Summary
मैक्रोफेज homeostasis में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं और कई ऊतकों में विकृति. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल घट मैक्रोफेज के लिए तरीकों का वर्णन
Protocol
1. घट Clodronate - युक्त Liposomes का उपयोग मैक्रोफेज
- Liposomes 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है इंजेक्शन के लिए दो घंटे पहले, रेफ्रिजरेटर से clodronate युक्त liposomes, पीबीएस युक्त liposomes, या बाँझ पीबीएस (इंजेक्शन नियंत्रण) को हटाने के लिए उन्हें कमरे के तापमान (18 डिग्री सेल्सियस) के लिए जलवायु के अनुकूल बनाना करने के लिए अनुमति देते हैं.
- Liposomes युक्त 8-10 बार एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में 200 μl लोड करने से पहले एक भी वितरण को सुनिश्चित करने के ट्यूबों पलटना. एक 26 गेज सुई सिरिंज के शीर्ष करने के लिए संलग्न.
- अपने बाएँ हाथ कूड़ा, बस पर्याप्त त्वचा धारण करने के लिए अपने सिर और अंगों को स्थिर कान के नीचे माउस के प्रयोग से.
- माउस झुकाव तो अपने सिर जमीन की ओर थोड़ा है तो आंतरिक अंगों इंजेक्शन साइट है, जो पेट के निचले सही वृत्त का चतुर्थ भाग में स्थित है से दूर चले जाते हैं.
- अपनी हथेलियों के बीच सिरिंज रोल और यह 6 बार पलटना liposome समान रूप से इंजेक्शन से पहले समाधान वितरित. <ली> एक 30-40 डिग्री के कोण पर माउस पेट के निचले सही पक्ष में सुई डालें. Liposome समाधान या पीबीएस के 200 μl इंजेक्षन.
- मॉडल के दौरान एक प्रेरित सूजन, के बारे प्रेरित बृहदांत्रशोथ जैसे, 4 दिनों चूहों प्रयोगात्मक सूजन की शुरुआत के लिए पहले इंजेक्षन करने के लिए नए घुसपैठ मैक्रोफेज व्यय करने के लिए प्रोटोकॉल के दौरान निवासी मैक्रोफेज और हर 2 दिन की कमी को सुनिश्चित करने.
- प्रयोग के अंत में, योजना बनाई प्रयोगात्मक विश्लेषण के साथ साथ, ब्याज की साइट से ऊतकों को हटाने और paraformaldehyde साथ तय करने के लिए immunohistochemical धुंधला द्वारा बृहतभक्षककोशिका कमी की पुष्टि की.
2. Polarized मैक्रोफेज की अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस से व्युत्पत्ति
- उम्र के 8 और 12 सप्ताह के बीच चूहों से अस्थि मज्जा अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज के उच्चतम उपज प्रदान करता है. Euthanize माउस, यह अपनी पीठ पर रखे, और नीचे अपने पंजे पिन अपने अंग के रूप में दूर संभव खींच.
- हू बाँझ में कार्य करनाघ, femurs और tibias निकालने के लिए, बहुत मांसपेशियों के रूप में दूर संभव के रूप में कटौती.
- 10% एफसीएस साथ IMDM का उपयोग हड्डियों से भरा मज्जा 5 मिलीलीटर सिरिंज एक 26 गेज सुई के साथ सुसज्जित में भरा हुआ है.
- पतला अस्थि मज्जा एफसीएस 10%, 75 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में जगह कोशिकाओं, और 37 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस, 5% 4 घंटे के लिए सीओ 2 के साथ IMDM में 40 मिलीलीटर रेस्पायरेट्रस. यह कदम पक्षपाती mesenchymal या hematopoietic progenitors से कोशिकाओं को परिपक्व मैक्रोफेज हटा.
- स्थानांतरण संस्कृति सतह पर तैरनेवाला एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार फाल्कन ट्यूब और अपकेंद्रित्र 1200 rpm पर 5 मिनट के लिए गैर पक्षपाती progenitors युक्त.
