Summary
マクロファージは、多くの組織の恒常性と病理学の中心的な役割を果たしています。ここで紹介するプロトコルは、マクロファージを枯渇させるための方法について説明します
Abstract
マクロファージは自然免疫応答を開始し、後天性免疫応答を誘導、伝染性の課題やけがに対する自然免疫応答において重要なプレーヤーである。マクロファージ機能障害は、適切な免疫応答をマウントすることができないにつながることができ、そのように、炎症性腸疾患を含む多くの病気のプロセスに関与されています。マクロファージは、次の2つのカテゴリに大別されている偏光の表現型を表示します。古典的活性化マクロファージは、IFNγまたはLPS刺激によって活性化され、解像度で交互に活性化マクロファージのに対し、IL-4あるいはIL-13によって活性化され、掃気破片や組織リモデリングに参加し、関与している細菌のチャレンジへの応答に重要な役割を果たす炎症の段階。 in vivoでの炎症反応時には、マクロファージが免疫細胞の浸潤の複雑な混合物の中で発見されており、悪化またはresolvinで参加することができますgの炎症。全体の動物モデルにおけるin situでのマクロファージの役割を定義するためには、複雑な環境からマクロファージを枯渇の影響を検討する必要がある。 in situでマクロファージ表現型の役割についての質問をし、表現型が定義された偏光マクロファージは骨髄穿刺液から、ex vivoで誘導することができるとマクロファージの事前の枯渇であるかどうかにかかわらず、マウスに戻って追加しました。プロトコルでクロドロネート含有リポソームここで紹介するのに対し、PBS注入されたコントロールは、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発マウスにおける大腸炎の間に大腸マクロファージを枯渇させるために使用された。さらに、偏光マクロファージはex vivoで誘導され、静脈内注射によりマウスに転送されます。このアプローチには注意点がクロドロネート含有リポソームは枯渇によって観測された効果はマクロファージ特異的、再Oであることを確認するため、樹状細胞やマクロファージの両方を含むすべてのプロの食を枯渇させることです。マクロファージの移入によってfの表現型が必要です。マウスの全身のマクロファージの枯渇は、優れた補完的なアプローチであるCD11bを-DTR背景に戻し交配マウスによって達成することができる。クロドロネート含有リポソーム媒介枯渇の利点は、戻し交配マウスに必要な時間と費用を必要とせず、それは関係なく、マウス（C57BL / 6、BALB / c、または混合背景の背景のマウスで使用することができることです。 。）
Protocol
1。クロドロネート含有リポソームを用いたオゾンマクロファージ
- リポソームは、4℃で保存されている注射前に2時間、彼らは室温（18℃）に順応できるように冷蔵庫からクロドロネート含有リポソーム、PBS-含有リポソーム、または滅菌PBS（インジェクションコントロール）を削除します。
- 1mlのシリンジに200μlをロードする前に均一な分布を確実にするためにリポソーム8-10倍を含むチューブを反転します。注射器の上部に26ゲージの針を取り付けます。
- 左手、首筋だけで頭と手足を固定するのに十分な皮膚を持って耳を下にマウスを使用します。
- 内部器官は腹部の右下の象限に位置しています注射部位から離れて移動するので、頭が地面に向かってわずかになるようにマウスを傾けてください。
- 手のひらの間に注射器を転がし、6回注入に均等に前のリポソーム溶液を配布し、それを反転させる。 <LI> 30から40度の角度で、マウスの腹部の右下側に針を挿入します。リポソーム溶液またはPBS200μlを注入します。
- 誘発炎症モデルの中に、DSS誘発性大腸炎のように、新しい浸潤マクロファージを枯渇させるためのプロトコルの間に常駐マクロファージと2日毎の枯渇を確保するための実験的炎症の発症に先立って4日間のマウスを注入します。
- 実験の最後に、計画された実験的解析とともに、興味のあるサイトからの組織を除去し、免疫組織化学的染色によりマクロファージ枯渇を確認するために、パラホルムアルデヒドで固定します。
