængig af administrationsvejen og adgang til vævet. Under DSS-induceret colitis, injiceret makrofager intravenøst ​​rejse til inflammationsstedet og alternativt aktiverede makrofager reducere sygdommens sværhedsgrad. Figur 3A viser det totale antal makrofager og antallet af Argi + (alternativt aktiveres) makrofager optalt i histologiske snit fra mus injiceret med polariseret knoglemarv-Afledte makrofager. Virkningen af overførsel af polariserede makrofager til tyktarmen i DSS-induceret colitis er vist ved sygdomsaktivitet indeks, et additiv score baseret på vægttab, rektal blødning og nedsat afføringskonsistens (figur 3B). Disse resultater viser, at ex vivo afledt adoptivt overførte makrofager kan trafikken til tyktarmen og virkning induceret inflammation. M1 makrofager ikke påvirke inflammation mens M2 makrofager reducere sygdomsaktivitet indeks.

Figur 1
Figur 1. Clodronat-indeholdende liposomer effektivt nedbryder F4/80 + og F480 + Argi +-celler i mus koloner in vivo. En F2 generering af vildtypemus på en blandet C57BL / 6 x 129Sv baggrund fik 5% DSS i 7 dage og injiceret IP med PBS (kontrol) eller clodronat-holdige liposomer (Clodronat) 4 dage før DSS behandlingog på dagene 0, 2, 4 og 6 under DSS behandling. (A) koloner blev fjernet, fikseret, og snit blev farvet ved immunohistokemi for modne makrofager (F4/80) og M2 makrofag markør, Argi. (B) Kvantificering af F4/80 + og Argi + makrofager. Positivt farvede celler blev talt ved to individer blindet for eksperimentel betingelse ved 40 x forstørrelse i 6 felter fra 3 sektioner / mus og fra 6 mus / gruppe. * P <0,01.

Figur 2
Figur 2. MCSF-afledte makrofager udtrykker en klassisk aktiveret fænotype og MCSF-afledte makrofager blev behandlet med IL-4 udtrykke en alternativt aktiveres makrofag fænotype. (A) I overensstemmelse med en klassisk aktiveret fænotype, MCSF-afledte makrofager producerer højere niveauer af nitrogenoxid i respons på lipopolysaccharid og kan måles ved Griess assay, der detekterer dets nedstrøms metabolit, nitrit. De also producere en højere IL-12p70/IL-10 forhold, som kan måles ved ELISA. * P <0,01 for n = 3. (B) I overensstemmelse med en alternativ aktiveret fænotype, MCSF-afledte makrofager blev behandlet med IL-4 konstitutivt udtrykker YM1 og Argi, som kan detekteres ved Western immunoblotting. Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter med lignende resultater.

Figur 3
Figur 3. Intravenøs injektion af ex vivo-afledt alternativt aktiverede makrofager trafik til tyktarmen og reducere intestinal inflammation. En F2 generering af vildtypemus på en blandet C57BL / 6 x 129Sv baggrund fik 5% DSS i deres drikkevand i seks dage. M1 og M2 makrofager blev injiceret IV på dag 0 og 4 under DSS behandling. (A) koloner blev fjernet, fikseret, og snit blev farvet ved immunohistokemi for modne makrofager (F4/80) og en M2 makrofag markør (Argi).Kvantificering af makrofager til kontrol PBS-injicerede mus (C), blev mus injiceret med M1 makrofager (+ M1) og mus injiceret med M2 makrofager (+ M2) udføres ved at tælle positivt farvede celler ved 40 x forstørrelse i 6 felter fra 3 sektioner / mus og fra 6 mus / gruppe. Optælling blev udført af to personer, blindet for eksperimentel tilstand. (B) Disease aktivitet blev overvåget og scoret dagligt under behandlingen, og er en additiv score baseret på vægttab, rektal blødning og nedsat afføringskonsistens. * P <0,05 for n = 6 mus i 2 uafhængige eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Makrofager er fagocytiske celler, som spiller en vigtig rolle i immunsystemet. De er ansvarlige for at indlede den medfødte immunreaktion og lede den erhvervede immunreaktion. Typisk er klassisk aktiverede makrofager aktiveret ved IFNy eller LPS og er ansvarlige for fjernelse patogener og montering et inflammatorisk respons 1. Omvendt er alternativt aktiverede makrofager aktiveret med IL-4 eller IL-13 og spiller en rolle i debris skylning og vævsremodellering under opløsning af inflammation 1. Specialiserede makrofager i tarmen bevarer deres baktericide virkning, men ikke montere en pro-inflammatorisk respons 2. Denne tolerance gavnlige flora og mad antigen giver mulighed for rydning af materiale, der bryder epitelbarriere uden at indlede en uhensigtsmæssig og potentielt patologiske immunrespons 3. Aberrerende colon makrofagfunktion kan bidragetil patologiske tilstande, herunder inflammatoriske tarmsygdomme, irritabel tyktarm, og kolorektal cancer 3-5. Makrofag fænotype er afhængig af lokale mikromiljø så definere deres rolle i sundhed eller sygdom kan være udfordrende. Protokollen beskrevet her tillader makrofag depletering af komplekset in vivo-miljø. Desuden at undersøge rollen af makrofag fænotype in situ, kan fænotypisk definerede polariserede makrofager afledes ex vivo fra knoglemarvsaspirater og adoptivt overført til mus med eller uden forudgående udtømning af makrofager.