- 5 मिलीलीटर IMDM में resuspend सेल गोली, एफसीएस 10% और 20 में एसिटिक एसिड में सेल 1 निलंबन कमजोर द्वारा nucleated कोशिकाओं गिनती. इस प्रक्रिया में लाल रक्त कोशिकाओं और शेष नाभिक एक hemocytometer पर गिना जा सकता है सहित सभी कक्षों lyses.
- 0.5 की एकाग्रता × 10 6 कोशिकाओं / पूरी मध्यम में मिलीलीटर में resuspend कोशिकाओं, IMDM, 10% है FCS, 150 माइक्रोन (MTG) monothioglycerol के, और 10 एनजी / मिलीलीटर की या तो MCSF, जीएम-CSF, या आईएल-3. MCSF व्युत्पन्न मैक्रोफेज प्रतिष्ठित मैक्रोफेज सक्रिय कर रहे हैं जबकि जीएम-CSF या आईएल 3 व्युत्पन्न मैक्रोफेज वैकल्पिक रूप से सक्रिय कर रहे हैं.
- 4 दिन में मध्यम बदलें, नीचे गैर पक्षपाती कोशिकाओं कताई और उन्हें कुप्पी की ओर लौटने, और 7 दिन में, discarding के गैर पक्षपाती कोशिकाओं.
- इसके अलावा, (10 एनजी / एमएल) IFNγ या आईएल 4 (10 एनजी / एमएल) को तिरछा मैक्रोफेज करने के लिए 7 दिन पर MCSF व्युत्पन्न कोशिकाओं से युक्त बोतल के लिए जोड़ा जा सकता है एक प्रतिष्ठित सक्रिय या वैकल्पिक रूप से सक्रिय phenotype, क्रमशः. 3 दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- 10 दिन में, मीडिया को हटाने और कोशिकाओं ऊतक संस्कृति सेल हदबंदी बफर (Gibco BRL) का उपयोग कर कुप्पी की लिफ्ट बंद. जगह 5 बफर की कोशिकाओं पर और कमरे के तापमान (18 डिग्री सेल्सियस) से कम 5 मिनट के लिए मिलीग्राम तो अपनी हथेली की एड़ी मजबूती से कई बार साथ कुप्पी की ओर धमाका. सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं से कुप्पी के तहत एक कुप्पी की जांच के द्वारा उठाया हैखुर्दबीन. Pipet एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार फाल्कन ट्यूब में कोशिकाओं resuspended कुप्पी और IMDM, 10% FBS एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर के साथ धो लो. पूल और 5 मिनट के लिए 300 × छ कोशिकाओं नीचे स्पिन.
- व्यवहार्य बाँझ pH7.4 पीबीएस में 10 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर एक hemocytometer और resuspend का उपयोग कर कक्षों की गणना करें. मैक्रोफेज चूहों में इंजेक्शन के लिए तैयार हैं.
- रिजर्व × 1.0 6 बृहतभक्षककोशिका phenotype की मूल्यांकन के लिए 10 मैक्रोफेज. माइल्ड सक्रिय lipopolysaccharide नाइट्रिक ऑक्साइड की छिपाना उच्च स्तर और आईएल -10 आईएल - 12p70 और कम स्तर के साथ उत्तेजित मैक्रोफेज वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज की तुलना में. वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज अनिवार्यता से YM1 और arginase मैं (ARGI) के है, जो पश्चिमी immunoblotting द्वारा पता लगाया जा सकता है व्यक्त करते हैं.
3. चूहे में मैक्रोफेज Tranferring
- 10 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में बाँझ पीबीएस के में resuspend मैक्रोफेज. इस में एक के लिए अनुमति देता है100 μl, जो एक मात्रा है कि सुरक्षित और आराम से पूंछ नस द्वारा चूहों में इंजेक्ट किया जा सकता है की कुल मात्रा में 10 6 मैक्रोफेज की travenous इंजेक्शन.
- गर्म 5-10 मिनट पूंछ नस को चौड़ा करना के लिए एक हीटिंग पैड या गर्मी गोद का उपयोग चूहों. अतिताप के संकेत के लिए सभी समय मॉनिटर माउस.
- एक निरोधक युक्ति है कि पूंछ नसों के लिए उपयोग करने की अनुमति देता है के लिए माउस स्थानांतरण.