2。骨髄穿刺液からの偏マクロファージの誘導
- 生後8〜12週間の間にマウスからの骨髄は、骨髄由来マクロファージの最高収率を提供しています。マウスを安楽死させると、その後ろに置き、可能な限り、その手足を伸ばし、その足を突き止める。
- ホー滅菌での作業dは、できるだけ多くの筋肉のように離れて切断、大腿骨と脛骨を削除します。
- 10％FCSをIMDMを使用して骨からフラッシュ骨髄は26ゲージの針を備えた5mlの注射器にロードされます。
- 希薄骨髄は10％FCS、75 cm 2の組織培養フラスコ内の場所のセル、および37℃、5％4時間CO 2をIMDM 40 mlに吸引する。このステップでは、造血前駆細胞から接着性の間葉系細胞や成熟したマクロファージを削除します。
- 1200 rpmで5分間に50 mlのコニカルFalconチューブと遠心分離機に非接着性の前駆細胞を含む転送培養上清。
- 5ミリリットルIMDM、10％FCSに再懸濁し、細胞ペレットを酢酸中で20に細胞懸濁液1を希釈することにより有核細胞をカウントします。この手順では、赤血球、残りの核を含むすべての細胞は血球計算板でカウントすることができ溶解する。
- 0.5×10 6細胞/完全培地のmlで再懸濁し、IMDM、10％FCS、150μMモノチオグリセロール（MTG）、およびMCSF、GM-CSF、またはIL-3のいずれかの10 ng / mlの。 GM-CSFまたはIL-3由来のマクロファージを交互にアクティブ化されるのに対し、MCSF由来のマクロファージは、古典的なマクロファージを活性化される。
- 非接着細胞をスピンダウンし、フラスコに戻し、4日目に培地を交換し、7日、廃棄、非付着細胞では。
- さらに、IFNγ（10 ng / ml）を、またはIL-4（10 ng / mlの）はそれぞれ、古典的活性化あるいは活性化表現型にスキューマクロファージに7日目にMCSF由来細胞を含むフラスコに添加することができます。さらに3日間細胞をインキュベートします。
- 10日目に、メディアを取り出し、細胞解離バッファー（GIBCO-BRL）を用いて組織培養フラスコから細胞を持ち上げます。場所5室温で5分間細胞（18℃）でのバッファのmlとし、手のひらのかかとをしっかり数回フラスコの側面を強打。細胞がフラスコの下を調べることにより、フラスコからリフトオフされていることを確認し顕微鏡。ピペットで15 mlコニカルファルコンチューブに細胞を再懸濁し、IMDM、10％FBS、追加の10mlでフラスコを洗います。プール、300×gで5分間、細胞をスピンダウンする。
- 滅菌PBS pH7.4の10 7細胞/ mlの濃度で血球と再懸濁しを使用して生細胞をカウントします。マクロファージは、マウスに注入するための準備が整いました。
- リザーブ1.0×マクロファージ表現型を評価するための10 6マクロファージ。リポ多糖を分泌する一酸化窒素の高濃度とIL-10のIL-12p70と低レベルで刺激した古典的活性化マクロファージは、代わりに活性化マクロファージと比較されます。あるいは、活性化マクロファージは、恒常的にYM1とウエスタンブロット法によって検出することができアルギナーゼI（argiは）を表現します。
3。マウスへのマクロファージをTranferring
- 10 7細胞/ mlの濃度で滅菌したPBSに再懸濁し、マクロファージ。これにすることができ安全かつ快適に尾静脈によってマウスに注入することができるボリュームです。100μlの総体積で10 6マクロファージのtravenous注入。
- 尾静脈を拡張するために5〜10分間加温パッドや熱ラップを使用して、暖かいマウス。温熱療法の兆候がすべての回でマウスを監視することができます。
- 尾静脈へのアクセスを許可抑制デバイスにマウスを転送します。
- 尾を90°回転させ静脈が上向きになるように。静脈は尾の両側の下、横方向で実行のいずれか静脈を使用することができます。
- アルコール綿棒で注射部位をきれいにし、徐々に26または28ゲージの針を1 mlのシリンジを用いて100μL（10 6マクロファージ）を注入します。上向きベベル側と静脈にほぼ平行にわずかに角度で針を挿入します。
- 針が正しく挿入されている場合には抵抗を感じてはいけませんと静脈注射後に明らかになるはずです。針が含まれていない場合静脈、尾が膨らみます。この問題が発生した場合は、針を除去し、再び最後の試行またはその他の静脈に近接してみてください。テールはタフで、針が尾静脈注射時にすぐに鈍くなるように新しい針は、それぞれの注入を使用する必要があります。
- 注射後、針を除去出血が止まるまで注射部位に穏やかな圧力を適用し、その出血が停止していることを確認するために追加の5分間マウスを監視することができます。
- 実験手順の間に偏光マクロファージの連続的な配信を保証するために4日ごとにマクロファージの注入を繰り返します。
- 実験の最後に、実験的解析とともに、興味のあるサイトからの組織を除去し、免疫組織化学的染色によりマクロファージ偏光の効果的な配信を確認するために、パラホルムアルデヒドまたはホルマリンで固定します。
4。代表的な結果
常駐macropの数と表現型任意の組織でhagesは、検証される組織に依存しており、感染や炎症時に変更されます。同様に、組織からマクロファージを枯渇させるクロドロネート含有リポソームの能力は、管理および標的組織への効果的な配信の経路に依存します。 F4/80の減少クロドロネート含有リポソームの結果+マクロファージマーカーの免疫組織化学的染色、F4/80（ 図1A）によって明らかDSS誘発性大腸炎の間にマウスの結腸におけるマクロファージの腹腔内注射。組織染色は、組織切片中のマクロファージ数および表現型の量的違いを決定するために使用することができます。 図1Bは、マウスを注射されたとき、マクロファージの55％の平均が、マウスのコロンで検出されない枯渇に比べクロドロネート含有リポソームで枯渇していることを示していますインジェクションコントロールとしてPBS単独。各値は、F4/80とargiは染色数えることによって決定されます実験条件に盲二人の人物によって行われているカウントとマウスあたり3つのセクションの3ポイントで6匹のマウスからシリアル組織切片のED陽性細胞、。これらの結果はクロドロネートリポソームの腹腔内注射は、マウスの大腸マクロファージを枯渇させることを示している。
（GM-CSFまたはIL-3由来またはMCSF由来と古典的活性化（MCSF由来またはMCSF由来とIFNγで処理する）か、あるいは活性化される別の成長因子の利回りマクロファージの存在下で骨髄からマクロファージの誘導IL-4）で処理した。 8週齢のマウスから2大腿骨と2脛骨から骨髄をフラッシュすると、通常はマウスあたり6×10 7個の有核細胞と収量8×10 6 MCSF由来マクロファージ、10×10 6、GM-CSF由来のマクロファージ、または12を生成する× 10 6、IL-3由来のマクロファージ。図2Aは、マクロファージの亜硝酸塩とIL-12p70/IL-10比SUPのを示していますernatantsは24時間リポ多糖で処理され、図2Bは MCSFから0.5×10 6マクロファージの典型的なウェスタンブロット分析を示す+ / -は。IL-4誘導条件は、argiは、代わりに活性化マクロファージのマーカーに対する抗体とYM1をプローブとして、またはGAPDHとコントロールをロードする。これらのデータは、骨髄由来マクロファージを誘導中に、偏光の表現型に偏りが発生する場合がありますことを実証している。
ex vivoで派生した偏光マクロファージの組織への効果的な転送は、管理および組織へのアクセスの経路に依存しています。 DSS誘発性大腸炎の間に、マクロファージが静脈内炎症部位 に移動し、代わりに活性化マクロファージは、疾患の重症度を軽減する注入した。 図3Aは、マクロファージや偏光を注入したマウス由来の組織切片でカウントargiは+（あるいは活性化）マクロファージの数の合計数を示しています。骨髄由来マクロファージ。 DSS誘発性大腸炎の間に大腸に偏マクロファージの移動の影響は、疾患活動性指数、体重減少、直腸出血、減少して便の硬さ（ 図3B）に基づいて、添加剤のスコアで示されています。これらの結果は、ex vivoで、派生ことを示している、養子転送マクロファージがコロンと衝撃誘発炎症へのトラフィックをすることができます。 M2マクロファージが有意に疾患活動性指数を減らす一方、M1マクロファージは、炎症に影響を与えません。
図1。クロドロネート含有リポソームは、実質的にin vivoでのマウスのコロンでF4/80 +およびF480 + argiは+細胞を枯渇させる。混合C57BL / 6×129Sv背景の上に野生型マウスのF2世代前DSS処理をPBS（対照）またはクロドロネート含有リポソーム（クロドロネート）4日とIP 7日間の5％DSSを与えられ、注入したと0日、2、4、6のDSS治療中。 （A）コロンは、削除され固定され、セクションは、成熟したマクロファージ（F4/80）とM2マクロファージマーカー、argiはのための免疫組織化学によって染色された。 F4/80 +とargiは+マクロファージ（B）の定量。積極的に染色した細胞は、3つのセクション/マウスから6匹のマウス/群から6つのフィールドでは40倍の倍率での実験条件に盲検2個人によってカウントした。 * P <0.01。
図2。MCSF由来のマクロファージは、古典的活性化表現型を発現し、IL-4で処置したMCSF由来のマクロファージは、代わりに活性化マクロファージの表現型を表現しています。 （）古典的活性化表現型と一致して、MCSF由来のマクロファージは、リポ多糖に応答して、一酸化窒素の高いレベルを生成し、その下流の代謝物、亜硝酸塩を検出したグリースアッセイによって測定することができる。彼らはALSELISAにより測定することができ、より高いIL-12p70/IL-10比を生成O。 * n = 3のためのP <0.01。 （B）あるいは活性化表現型と一致して、MCSF由来のマクロファージは、免疫ブロット法ウェスタンによって検出することができ、IL-4構成的に明示YM1とargiは、処理した。データは、同様の結果3つの独立した実験の代表的なものである。
図3静脈内注入し、ex vivoで由来の代わりにコロンにマクロファージのトラフィックを活性化し、腸の炎症を軽減します。混合C57BL / 6×129Sv背景の上に野生型マウスのF2世代は、6日間の彼らの飲料水の5％DSSを与えられた。 M1とM2マクロファージはDSS処理中に0日目と4日に静脈注射した。 （A）コロンは、削除され固定され、セクションは、成熟したマクロファージ（F4/80）とM2マクロファージマーカー（argiは）の免疫組織化学によって染色したしました。コントロールPBSを注射したマウスのためにマクロファージの定量（C）、M1マクロファージ（+ M1）とM2マクロファージ（+ M2）を注射したマウスに注射したマウスは、3つのセクション/マウスからの6つのフィールドでは40倍の倍率で積極的に染色された細胞を数えることによって行った。 6匹/群から。カウントは、実験条件に盲二人の個人によって行われた。 （B）疾患の活動が監視され、治療期間中、毎日記録し、体重減少、直腸出血に基づく添加物のスコアであり、便の硬さを減少した。 * P nの<0.05 2つの独立した実験で= 6マウス。
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Discussion
マクロファージは、免疫システムにおいて重要な役割を果たしている貪食細胞である。彼らは、自然免疫応答を開始し、後天性免疫応答を誘導する責任があります。一般的に、古典的活性化マクロファージは、IFNγまたはLPSによって活性化され、病原体を排除し、炎症反応1をマウントするための責任がありますされています。逆に、代わりに活性化マクロファージはIL-4あるいはIL-13によって活性化と炎症1の解決時に掃気破片や組織リモデリングに重要な役割を果たしている。腸内で特殊なマクロファージはそれらの殺菌活性を保持しますが、炎症誘発性応答2をマウントしないでください。有益な植物や食物抗原に対するこの許容値は、不適切な可能性の病理学的免疫応答3を開始せずに違反上皮バリアをその物質のクリアランスが可能になります。異常な結腸のマクロファージ機能に貢献することができ炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、大腸癌3月5日を含む病理学的状態に。挑戦することができ、健康や疾患におけるそれらの役割を定義するので、マクロファージの表現型は、局所微小環境に依存しています。ここで説明するプロトコルは、 生体内環境での複合体からのマクロファージの枯渇が可能になります。さらに、in situでのマクロファージの表現型の役割を調べるために、表現型が定義された偏光マクロファージは骨髄穿刺液からex vivoで誘導することができると養子、あるいはマクロファージの前に枯渇せずに、マウスに転送されます。
クロドロネート含有リポソームは、マクロファージの"自殺"を促進し、組織の6の様々なマクロファージを枯渇させるために使用されている。マクロファージは、細胞とアポトーシスを誘導12にクロドロネートを放出するリソソームホスホリパーゼによって、その後分解されクロドロネート含有リポソームを、貪食12日に4°Cで安定しています。シリンジにおよびマウスへの注射の前にロードする前に、リポソームは、均等にかかわらず投与または標的組織のルートの、溶液中に分散されている必要があります。クロドロネート含有リポソーム7で、生体内でマクロファージを枯渇させるときにリポソームが必要とされるPBS含有のPBS注射および注入を制御します。 PBSを含有するリポソームは、PBS注射単独よりも優れたコントロールであるように思えるでしょう。ただし、一部のレポートが正常にコントロールとしてPBS-含有リポソームを使用している間、注意することが重要である;我々 、そして、他のものは、PBSを含有するリポソームは、いくつかの実験条件8,9でマクロファージを枯渇させることができることが報告されているさらに、単独でリポソームは、一時的に10食作用を阻害することが報告されている。 PBS-含有リポソームによるマクロファージの枯渇は、pに依存することができるhagocytic能力とマウス系統、遺伝的背景、組織、および/または実験条件に応じて異なる場合があります。特定のアプリケーションにおけるマクロファージの枯渇の制御とその効果としてPBS-含有リポソームの使用は実験的に決定する必要があります。したがって、我々はPBSとPBS含有リポソームの両方が初期の実験中に注入コントロールとして使用することをお勧めします。
マクロファージ枯渇実験を設計する上で重要な考慮事項は、クロドロネート含有リポソームの投与経路である。我々は正常に腹腔内注射8を使用してマウスでは大腸マクロファージを標的にしている。他の直腸内投与または静脈注射9、11を使用しています 。直腸内および腹腔内投与は、両方の静脈注射は粘膜からのマクロファージの90％まで激減することが報告されているのに対し、大腸マクロファージの約50％を枯渇させることが報告されている固有8、9、11。我々は技術のシンプルさに起因するクロドロネート含有リポソームを提供するために腹腔内注射を行うために選んだ我々に同様の研究は、正常に管理7のこのルートを使用しているからである。しかし、大腸の枯渇の高いレベルは、実験に必要とされている場合は、静脈注射は、枯渇が向上する場合があります。
投与経路は、異なる組織におけるマクロファージの枯渇のために重要な考慮事項です。腹腔内注射は、腹膜、大網、摘除リンパ節、肝臓、脾臓のマクロファージ12を枯渇させるために使用されている。静脈内注射は、肝臓、脾臓、骨髄12にマクロファージを枯渇させるために使用されている。クロドロネート含有リポソームの脳室内投与は、小脳、大脳、脊髄12から血管や髄膜マクロファージを枯渇させるために使用されている。気管内とクロドロネート含有リポソームの鼻腔内投与は、肺胞マクロファージを枯渇させるために使用されている。最後に、地方行政は正常精巣とvitrealマクロファージ12、13を枯渇させる使用されています。標的組織におけるマクロファージの枯渇の有効性は実験的に決定され、免疫組織化学（ 図1A）またはフローサイトメトリーによる組織を染色することによって検証する必要があります。いくつかのケースでは、マクロファージ枯渇率を高める必要があるかもしれません。枯渇を高めるために最適化することができる変数は、クロドロネート含有リポソーム投与、注射当たりクロドロネート含有リポソームの量、および/または注入の周波数の経路を変更する方法もあります。
クロドロネート含有リポソームとマクロファージを枯渇させるデータの解釈に重要な考慮事項は、すべてプロの食が樹状細胞を含む、枯渇しているということです。ていることを確認するには生物学的効果はマクロファージ依存性である、補完的な再実験が必要となります。骨髄穿刺液からマクロファージを導出することは有用な再構成実験のためのツールとしてだけでなく、マクロファージの機能を調査する研究である。我々は正常マクロファージ14の別の活性化にPI3Kシグナル伝達経路の役割を探求するin vitro試験では、このプロトコルを使用しています。派生プロセス内の2つの重要なステップがあります。まず、付着枯渇のステップのいずれか間葉細胞または成熟した造血細胞を汚染し、ヒト骨髄液から付着細胞を除去することが重要です。第二に、マクロファージ表現型は、実験の手順でそれらの使用する前に確認すべきである。このプロトコルへの変更は、異なる遺伝的モデルは、in vitroでマクロファージ表現型と関数の中で特定の遺伝子の役割の調査を可能にして、マクロファージの派生と再構成に使用することができますです。in vivoでの D。再構成実験では、静脈注射のためにマクロファージ配信の最も一般的なモードですが、細胞の量と射出周波数の両方は、特定の研究のために最適化することができます。眼窩注射は再構成のために使用することができ、同様の結果を提供する必要があります。注目すべきは、マクロファージが炎症部位に動員され、その表現型は、それらの微小環境からの信号に応じて変更される場合があります。最後に、養子移入は、ターゲット組織にマクロファージを提供するのに十分であるかもしれませんが、居住者組織マクロファージの事前の枯渇は養子転送マクロファージの設立を許可する必要があるかもしれません。
ここで紹介するプロトコルは、既存の方法より多くの利点があります。マクロファージを枯渇させるための代替メソッドは、条件付きのアブレーショントランスジェニックマウス、CD11bを-DTR 15を使用することです。このマウスにおいて、ヒトジフテリア毒素（DT）受容体は、制御o下で発現されるFマクロファージ固有のCD11bのプロモーター。これは毒素感受性を付与するとDTの注入は、マクロファージ枯渇15になります 。割合マクロファージの枯渇は、このモデルでは大きいものの、クロドロネート含有リポソームは、2つの重要な利点を提供しています。クロドロネート含有リポソーム注射剤は、任意のマウス株でマクロファージを枯渇することができます。マクロファージは、CD11bを-DTRマウスのメソッドを使用するために必要な交配に必要な時間とコストをかけずに、遺伝子組み換えマウスから枯渇することができます。同じ理由で、マクロファージが検討されてモデルがユニークなまたは混合背景を必要とする場合に重要な考慮事項である任意の背景上でマウスから枯渇することができます。同様に、マウスラインからex vivoで由来マクロファージを用いた養子移入実験では、同種反応性に問題を回避することができます。
ここで説明するプロトコルは、研究のさまざまな質問に適用することができます。我々は目を使用しているESEは、技術結腸に炎症におけるマクロファージの役割を研究する。クロドロネート含有リポソーム媒介マクロファージの枯渇とマクロファージの移入は、組織の多数を標的とするために使用することができます。マクロファージの養子移入を再構成枯渇マクロファージや炎症の遺伝的または誘導モデルの炎症部位への直接のマクロファージに使用することができます。このプロトコルはまた、マクロファージやその偏光は病理学に関連付けられている疾患モデルにおけるマクロファージ標的治療を検討するためのプラットフォームを提供します。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、消化器/カナダヘルスリサーチ/ Crohn病協会とカナダ新奨励賞の大腸炎財団のカナダの協会によってサポートされているLMSへのクローン病とカナダの大腸炎財団から "研究の援助のグラントによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
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References
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