Clodronat-holdige liposomer fremme makrofag "selvmord" og er blevet anvendt til at udtømme makrofager i en række væv 6. Makrofager fagocytere clodronat-holdige liposomer, som derefter nedbrydes af lysosomale phospholipaser frigiver clodronat i cellen og inducerer apoptose 12 12. Liposomer skal være jævnt fordelt i opløsning før de lægges i sprøjten, og før injektion i mus, uanset indgivelsesvejen eller målvæv. PBS injektioner og injektion af PBS-holdige liposomer kræves styrer hvornår udtømmer makrofager in vivo med clodronat-holdige liposomer 7. PBS-holdige liposomer synes at være en bedre kontrol end PBS injektioner alene. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at medens nogle rapporter held har anvendt PBS-holdige liposomer som kontrol; Vi og andre har rapporteret, at PBS-holdige liposomer kan udtømme makrofager i nogle eksperimentelle betingelser 8, 9. Desuden er liposomer alene blevet rapporteret at inhibere phagocytose midlertidigt 10. Makrofag depletering af PBS-holdige liposomer kan være afhængige af phagocytic evne og kan variere ifølge musestamme, genetisk baggrund, væv og / eller forsøgsbetingelse. Anvendelse af PBS-indeholdende liposomer som en kontrol, og deres virkning på makrofag depletion i en specifik applikation skal bestemmes eksperimentelt. Vi anbefaler derfor, at både PBS og PBS-holdige liposomer bruges som injektion kontroller under den indledende eksperimenter.

En kritisk faktor i udformningen makrofag depletion eksperimenter er ruten for indgivelse af clodronat-holdige liposomer. Har vi med succes målrettes colon makrofager i mus under anvendelse af intraperitoneal injektion 8. Andre har brugt intrarektal administration eller intravenøs injektioner 9, 11. Intrarektal og intraperitoneal indgivelse er begge blevet rapporteret at udtømme cirka 50% af colon makrofager hvorimod intravenøs injektion er blevet rapporteret at udtømme op til 90% af makrofager fra laminapropria 8, 9, 11. Vi valgte at udføre intraperitoneale injektioner for at levere clodronat-holdige liposomer på grund af enkelheden af teknikken, og fordi undersøgelser ligner vores succes har anvendt denne indgivelsesvej 7. Hvis højere depletering i tyktarmen er nødvendige for et eksperiment, kan intravenøs injektion forbedre udtømningen.

Administrationsvej er en vigtig overvejelse for makrofag udtynding i forskellige væv. Intraperitoneale injektioner er blevet anvendt til at udtømme peritoneal, omentum, parathymic lymfeknude, lever og milt makrofager 12. Intravenøse injektioner er blevet anvendt til at udtømme makrofager i leveren, milt og knoglemarv 12. Intraventrikulær administration af clodronatpræparater-holdige liposomer er blevet anvendt til at udtømme perivaskulære og meningeale makrofager fra cerebellum, cerebrum og rygmarv 12. Intratrakealog intranasal administration af clodronat-holdige liposomer blevet anvendt til at udtømme alveolære makrofager. Endelig er lokal administration med held blevet anvendt til at udtømme testikel-og glaslegemet makrofager 12, 13. Effekten af makrofag depletion i et målvæv skal bestemmes eksperimentelt og valideres ved farvning væv ved immunohistokemi (fig. 1A) eller ved flow-cytometri. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at forøge makrofag udtømning hastighed. De variabler, der kan optimeres til at forøge nedbrydningen indbefatter rute ændres clodronat-holdig liposomdispersions administration er mængden af ​​clodronat-holdige liposomer per injektion, og / eller hyppigheden af ​​injektion.