- 90 पूंछ घुमाएँ ° ताकि नस ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है. नसों पूंछ के दोनों पक्षों के के नीचे पाशर्ववत चलाने के लिए और या तो नस इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक शराब झाड़ू के साथ इंजेक्शन साइट स्वच्छ और धीरे धीरे 100 (10 6 मैक्रोफेज) μl एक 26 या 28 गेज सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर इंजेक्षन. बेवल ऊपर का सामना करना पड़ पक्ष के साथ और एक मामूली कोण, लगभग नस के लिए समानांतर में सुई डालें.
- यदि सुई ठीक से डाला जाता है कोई प्रतिरोध और महसूस किया जाना चाहिए नस में इंजेक्शन के बाद स्पष्ट हो जाना चाहिए. यदि सुई में नहीं हैनस, पूंछ उभाड़ना होगा. यदि ऐसा होता है, सुई को हटाने और फिर से कोशिश पिछले नस या अन्य प्रयास करने के लिए समीपस्थ. एक नई सुई प्रत्येक इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए के रूप में पूंछ मुश्किल है और सुई सुस्त पूंछ नस इंजेक्शन के दौरान तेजी से हो.
- इंजेक्शन के बाद, सुई को निकालने के लिए, खून बह रहा बंद हो जाता है जब तक इंजेक्शन साइट सौम्य दबाव लागू है, और एक अतिरिक्त करने के लिए सुनिश्चित करें कि खून बह रहा बंद कर दिया है 5min के लिए माउस की निगरानी.
- दोहराएँ बृहतभक्षककोशिका इंजेक्शन हर 4 दिनों के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान एक polarized मैक्रोफेज की निरंतर वितरण सुनिश्चित.
- प्रयोग के अंत में, प्रयोगात्मक विश्लेषण के साथ साथ, ब्याज की साइट से ऊतकों को हटाने और paraformaldehyde या formalin के साथ तय करने के लिए immunohistochemical धुंधला द्वारा polarized मैक्रोफेज की प्रभावी वितरण की पुष्टि.
4. प्रतिनिधि परिणाम
संख्या और निवासी macrop के फेनोटाइपकिसी भी ऊतक में hages ऊतक जांच की जा रही पर निर्भर करता है और संक्रमण या सूजन के दौरान बदल जाएगा. इसी तरह, clodronate युक्त liposomes की क्षमता ऊतक से मैक्रोफेज खलाना प्रशासन और लक्ष्य के ऊतकों को प्रभावी वितरण के मार्ग पर निर्भर करेगा. F4/80 में कमी + के बारे प्रेरित बृहतभक्षककोशिका मार्कर, F4/80 (चित्रा 1 ए) के लिए immunohistochemical धुंधला द्वारा स्पष्ट बृहदांत्रशोथ के दौरान माउस बृहदान्त्र में मैक्रोफेज में clodronate - युक्त liposomes परिणाम की intraperitoneal इंजेक्शन. Histological धुंधला भी बृहतभक्षककोशिका और ऊतक वर्गों में संख्या फेनोटाइप में मात्रात्मक अंतर को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चित्रा 1 बी से पता चलता है कि मैक्रोफेज के 55% के एक औसत clodronate युक्त liposomes द्वारा माउस कोलन में पाया कमी की तुलना में समाप्त हो गया है जब चूहों के साथ अंतःक्षिप्त रहे हैं. पीबीएस एक इंजेक्शन के नियंत्रण के रूप में अकेले. प्रत्येक मूल्य गिनती F4/80 और ARGI दाग द्वारा निर्धारित किया जाता हैएड धारावाहिक ऊतक वर्गों में 6 में 3 अंक, गिनती दो प्रायोगिक हालत अंधे व्यक्तियों द्वारा किया जा रहा है चूहों के साथ माउस प्रति 3 वर्गों में से सकारात्मक कोशिकाओं. इन परिणामों दिखाना है कि clodronate liposomes की intraperitoneal इंजेक्शन चूहों में colonic मैक्रोफेज व्यय.
विभिन्न विकास कारकों की पैदावार मैक्रोफेज कि प्रतिष्ठित (MCSF व्युत्पन्न या MCSF के व्युत्पन्न और IFNγ साथ इलाज) सक्रिय कर रहे हैं या वैकल्पिक रूप से सक्रिय (जीएम-CSF या आईएल 3 व्युत्पन्न या MCSF व्युत्पन्न और की उपस्थिति में अस्थि मज्जा से मैक्रोफेज की व्युत्पत्ति आईएल-4 के साथ इलाज). आम तौर पर एक 8 सप्ताह पुराने माउस से 2 और femurs 2 tibias से अस्थि मज्जा निस्तब्धता पैदावार 6 × 7 10 प्रति माउस nucleated कोशिकाओं और 8 पैदावार × 10 6 मैक्रोफेज MCSF व्युत्पन्न, 10 × 10 6 मैक्रोफेज जीएम-CSF व्युत्पन्न, या 12 × 10 6 आईएल 3 व्युत्पन्न मैक्रोफेज. चित्रा 2A नाइट्राट और बृहतभक्षककोशिका में IL-12p70/IL-10 अनुपात के समर्थन से पता चलता हैernatants 24 घंटे के लिए lipopolysaccharide साथ इलाज चित्रा 2B एक ठेठ 0.5 के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण × 10 MCSF से 6 मैक्रोफेज / दिखाता है - आईएल -4 व्युत्पत्ति शर्तों वैकल्पिक रूप से सक्रिय बृहतभक्षककोशिका मार्करों, ARGI, YM1 के लिए एंटीबॉडी के साथ जांच, या एक के रूप में GAPDH साथ नियंत्रण लोड हो रहा है. ये आंकड़े दर्शाते हैं कि अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज व्युत्पत्ति के दौरान एक polarized फेनोटाइप विषम जा सकता है.
पूर्व vivo व्युत्पन्न है polarized मैक्रोफेज के एक ऊतक के लिए प्रभावी हस्तांतरण प्रशासन और ऊतक तक पहुँच के मार्ग पर निर्भर है. इस के बारे प्रेरित बृहदांत्रशोथ के दौरान, मैक्रोफेज नसों इंजेक्शन सूजन की साइट के लिए यात्रा और वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज रोग की गंभीरता को कम. चित्रा 3A मैक्रोफेज की कुल संख्या से पता चलता है और + ARGI (वैकल्पिक रूप से सक्रिय) चूहों से histological वर्गों में गिना मैक्रोफेज की संख्या polarized के साथ इंजेक्शन अस्थि मज्जामैक्रोफेज व्युत्पन्न. polarized मैक्रोफेज के हस्तांतरण के बारे प्रेरित बृहदांत्रशोथ के दौरान बृहदान्त्र के प्रभाव रोग गतिविधि सूचकांक, वजन घटाने, गुदा से खून बह रहा है, और कम मल स्थिरता (3B चित्रा) पर आधारित एक additive स्कोर द्वारा दिखाया गया है. इन परिणामों दिखाना है कि पूर्व vivo व्युत्पन्न, adoptively हस्तांतरित मैक्रोफेज बृहदान्त्र और प्रभाव प्रेरित सूजन के लिए यातायात कर सकते हैं. M1 के मैक्रोफेज सूजन का प्रभाव नहीं है जबकि M2 मैक्रोफेज काफी रोग गतिविधि सूचकांक कम नहीं है.
चित्रा 1 Clodronate - युक्त liposomes प्रभावी ढंग से F4/80 खलाना और F480 + ARGI vivo में माउस कोलन में कोशिकाओं. एक मिश्रित C57BL / 6 × 129Sv के पृष्ठभूमि पर जंगली प्रकार चूहों के एक F2 पीढ़ी 5% इस के बारे में 7 दिन और इंजेक्शन आईपी के लिए दिया गया पीबीएस (नियंत्रण) या clodronate युक्त liposomes (Clodronate) 4 दिन के साथ पहले उपचार DSSऔर 0 दिन, 2, 4, और इस के बारे उपचार के दौरान 6 पर. (ए) कोलन हटा दिया गया, तय है, और वर्गों परिपक्व (F4/80) मैक्रोफेज और M2 बृहतभक्षककोशिका मार्कर, ARGI के लिए immunohistochemistry से दाग रहे थे. F4/80 Quantitation (बी) + और ARGI + मैक्रोफेज. दो प्रयोगात्मक हालत तीन वर्गों / माउस और 6 चूहों / समूह से 6 क्षेत्रों में 40 × बढ़ाई अंधे व्यक्तियों द्वारा सकारात्मक दाग कोशिकाओं की गिनती की गई. * पी <0.01.
चित्रा 2. MCSF व्युत्पन्न मैक्रोफेज एक प्रतिष्ठित सक्रिय phenotype व्यक्त और आईएल-4 के साथ MCSF व्युत्पन्न इलाज मैक्रोफेज एक वैकल्पिक रूप से सक्रिय बृहतभक्षककोशिका phenotype व्यक्त. (ए) एक प्रतिष्ठित सक्रिय phenotype के साथ अनुरूप, MCSF व्युत्पन्न मैक्रोफेज lipopolysaccharide करने के लिए प्रतिक्रिया में नाइट्रिक ऑक्साइड के उच्च स्तर का उत्पादन और Griess परख है, जो अपने बहाव metabolite, नाइट्राइट, का पता लगाता है के द्वारा मापा जा सकता है. वे ए एल एसएक उच्च IL-12p70/IL-10 अनुपात, जो एलिसा द्वारा मापा जा सकता है उत्पादन ओ. * पी <0.01 n = 3 के लिए. (बी) एक वैकल्पिक रूप से सक्रिय phenotype के साथ अनुरूप, MCSF व्युत्पन्न आईएल 4 अनिवार्यता से व्यक्त YM1 और ARGI के साथ इलाज किया मैक्रोफेज, जो पश्चिमी immunoblotting द्वारा पता लगाया जा सकता है. डेटा समान परिणामों के साथ 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं.
चित्रा 3 अंतःशिरा इंजेक्शन, पूर्व vivo वैकल्पिक रूप से व्युत्पन्न बृहदान्त्र के मैक्रोफेज यातायात और सक्रिय आंतों की सूजन को कम. एक मिश्रित C57BL / 6 × 129Sv पृष्ठभूमि पर जंगली प्रकार चूहों के एक F2 पीढ़ी छह दिनों के लिए उनके पीने के पानी में 5% इस के बारे में दिया गया. M1 और M2 मैक्रोफेज के बारे उपचार के दौरान 0 दिन और 4 पर चतुर्थ अंतःक्षिप्त थे. (ए) कोलन हटा दिया गया, तय है, और वर्गों परिपक्व मैक्रोफेज (F4/80) के लिए immunohistochemistry और एक M2 बृहतभक्षककोशिका मार्कर (ARGI) के द्वारा दाग रहे थे.नियंत्रण पीबीएस इंजेक्शन चूहों (सी) के लिए मैक्रोफेज quantitation, एम 1 (एम 1 +) मैक्रोफेज और M2 मैक्रोफेज (M2 +) के साथ इंजेक्शन चूहों के साथ इंजेक्शन चूहों 40 × बढ़ाई सकारात्मक दाग कोशिकाओं 3 माउस / अनुभागों से 6 क्षेत्रों में गिनती के द्वारा प्रदर्शन किया गया और 6 चूहों / समूह से. गिनती दो प्रायोगिक हालत अंधे व्यक्तियों द्वारा किया गया था. (बी) रोग गतिविधि की निगरानी और उपचार के दौरान दैनिक रन बनाए और एक additive स्कोर वजन घटाने, गुदा से खून बह रहा है, और कम मल स्थिरता पर आधारित है. * पी <0.05 n के लिए = 6 2 स्वतंत्र प्रयोगों में चूहों.
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Discussion
मैक्रोफेज phagocytic कोशिकाओं है कि प्रतिरक्षा प्रणाली में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. वे सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू करने और अर्जित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया निर्देशन के लिए जिम्मेदार हैं. आमतौर पर, मैक्रोफेज प्रतिष्ठित सक्रिय LPS IFNγ या द्वारा सक्रिय कर रहे हैं और रोगज़नक़ों को नष्ट करने और एक भड़काऊ प्रतिक्रिया बढ़ते हैं 1 के लिए जिम्मेदार हैं. इसके विपरीत, वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज आईएल 4 या आईएल -13 सक्रिय कर रहे हैं और 1 सूजन के संकल्प के दौरान मलबे में एक भूमिका सफाई और ऊतक remodeling निभाते हैं. पेट में विशेष मैक्रोफेज उनके जीवाणुनाशक गतिविधि को बनाए रखने, लेकिन एक प्रतिक्रिया समर्थक भड़काऊ 2 माउंट नहीं है. लाभदायक वनस्पति और खाद्य प्रतिजन के लिए यह सहिष्णुता सामग्री की निकासी के लिए अनुमति देता है कि एक अनुचित और संभावित रोग प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 3 की शुरुआत के बिना उपकला बाधा उल्लंघनों. न्यायपालिका colonic बृहतभक्षककोशिका समारोह योगदान कर सकते हैंसूजन आंत्र रोग, चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम, और कोलोरेक्टल कैंसर 3-5 सहित रोग की स्थिति के लिए. बृहतभक्षककोशिका फेनोटाइप स्थानीय microenvironment पर निर्भर है तो स्वास्थ्य या बीमारी में उनकी भूमिका को परिभाषित करने को चुनौती देने जा सकता है. यहां वर्णित प्रोटोकॉल के vivo वातावरण में जटिल से बृहतभक्षककोशिका कमी के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, बगल में बृहतभक्षककोशिका phenotype की भूमिका की जांच करने के लिए, phenotypically परिभाषित है polarized मैक्रोफेज अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस से पूर्व vivo प्राप्त किया जा सकता है और adoptively के साथ या बिना पूर्व मैक्रोफेज की कमी चूहों को हस्तांतरित.
Clodronate - युक्त liposomes बृहतभक्षककोशिका "आत्महत्या" को बढ़ावा देने और 6 ऊतकों की एक किस्म में मैक्रोफेज खलाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. मैक्रोफेज clodronate युक्त liposomes, जो बाद, lysosomal clodronate सेल और उत्प्रेरण apoptosis के 12 में जारी phospholipases द्वारा अपमानित हैं phagocytose 12 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है. Liposomes समाधान में समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए से पहले सिरिंज में और माउस में इंजेक्शन से पहले लोड हो रहा है, प्रशासन या लक्ष्य ऊतक के मार्ग की परवाह किए बिना. पीबीएस इंजेक्शन और पीबीएस युक्त liposomes की इंजेक्शन की आवश्यकता है नियंत्रण जब clodronate - युक्त 7 liposomes साथ vivo में मैक्रोफेज घट. पीबीएस - युक्त liposomes पीबीएस अकेले इंजेक्शन की तुलना में एक बेहतर नियंत्रण होना प्रतीत होता है. हालांकि, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि जबकि कुछ रिपोर्टों को सफलतापूर्वक एक नियंत्रण के रूप में पीबीएस युक्त liposomes का इस्तेमाल किया है, हम, और दूसरों की सूचना दी है कि पीबीएस युक्त liposomes कुछ प्रयोगात्मक शर्तों 8, 9 में मैक्रोफेज खलाना कर सकते हैं. इसके अलावा, अकेले में liposomes के phagocytosis 10 अस्थायी रूप से रोकना करने के लिए सूचित किया गया है. पीबीएस युक्त liposomes द्वारा बृहतभक्षककोशिका कमी पी पर निर्भर हो सकता हैhagocytic क्षमता और माउस तनाव के अनुसार भिन्न हो सकती है, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, ऊतक, और / या प्रयोगात्मक हालत. का उपयोग पीबीएस नियंत्रण और एक विशिष्ट अनुप्रयोग में उनकी प्रभाव बृहतभक्षककोशिका कमी पर के रूप में liposomes युक्त करने के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए. इसलिए, हम अनुशंसा करते हैं कि दोनों पीबीएस और PBS युक्त liposomes इंजेक्शन नियंत्रण के रूप में प्रारंभिक प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल किया जा.
बृहतभक्षककोशिका कमी प्रयोगों के डिजाइन में एक महत्वपूर्ण विचार clodronate युक्त liposomes की प्रशासन का मार्ग है. हम सफलतापूर्वक intraperitoneal इंजेक्शन 8 का उपयोग करते हुए चूहों में colonic मैक्रोफेज को निशाना बनाया. अन्य intrarectal प्रशासन या नसों में इंजेक्शन 9, 11 का इस्तेमाल किया है. Intrarectal और intraperitoneal प्रशासन के दोनों colonic मैक्रोफेज की लगभग 50% व्यय करना बताया गया है जबकि अंतःशिरा इंजेक्शन लामिना से व्यय करना मैक्रोफेज का 90% करने के लिए सूचित किया गया है8 propria, 9, 11. हम intraperitoneal इंजेक्शन तकनीक की सादगी के कारण लिए clodronate युक्त liposomes देने के लिए प्रदर्शन के लिए चुना है और क्योंकि हमारा समान अध्ययन सफलतापूर्वक 7 प्रशासन के इस मार्ग का इस्तेमाल किया है. हालांकि, अगर बृहदान्त्र में कमी के उच्च स्तर के एक प्रयोग के लिए आवश्यक हैं, अंतःशिरा इंजेक्शन कमी में सुधार कर सकते हैं.
प्रशासन के मार्ग में विभिन्न ऊतकों में बृहतभक्षककोशिका कमी के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है. Intraperitoneal इंजेक्शन peritoneal, omentum, parathymic लिम्फ नोड, जिगर, और प्लीहा 12 मैक्रोफेज खलाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. नसों में इंजेक्शन के लिए जिगर, तिल्ली, और अस्थि मज्जा 12 में मैक्रोफेज खलाना इस्तेमाल किया गया है. Clodronate युक्त liposomes की intraventricular प्रशासन सेरिबैलम, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी 12 से perivascular और तानिका संबंधी मैक्रोफेज खलाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Intratrachealऔर clodronate युक्त liposomes की intranasal प्रशासन के वायुकोशीय मैक्रोफेज व्यय इस्तेमाल किया गया है. अंत में, स्थानीय प्रशासन को सफलतापूर्वक किया गया है के वृषण, और vitreal 12 मैक्रोफेज 13, व्यय किया. एक लक्ष्य के ऊतकों में बृहतभक्षककोशिका कमी की प्रभावकारिता प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए और immunohistochemistry (चित्र 1 ए) के द्वारा या प्रवाह cytometry द्वारा ऊतकों धुंधला द्वारा मान्य है. कुछ मामलों में यह को बृहतभक्षककोशिका कमी की दर में वृद्धि आवश्यक हो सकता है. चर है कि कमी को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है clodronate युक्त liposome प्रशासन का मार्ग, इंजेक्शन के प्रति clodronate युक्त liposomes, और / या इंजेक्शन की आवृत्ति की राशि बदल शामिल हैं.
जब clodronate युक्त liposomes साथ मैक्रोफेज घट डेटा की व्याख्या में एक महत्वपूर्ण विचार है कि सभी पेशेवर phagocytes समाप्त हो रहे हैं, वृक्ष के समान कोशिकाओं सहित. सुनिश्चित करें कि एकजैविक प्रभाव बृहतभक्षककोशिका निर्भर है, पूरक पुनर्गठन प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं. अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस से मैक्रोफेज पाने पुनर्गठन प्रयोगों के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुसंधान जांच बृहतभक्षककोशिका समारोह है. हम सफलतापूर्वक के लिए इन विट्रो 14 मैक्रोफेज की वैकल्पिक सक्रियण में PI3K संकेतन मार्ग की भूमिका तलाश पढ़ाई में इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है. व्युत्पत्ति प्रक्रिया में दो महत्वपूर्ण कदम हैं. सबसे पहले, पालन कमी अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस से पक्षपाती कोशिकाओं को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण कदम है, या तो mesenchymal कोशिकाओं या परिपक्व hematopoietic कोशिकाओं contaminating के. दूसरा, बृहतभक्षककोशिका phenotype के प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में उनके उपयोग के लिए पूर्व की पुष्टि की जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल के लिए एक संशोधन है कि अलग आनुवंशिक मॉडल को बृहतभक्षककोशिका व्युत्पत्ति और पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बृहतभक्षककोशिका phenotype और इन विट्रो में समारोह में विशिष्ट जीन की भूमिका की जांच की अनुमति हैघ vivo में. पुनर्गठन के प्रयोगों के लिए अंतःशिरा इंजेक्शन बृहतभक्षककोशिका वितरण का सबसे आम तरीका है, लेकिन दोनों सेल मात्रा और इंजेक्शन आवृत्ति एक विशिष्ट अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. रेट्रो - कक्षीय इंजेक्शन के पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इसी तरह के परिणाम प्रदान करना चाहिए. ध्यान से, मैक्रोफेज सूजन की साइटों के लिए भर्ती कर रहे हैं और उनके फेनोटाइप उनके microenvironment से संकेत के जवाब में बदला जा सकता है. अंत में, दत्तक हस्तांतरण के लिए एक लक्ष्य ऊतक लेकिन निवासी ऊतक मैक्रोफेज की पूर्व कमी adoptively हस्तांतरित मैक्रोफेज की स्थापना की अनुमति के लिए आवश्यक हो सकता है मैक्रोफेज देने के लिए पर्याप्त हो सकता है.
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मौजूदा तरीकों से अधिक लाभ के एक नंबर है. सशर्त पृथक ट्रांसजेनिक माउस CD11b-DTR, 15 का उपयोग करके मैक्रोफेज खलाना करने के लिए एक वैकल्पिक विधि है. इस माउस में, मानव डिप्थीरिया विष रिसेप्टर (डीटी) नियंत्रण ओ के तहत व्यक्त की है.च CD11b प्रमोटर बृहतभक्षककोशिका विशेष. यह विष संवेदनशीलता प्रदान और डीटी इंजेक्शन बृहतभक्षककोशिका कमी 15 का कारण बनता है. हालांकि प्रतिशत बृहतभक्षककोशिका कमी इस मॉडल में अधिक से अधिक है, clodronate युक्त liposomes दो महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. Clodronate युक्त liposome इंजेक्शन किसी भी माउस तनाव में मैक्रोफेज खलाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मैक्रोफेज समय और लागत backcrossing के लिए आवश्यक कि DTR माउस CD11b विधि का उपयोग करने की आवश्यकता है बिना आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से समाप्त किया जा सकता है. एक ही कारण के लिए, मैक्रोफेज किसी भी पृष्ठभूमि पर चूहों से समाप्त किया जा सकता है, जो एक महत्वपूर्ण विचार है अगर जांच की जा रही मॉडल एक अद्वितीय या मिश्रित पृष्ठभूमि की आवश्यकता है. इसी तरह, दत्तक हस्तांतरण एक माउस रेखा से पूर्व vivo व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग करते हुए प्रयोगों alloreactivity साथ किसी भी समस्याओं से बचा जाता है.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अनुसंधान सवालों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है. हम वें का इस्तेमाल किया हैese तकनीक बृहदान्त्र में सूजन में मैक्रोफेज की भूमिका का अध्ययन. Liposome clodronate युक्त मध्यस्थता बृहतभक्षककोशिका कमी और मैक्रोफेज के दत्तक हस्तांतरण के ऊतकों की एक बड़ी संख्या को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बृहतभक्षककोशिका दत्तक हस्तांतरण को पुनर्गठित समाप्त मैक्रोफेज या सूजन की आनुवंशिक या inducible मॉडल में सूजन की साइटों के लिए प्रत्यक्ष मैक्रोफेज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह प्रोटोकॉल भी जहां मैक्रोफेज या उनके ध्रुवीकरण विकृति के साथ जुड़े रहे हैं रोग मॉडल में बृहतभक्षककोशिका लक्षित चिकित्सा विज्ञान की जांच करने के लिए एक मंच प्रदान करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एक 'रिसर्च सहायता में अनुदान' है Crohn है और कनाडा के बृहदांत्रशोथ फाउंडेशन से LMS, जो / गैस्ट्रोएंटरोलॉजी कैनेडियन स्वास्थ्य / अनुसंधान Crohn है 'एस के एसोसिएशन और कनाडा नई अन्वेषक पुरस्कार के बृहदांत्रशोथ फाउंडेशन के एक कनाडा के एसोसिएशन द्वारा समर्थित है के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
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References
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