Summary
Os macrófagos desempenham um papel central na homeostase e patologia em muitos tecidos. O protocolo apresentado aqui descreve métodos para esgotar macrófagos
Abstract
Os macrófagos são jogadores importantes na resposta imune inata ao desafio infecciosa ou lesão, iniciando a resposta imune inata e direcionar a resposta imune adquirida. Macrófago disfunção pode levar a uma incapacidade para montar uma resposta imune adequada e, como tal, tem sido implicada em muitos processos de doença, incluindo doenças inflamatórias intestinais. Macrófagos exibir fenótipos polarizadas que são amplamente divididos em duas categorias. Macrófagos activados Classicamente, activado por estimulação com IFN-y ou LPS, desempenham um papel essencial na resposta ao desafio bacteriano enquanto os macrófagos alternativamente activados, activado por IL-4 ou IL-13, participar em detritos de limpeza e remodelação do tecido e têm sido implicados na resolução fase de inflamação. Durante uma resposta inflamatória in vivo, os macrófagos são encontrados no meio de uma mistura complexa de infiltração de células imunes e podem participar de exacerbando ou Resolvininflamação g. Para definir o papel de macrófagos in situ num modelo animal como um todo, é necessário examinar o efeito de esgotar macrófagos a partir do ambiente complexo. Para fazer perguntas sobre o papel do fenótipo de macrófagos in situ, fenotipicamente definidos macrófagos polarizadas podem ser derivadas ex vivo, a partir de aspirados de medula óssea e adicionada de volta para ratos, com ou sem depleção prévia de macrófagos. No protocolo aqui apresentado clodronato contendo lipossomas, versus controlos injectados com PBS, foram utilizados para esgotar macrófagos do cólon durante dextrano sulfato de sódio (DSS)-colite induzida em ratos. Além disso, os macrófagos foram derivados polarizadas ex vivo e transferidos para ratinhos por injecção intravenosa. Uma advertência a esta abordagem é que os lipossomas contendo clodronato esgotar todos os fagócitos profissionais, incluindo ambas as células dendríticas e macrófagos de modo a assegurar o efeito observado por depleção de macrófagos é específico a reconstituição, ofenótipo f por transferência adoptiva de macrófagos é necessário. Depleção de macrófagos sistémica em ratinhos pode também ser conseguida por ratinhos retrocruzamentos sobre um fundo CD11b-DTR, que é um excelente abordagem complementar. A vantagem da depleção de clodronato contendo mediada por lipossomas é que ele não exige que o tempo ea despesa envolvidos em ratinhos retrocruzamentos e pode ser utilizado em ratinhos, independentemente do fundo dos ratinhos (C57BL / 6, BALB / c, ou fundo misto ).
Protocol
1. Os macrófagos destroem Usando clodronato contendo lipossomas
- Os lipossomas são armazenados a 4 ° C. Duas horas antes da injecção, remover o clodronato contendo lipossomas, PBS contendo lipossomas, ou PBS estéril (injecção de controlo) a partir do refrigerador para permitir que eles se adapte à temperatura ambiente (18 ° C).
- Inverter os tubos contendo lipossomas 8-10 vezes para assegurar uma distribuição uniforme antes de carregar 200 ul para uma seringa de 1 ml. Anexar uma agulha de calibre 26 para o topo da seringa.
- Usando a sua mão esquerda nuca, o mouse logo abaixo das orelhas que prendem a pele o suficiente para imobilizar a sua cabeça e membros.
- Inclinar a rato pelo que a sua cabeça é ligeiramente para o chão de modo órgãos internos afastar-se do local de injecção, que está localizado no quadrante inferior direito do abdómen.
- Rolar a seringa entre as palmas das mãos e invertê-lo 6 vezes para distribuir uniformemente a solução de lipossomas antes da injeção. <li> Inserir a agulha no lado inferior direito do abdômen do mouse em um ângulo de 30-40. Injectar 200 uL de solução de lipossoma ou PBS.
- Durante um modelo de inflamação induzida, como DSS induzida colite, injectar ratinhos 4 dias antes do início da inflamação experimental para assegurar a depleção de macrófagos residentes e cada 2 dias, durante o protocolo de esgotar novos macrófagos infiltrantes.
- No final da experiência, juntamente com planeadas análises experimentais, remover os tecidos a partir do local de interesse e fixar com paraformaldeído para confirmar a depleção de macrófagos por coloração imuno-histoquímica.
2. Derivação de macrófagos polarizadas de aspirados de medula óssea
- A medula óssea de ratinhos entre 8 e 12 semanas de idade fornece o maior rendimento de osso derivadas de medula macrófagos. Euthanize o mouse, coloque-o em suas costas, e fechar as suas patas, esticando seus membros, tanto quanto possível.
- Trabalhando em um estéril hood, remova o fémur ea tíbia, cortando tanto músculo como possível.
- Lave medula de ossos utilizando IMDM com FCS 10% carregado para uma seringa de 5 ml equipado com uma agulha de calibre 26.
- Diluir aspirados de medula óssea para 40 ml em IMDM com FCS 10%, as células lugar em um frasco de cultura de 75 centímetros 2 de tecido, e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 horas. Este passo remove aderentes células mesenquimais ou macrófagos maduros a partir de progenitores hematopoiéticos.
- Sobrenadante de cultura contendo transferência não-aderentes progenitores a um cónico de 50 ml tubo Falcon e centrifugar durante 5 min a 1200 rpm.
- Ressuspender o sedimento de células em 5 ml IMDM, FCS 10% e contar as células nucleadas, diluindo suspensão de células em 1 20 em ácido acético. Este procedimento lisa todas as células, incluindo células vermelhas do sangue e os núcleos restante pode ser contadas num hemocitómetro.
- Ressuspender as células a uma concentração de 0,5 x 10 6 células / ml em meio completo; IMDM, FCS 10%, 150 uM monotioglicerol (MTG), e 10 ng / ml de MCSF, GM-CSF, ou IL-3. MCSF macrófagos derivados de macrófagos activados são classicamente enquanto os macrófagos GM-CSF ou IL-3-derivados são alternativamente activados.
- Substituir médio em dias 4, fiação para baixo as células não aderentes e devolvê-las para o balão, e no dia 7, descartando as células não aderentes.
- Além disso, IFNy (10 ng / ml) ou IL-4 (10 ng / ml) podem ser adicionados para frascos contendo MCSF células derivadas ao dia 7 de macrófagos inclinar para um. Classicamente activado ou um fenótipo alternativamente activados, respectivamente Incubar as células durante 3 dias.
- No dia 10, meios de comunicação e remover levantar células fora do balão de cultura de tecidos utilizando tampão de dissociação celular (Gibco-BRL). O local de 5 ml de tampão em células durante 5 min à temperatura ambiente (18 ° C) e, em seguida, bater a parede lateral do balão com o calcanhar da palma da mão vezes firmemente vários. Assegurar que as células têm levantado para fora do frasco através da análise do balão sob umamicroscópio. Pipetar ressuspensas células em uma cónico de 15 ml tubo Falcon e lavar o frasco com um adicional de 10 ml de IMDM, 10% de FBS. Piscina e girar as células por 5 min a 300 × g.
- Contar as células viáveis utilizando um hemocitómetro e ressuspender a uma concentração de 10 7 células / ml em PBS estéril pH 7,4. Os macrófagos estão prontos para injeção em ratos.
- Reserve 1,0 × 10 6 macrófagos para a avaliação do fenótipo de macrófagos. Macrófagos activados Classicamente estimuladas com níveis elevados de lipopolissacarídeo secretam óxido nítrico e os níveis de IL-12p70 e baixos de IL-10 em comparação com os macrófagos alternativamente activados. Macrófagos alternativamente activados expressam constitutivamente YM1 e arginase I (Argi), que pode ser detectado por inmunotransferência.
3. Tranferring Macrófagos em Ratos
- Ressuspender macrófagos em PBS estéril a uma concentração de 10 7 células / ml. Isto permite a um eminjecção venosa de 10 6 macrófagos em um volume total de 100 uL, que é um volume que pode ser segura e confortavelmente injectada em ratinhos pela veia da cauda.
- Ratinhos quente usando uma almofada de aquecimento ou colo de calor durante 5-10 min para dilatar a veia da cauda. Monitore o mouse em todos os momentos de sinais de hipertermia.
- Transferir o rato para um dispositivo de retenção que permite o acesso para as veias da cauda.
- Rodar a cauda 90 ° de modo que a veia é voltada para cima. Veias corre lateralmente para baixo ambos os lados da cauda e, ou veia pode ser usado.
- Limpar o local de injecção com uma compressa com álcool e injectar lentamente 100 ul (10 6 macrófagos) usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 26 ou 28. Inserir a agulha com o lado voltado para cima bisel e com um ângulo ligeiro, quase paralelamente à veia.
- Se a agulha é inserida corretamente nenhuma resistência deve ser sentida e da veia deve ficar claro após a injeção. Se a agulha não se encontra naveia, a cauda vai bojo. Se isso acontecer, remover a agulha e tente novamente proximal para a última tentativa ou na veia outro. Uma nova agulha deve ser utilizada para cada injecção como a cauda é resistente e as agulhas se tornar opaca rapidamente durante a injecção veia da cauda.
- Após a injecção, retire a agulha, aplique uma leve pressão ao local da injeção até o sangramento parar, e monitorar o mouse para um 5min adicional para garantir que o sangramento parou.
- Repita injecções de macrófagos cada 4 dias para assegurar um fornecimento contínuo de macrófagos polarizadas durante o procedimento experimental.
- No final da experiência, juntamente com análises experimentais, remover os tecidos a partir do local de interesse e fixar com paraformaldeído ou de formalina para confirmar a entrega eficaz de macrófagos polarizados por coloração imuno-histoquímica.
4. Os resultados representativos
O número e fenótipo das macrop residentehages em qualquer dado tecido depende do tecido a ser examinado e irá alterar durante a infecção ou inflamação. Do mesmo modo, a capacidade do clodronato lipossomas contendo a esgotar macrófagos de um tecido vai depender da via de administração e entrega eficaz para o tecido alvo. Injecção intraperitoneal de resultados clodronato contendo lipossomas em uma diminuição no F4/80 + macrófagos no cólon do rato durante DSS induzida colite evidente por coloração imuno-histoquímica para o marcador de macrófagos, F4/80 (Figura 1A). Coloração histológica também pode ser utilizado para determinar diferenças quantitativas em número de macrófagos e fenótipo em secções de tecido. A Figura 1B mostra que uma média de 55% de macrófagos é esgotada por clodronato lipossomas contendo comparação com nenhuma depleção detectada em dois pontos de rato quando os ratinhos são injectados com PBS sozinho como um controlo de injecção. Cada valor é determinado pela contagem de F4/80 e Argi manchaed células positivas em cortes de tecido de série dos 6 camundongos com 3 pontos, em 3 seções por rato com a contagem que está sendo executada por dois indivíduos cegos para a condição experimental. Estes resultados demonstram que injecções intraperitoneais de lipossomas clodronato empobrecem macrófagos de cólon em ratinhos.
Derivação de macrófagos da medula óssea na presença de factores de crescimento diferentes rendimentos macrófagos que são classicamente activados (MCSF-derivado ou MCSF-derivada e tratado com IFN-y) ou alternativamente activados (GM-CSF ou IL-3-derivada ou MCSF-derivada e tratados com IL-4). Lavagem da medula óssea a partir de 2 fémures e tíbias 2 a partir de um rato 8 semanas de idade normalmente produz 6 × 10 7 células nucleadas por rato e os rendimentos de 8 × 10 6 MCSF-macrófagos derivados de 10 × 10 6 GM-CSF-macrófagos derivados, ou 12 × 10 6 IL-3-macrófagos derivados. A Figura 2A mostra o nitrito eo rácio IL-12p70/IL-10 em macrófagos supernatants tratado com lipopolissacarídeo durante 24 horas Figura 2B mostra uma análise de mancha ocidental típica de 0,5 x 10 6 MCSF macrófagos de + / -. IL-4 condições de derivação sondadas com anticorpos para marcadores de macrófagos alternativamente activados, Argi e YM1, ou com GAPDH como um carregamento de controle. Estes dados demonstram que derivadas da medula óssea macrófagos pode ser inclinado para um fenótipo polarizada durante derivação.
Transferência eficaz de ex vivo macrófagos derivados polarizados para um tecido é dependente da via de administração eo acesso ao tecido. Durante DSS induzida colite, macrófagos injectado por via intravenosa viajar para o local da inflamação e macrófagos alternativamente activados reduzir a gravidade da doença. Figura 3A mostra o número total de macrófagos e do número de macrófagos Argi + (alternativamente activados) contados em secções histológicas de ratinhos injectados com polarizada medula ósseaDerivado de macrófagos. O impacto da transferência de macrófagos polarizados para o cólon durante DSS induzida colite é mostrado pelo índice de actividade da doença, uma pontuação de aditivo com base na perda de peso, sangramento rectal, e consistência das fezes diminuiu (Figura 3B). Estes resultados demonstram que ex vivo derivado, macrófagos adotivamente transferidos podem tráfego para o cólon e inflamação induzida por impacto. Macrófagos M1 não impactar inflamação enquanto os macrófagos M2 reduzir significativamente o índice de atividade da doença.
Figura 1. Clodronato contendo lipossomas eficazmente empobrecem F4/80 + e F480 + + Argi células em dois pontos de rato in vivo. Uma geração F2 de ratinhos do tipo selvagem em um C57BL misto / 6 × fundo 129Sv foram dadas DSS 5% durante 7 dias e IP injectado com PBS (controlo) ou clodronato lipossomas contendo (clodronato) 4 dias antes da DSS tratamentoe nos dias 0, 2, 4, e 6, durante o tratamento DSS. (A) Colons foram removidos, fixados, e as secções foram coradas por imuno-histoquímica para macrófagos maduros (F4/80) eo marcador de macrófagos M2, Argi. (B) A determinação quantitativa de F4/80 + e Argi + de macrófagos. Células positivamente coradas foram contados por dois indivíduos cegos a condição experimental em uma ampliação de 40 × em 6 campos de 3 seções / mouse e de 6 ratos / grupo. * P <0,01.
Figura 2. MCSF macrófagos derivados de expressar um fenótipo classicamente activado e MCSF macrófagos derivados de tratados com IL-4 expressar um fenótipo de macrófagos alternativamente activados. (A) Em conformidade com um fenótipo classicamente activado, MCSF macrófagos derivados de produzir níveis mais elevados de óxido nítrico em resposta a lipopolissacárido e pode ser medido pelo ensaio de Griess, que detecta o seu metabolito jusante nitrito,. Eles alsó produzir uma maior proporção IL-12p70/IL-10, que pode ser medido por ELISA. * P <0,01 para n = 3. (B) Em conformidade com um fenótipo alternativamente activados, MCSF macrófagos derivados de tratados com IL-4 constitutivamente expresso YM1 e Argi, que pode ser detectado por imunotransferência Western. Os dados são representativos de 3 experiências independentes com resultados semelhantes.
Figura 3. Injectado por via intravenosa, ex-vivo derivado alternativamente activados tráfego macrófagos para o cólon e reduzir a inflamação intestinal. Uma geração F2 de ratos selvagens em um misto C57BL / 6 × 129Sv fundo foram dadas 5 DSS% na água de beber durante seis dias. Macrófagos M1 e M2 foram injetados IV nos dias 0 e 4 durante o tratamento DSS. (A) Colons foram removidos, fixados, e as secções foram coradas por imuno-histoquímica para macrófagos maduros (F4/80) e um marcador de macrófagos M2 (Argi).A determinação quantitativa dos macrófagos para ratinhos de controlo de PBS injectados (C), ratinhos injectados com macrófagos M1 (+ M1) e ratinhos injectados com macrófagos M2 (+ M2) foram realizadas por contagem de células coradas positivamente a uma ampliação de 40 × em 6 campos a partir de 3 secções / ratinho ea partir de 6 ratinhos / grupo. Contagem foi realizada por dois indivíduos cegos para a condição experimental. (B) A atividade da doença foi monitorada e marcou diário durante o tratamento e é uma pontuação aditivo com base na perda de peso, sangramento retal, e consistência das fezes diminuiu. * P <0,05 para n = 6 ratos em 2 experimentos independentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os macrófagos são células fagocíticas que desempenham um papel importante no sistema imune. Eles são responsáveis por iniciar a resposta imune inata e direcionar a resposta imune adquirida. Tipicamente, os macrófagos activados classicamente são activados por IFNy ou LPS e são responsáveis pela eliminação de patógenos e montar uma resposta inflamatória 1. Inversamente, os macrófagos alternativamente activados são activados por IL-4 ou IL-13 e desempenhar um papel na detritos de limpeza e remodelação do tecido durante a resolução da inflamação 1. Macrófagos especializados no intestino manter a sua actividade bactericida, mas não montar um 2 resposta pró-inflamatória. Esta tolerância à flora benéfica e de antígenos de alimentos permite a liberação de material que viole a barreira epitelial sem dar início a uma resposta inadequada e potencialmente patológico imune 3. Função dos macrófagos aberrante do cólon pode contribuirpara condições patológicas, incluindo doenças inflamatórias intestinais, síndrome do intestino irritável e câncer colorretal 3-5. Fenótipo de macrófagos é dependente do microambiente local, de modo que define o seu papel na saúde ou doença pode ser um desafio. O protocolo descrito aqui permite a depleção de macrófagos a partir do complexo ambiente in vivo. Além disso, para examinar o papel do fenótipo de macrófagos in situ, fenotipicamente definidos macrófagos polarizados podem ser derivados ex vivo a partir de aspirados de medula óssea e adotivamente transferido para ratinhos, com ou sem depleção antes de macrófagos.
O clodronato lipossomas contendo promover "suicídio" de macrófagos e têm sido utilizados para esgotar macrófagos em uma variedade de tecidos 6. Macrófagos fagocitam clodronato contendo lipossomas, que são subsequentemente degradada por fosfolipases lisossomais libertando o clodronato na célula e indução de apoptose 12 12. Os lipossomas deverão ser distribuídos uniformemente em solução antes de carregar a seringa e antes da injecção no rato, independentemente da via de administração ou tecido alvo. PBS injecções e injecção de PBS contendo lipossomas são necessários controla quando a esgotar macrófagos in vivo com o clodronato lipossomas contendo 7. PBS contendo lipossomas parece ser um melhor controle do que injecções de PBS sozinho. No entanto, é importante notar que, embora alguns relatórios têm utilizado com sucesso PBS contendo lipossomas como um controlo; Nós, e outros, relataram que o PBS contendo lipossomas podem esgotar macrófagos em algumas condições experimentais 8, 9. Além disso, os lipossomas têm sido relatados por si só para inibir a fagocitose temporariamente 10. Depleção de macrófagos por PBS contendo lipossomas pode ser dependente pcapacidade hagocytic e podem diferir de acordo com a estirpe de ratinhos, de fundo genético, o tecido, e / ou condição experimental. A utilização de PBS contendo lipossomas como um controlo eo seu efeito na depleção de macrófagos para uma aplicação específica deve ser determinada experimentalmente. Portanto, recomendamos que os lipossomas tanto PBS e PBS contendo ser usado como controle de injeção durante as experiências iniciais.
Uma consideração importante na concepção de experiências de depleção de macrófagos é a via de administração do clodronato contendo lipossomas. Conseguimos alvo macrófagos do cólon em ratos utilizando injeção intraperitoneal 8. Outros usaram administração retal ou injeções intravenosas 9, 11. Administração intra-rectal e intraperitoneal têm sido relatados tanto para esgotar aproximadamente 50% dos macrófagos do cólon enquanto que a injecção intravenosa tem sido relatado para esgotar até 90% de macrófagos da lâminaprópria 8, 9, 11. Optou-se por efectuar injecções intraperitoneais para entregar clodronato lipossomas contendo devido à simplicidade da técnica e, porque os estudos semelhantes aos nossos têm utilizado com sucesso esta via de administração 7. No entanto, se os níveis mais elevados de depleção no cólon são necessários para uma experiência, injecção intravenosa pode melhorar depleção.
Via de administração é uma consideração importante para a depleção de macrófagos em diferentes tecidos. Injecções intraperitoneais têm sido utilizados para esgotar peritoneal, omento, parathymic nó de linfa, fígado, baço e macrófagos 12. Injecções intravenosas têm sido utilizados para esgotar macrófagos no fígado, baço e medula óssea 12. Administração intraventricular de clodronato contendo lipossomas tem sido utilizado para esgotar macrófagos perivasculares e meníngea a partir do cerebelo, cérebro, medula espinal e 12. Intratraqueale administração intranasal de clodronato contendo lipossomas têm sido utilizados para esgotar macrófagos alveolares. Finalmente, a administração local tem sido usado com sucesso para esgotar macrófagos testiculares e vítrea 12, 13. A eficácia da depleção de macrófagos em um tecido alvo deve ser determinada experimentalmente e validado pela coloração de tecidos por imuno-histoquímica (Figura 1A) ou por citometria de fluxo. Em alguns casos pode ser necessário para aumentar a taxa de depleção de macrófagos. As variáveis que podem ser optimizadas para aumentar a depleção incluem mudança da via de administração clodronato contendo lipossomas, a quantidade de clodronato contendo lipossomas por injecção, e / ou a frequência da injecção.
Uma consideração importante na interpretação dos dados, quando destroem os macrófagos com clodronato contendo lipossomas é que todos os fagócitos profissionais estão esgotados, incluindo as células dendríticas. Para assegurar que umefeito biológico é macrófago-dependente, as experiências de reconstituição complementares são necessários. Derivando macrófagos de aspirados de medula óssea é uma ferramenta útil para experimentos de reconstituição bem como a investigação da função dos macrófagos investigar. Temos utilizado com sucesso este protocolo para estudos in vitro explorando o papel da via de sinalização PI3K na activação de macrófagos alternativa 14. Há duas etapas críticas no processo de derivação. Em primeiro lugar, passo a depleção aderência é crucial para remover as células aderentes a partir de aspirados de medula óssea, quer contaminando as células mesenquimais ou células hematopoiéticas maduras. Em segundo lugar, o fenótipo de macrófagos deve ser confirmada antes da sua utilização em procedimentos experimentais. Uma modificação a este protocolo é que diferentes modelos genéticos podem ser usados para a derivação de macrófagos e reconstituição, permitindo investigação do papel de genes específicos em fenótipo de macrófagos e função in vitro umad in vivo. Para os experimentos de reconstituição, a injeção intravenosa é o modo mais comum de entrega de macrófagos, mas tanto a quantidade de células e freqüência de injeção pode ser otimizado para um estudo específico. Retro-orbital injecções podem ser utilizados para a reconstituição e devem proporcionar resultados semelhantes. De nota, os macrófagos são recrutadas para locais de inflamação e seu fenótipo pode ser alterado em resposta a sinais provenientes seu microambiente. Finalmente, a transferência adoptiva pode ser suficiente para proporcionar macrófagos para um tecido alvo mas antes a depleção de macrófagos residentes de tecido pode ser necessário para permitir a criação de macrófagos adotivamente transferidos.
O protocolo apresentado aqui, tem um número de vantagens sobre os métodos existentes. Um método alternativo para esgotar macrófagos é usando o condicional ablação camundongo transgênico, CD11b-DTR 15. Neste rato, o receptor humano da difteria toxina (DT) é expresso sob o controlo of o promotor CD11b macrófago-específica. Isto confere sensibilidade toxina e injecção DT causa depleção de macrófagos 15. Embora a percentagem de depleção de macrófagos é maior, neste modelo, o clodronato lipossomas contendo apresenta duas vantagens importantes. O clodronato contendo injecção de lipossomas pode ser utilizado para esgotar macrófagos em qualquer estirpe de ratinhos. Os macrófagos podem ser esgotada a partir de ratos geneticamente modificados sem o tempo e os custos necessários para retrocruzamento que é necessário para usar o método de rato CD11b-DTR. Pela mesma razão, os macrófagos podem ser esgotado a partir de ratos em qualquer plano de fundo, que é uma consideração importante se o modelo a ser investigado requer um fundo original ou mistos. Do mesmo modo, as experiências de transferência adoptivas usando macrófagos derivados ex vivo a partir de uma linha de rato evita quaisquer problemas com alloreactivity.
Os protocolos aqui descritos podem ser aplicado a uma variedade de questões de pesquisa. Temos usado ªese técnicas para estudar o papel dos macrófagos na inflamação no cólon. O clodronato contendo mediada por lipossomas de depleção de macrófagos e transferência adoptiva de macrófagos pode ser usado para atingir um grande número de tecidos. Transferência adoptiva de macrófagos pode ser usado para reconstituir macrófagos empobrecido ou macrófagos directos para locais de inflamação em modelos genéticos ou induzível de inflamação. Este protocolo também fornece uma plataforma para análise de macrófagos terapêutica alvo em modelos de doença em macrófagos ou sua polarização estão associados com a patologia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi suportado por um 'Grant em Ajuda de Pesquisa "da Fundação de Crohn e Colite do Canadá para LMS, que é apoiado por uma Associação Canadense de Gastroenterologia / Canadian Association of Health Research / Crohn e da Fundação Colite do Canadá Investigator Award Nova.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
|||
References
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