En vigtig overvejelse i fortolkningen af ​​data, når der nedbryder makrofager med clodronat-holdige liposomer er, at alle professionelle fagocytter er opbrugt, herunder dendritiske celler. At sikre, at enbiologisk effekt makrofag-afhængig, er komplementære rekonstituering eksperimenter påkrævet. Følger makrofager fra knoglemarvsaspirater er et nyttigt redskab til rekonstitution eksperimenter samt forskning undersøge makrofag-funktion. Vi har med succes brugt denne protokol til in vitro-undersøgelser udforsker rolle PI3K signalvejen i den alternative aktivering af makrofager 14. Der er to vigtige trin i udledningsproces. Første tilslutning depletering trin er afgørende for at fjerne adhærerende celler fra knoglemarvsaspirater, enten kontaminerende mesenchymale celler eller modne hæmatopoietiske celler. For det andet bør makrofag fænotype bekræftes forud for deres anvendelse i eksperimentelle procedurer. En modifikation af denne protokol er at forskellige genetiske modeller kan anvendes til makrofag afledning og rekonstituering, hvilket tillader undersøgelse af rollen af specifikke gener i makrofag fænotype og funktion in vitro end in vivo. Til rekonstitution eksperimenter er intravenøs injektion er den mest almindelige form for makrofag levering, men både celle mængde og injektion frekvens kan optimeres til en særlig undersøgelse. Retro-orbital injektioner kan anvendes til rekonstitution og bør give lignende resultater. Det skal bemærkes, der makrofager rekrutteres til steder med inflammation og deres fænotype kan ændres som reaktion på signaler fra deres mikromiljø. Endelig kan adoptiv overførsel være tilstrækkelig til at afgive makrofager til et målvæv, men før udtømningen af ​​residente vævsmakrofager kan være nødvendig for at tillade etablering af adoptivt overførte makrofager.

Protokollen præsenteres her har et antal fordele i forhold til eksisterende metoder. En alternativ fremgangsmåde til at udtømme makrofager, er ved hjælp af betingede ablation transgene mus, CD11b-DTR 15. I denne mus er den humane difteritoksin (DT)-receptoren udtrykkes under kontrol of makrofag-specifik CD11b promotor. Dette giver toksin følsomhed og DT injektion forårsager makrofag udtømning 15. Selvom andelen makrofag udtømning er større i denne model, clodronat-holdige liposomer giver to vigtige fordele. Clodronat-holdig liposomdispersions injektion kan anvendes til at udtømme makrofager i alle musestamme. Makrofager kan være udtømt fra genetisk modificerede mus uden tid og omkostninger, der kræves for tilbagekrydsning, der kræves for at bruge CD11b-DTR mus-metoden. Af samme grund kan makrofager være udtømt fra mus på en baggrund, som er en vigtig overvejelse, hvis det model, som undersøges kræver en unik eller blandet baggrund. Tilsvarende adoptiv overførsel forsøg under anvendelse af ex vivo afledte makrofager fra mus linie undgår problemer med alloreactivity.

Protokollerne der er beskrevet her, kan anvendes til en række forskningsspørgsmål. Vi har anvendt thEse teknikker til at undersøge rollen af ​​makrofager i inflammation i tyktarmen. Clodronat-holdige liposom-medieret makrofag depletion og adoptiv overførsel af makrofager kan anvendes til at målrette et stort antal væv. Makrofag adoptiv overførsel kan anvendes til at rekonstruere udtømte makrofager eller direkte makrofager til steder med inflammation i genetisk eller inducerbar modeller af inflammation. Denne protokol udgør også en platform for at undersøge makrofagceller målrettede lægemidler i sygdoms-modeller, hvor makrofager eller deres polarisering er forbundet med patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev understøttet af en "Grant i støtte for forskning" fra Crohns og Colitis Foundation of Canada til LMS, der understøttes af en canadisk Association of Gastroenterology / Canadian Association of Health Research / Crohns og Colitis Foundation of Canada New Investigator Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clodronate-containing liposomes Clodronateliposomes.org
PBS-containing liposomes Clodronateliposomes.org
Sterile PBS pH7.4 Invitrogen 14190
IMDM Invitrogen 12440
Fetal Calf Serum (FCS) Invitrogen 12483
acetic acid BDH Aristar BDH3092-500MLP
Monothioglycerol (MTG) Sigma 96-275
Recombinant murine MCSF Stemcell Technologies 02951
Recombinant murine GM-CSF Stemcell Technologies 02935
Recombinant murine IL-3 Stemcell Technologies 02903
Recombinant murine IFNγ Stemcell Technologies 02746
Recombinant murine IL-4 Stemcell Technologies 02714
Cell Dissociation Buffer Invitrogen 13150-016
Rat anti-F4/80 Antibody AbD Serotec MCA497GA
Mouse anti-ArgI Antibody BD Transduction Laboratories 610708

Table 1. Specific reagents used in this protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  2. Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
  3. Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
  4. Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
  5. Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
  6. van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
  7. Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
  8. Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
  9. Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
  10. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
  11. Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
  12. van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
  13. Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
  14. Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
  15. Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).

Tags

Immunologi Molecular Biology makrofager clodronat-holdige liposomer makrofag udtynding makrofag afledning makrofag rekonstituering
Udtømning og Rekonstituering af makrofager i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weisser, S. B., van Rooijen, N.,More

Weisser, S. B., van Rooijen, N., Sly, L. M. Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice. J. Vis. Exp. (66), e4105, doi:10.3791/4105 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter