Summary
تدرس أخذ عينات لعاب للتطبيق السريرية في المستقبل، ملفقة مصاصة مثل الترشيح الفائق (LLUF) مسبار لتناسب في تجويف الفم والإنسان. أظهر تحليل لعاب مباشر من عسر الهضم بواسطة الطيف الكتلي NanoLC-LTQ قدرة تحقيقات LLUF لإزالة البروتينات الكبيرة والبروتينات وفرة عالية، وجعل المنخفضة وفيرة الببتيدات أكثر للكشف.
Abstract
على الرغم من أن الإنسان قد كشفت بروتيوم اللعاب وpeptidome 1-2 حددت مجورلي هم من تريبسيني يساعد على هضم البروتينات لعاب. تحديد peptidome السكان الأصليين من لعاب الإنسان دون هضم مسبق مع الانزيمات الخارجية يصبح من الضروري، منذ الببتيد الأصلي في لعاب الإنسان توفير قيم المحتملة لتشخيص المرض، وتوقع تطور المرض، ومراقبة فعالية العلاج. الملائمة لأخذ العينات هو خطوة حاسمة لتعزيز التعرف على الإنسان peptidome لعاب السكان الأصليين. قد الأساليب التقليدية لأخذ عينات من لعاب الإنسان التي تنطوي على الطرد المركزي لإزالة الحطام 3-4 يكون أيضا وقتا طويلا لتكون قابلة للتطبيق للاستخدام السريري. وعلاوة على ذلك، قد إزالة الأنقاض عن طريق الطرد المركزي غير قادر على تنظيف معظم مسببات الأمراض المصابة وإزالة البروتينات وفرة العالية التي غالبا ما تعيق تحديد peptidome وفرة منخفضة.
البروتين الأساليب التقليدية أن الحزب الثوري المؤسسيالاستفادة من marily الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد (2-DE) المواد الهلامية في اقتران مع جل في الهضم قادرة على تحديد البروتينات لعاب كثير 5-6. ومع ذلك، فإن هذا النهج عموما ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن الببتيدات وفرة منخفضة / البروتينات. السائلة اللوني قياس الطيف الكتلي (LC-MS) البروتيوميات القائم هو البديل الذي يمكن التعرف على البروتينات من دون فصل 2-DE قبل. على الرغم من أن هذا النهج يوفر أعلى حساسية، فإنه يحتاج عموما نموذج مسبق قبل التجزئة (7) وقبل الهضم مع التربسين، مما يجعل من الصعب للاستخدام السريري.
للالتفاف على عائق في مطياف الكتلة بسبب إعداد عينة، قمنا بتطوير تقنية تسمى الترشيح الفائق الشعرية (الجبهة المدنية المتحدة) 8-11 تحقيقات. أظهرت بيانات من مختبرنا أن تحقيقات حزب الجبهة المدنية المتحدة قادرة على التقاط البروتينات في الجسم الحي من مختلف microenvironments في الحيوانات بطريقة ديناميكية ومينيملي 8 -11. ليس هناك حاجة إلى الطرد المركزي منذ يتم إنشاء ضغط سلبي بواسطة حقنة ببساطة سحب أثناء جمع العينات. وقد حددت تحقيقات حزب الجبهة المدنية المتحدة جنبا إلى جنب مع LC-MS بنجاح البروتينات تريبسيني-هضمها 8-11. في هذه الدراسة، ورفع مستواها ونحن على تقنية الترشيح الفائق أخذ العينات عن طريق إنشاء مصاصة مثل الترشيح الفائق (LLUF) التحقيق التي يمكن أن تناسب بسهولة في التجويف الفموي الإنسان. وأظهر تحليل مباشر من قبل LC-MS بدون الهضم التربسين أن لعاب الإنسان محليا تحتوي على العديد من شظايا الببتيد المستمدة من البروتينات المختلفة. أخذ عينات لعاب مع تحقيقات LLUF تجنب الطرد المركزي ولكن على نحو فعال إزالة العديد من البروتينات وفرة كبيرة وعالية. نتائجنا الطيفي الشامل يتضح أن العديد من الببتيدات وفرة منخفضة أصبح اكتشافها بعد تصفية أكبر من البروتينات مع تحقيقات LLUF. وكان الكشف عن انخفاض الببتيد اللعاب وفرة من فصل مستقل عينة متعددة الخطوة مع اللوني. لتطبيق السريرية، وتحقيقات LLUF إدماجيحتمل د مع LC-MS تستخدم في المستقبل لمراقبة تطور المرض من اللعاب.
Protocol
1. إنشاء مجسات LLUF
- تم اغلاق الأغشية polyethersulfone (2 سم 2) مع المجاذيف البولي بروبلين مثلث (جامعة كاليفورنيا في سان دييغو) بواسطة الأغشية الإلتصاق مع مادة لاصقة على حدود المجاذيف. تم استخدام غشاء polyethersulfone سالبة الشحنة ذات وزن جزيئي وقف انتاج المواد الانشطارية (MWCO) حتى 30 كيلو دالتون.
- وعلقت والبروبيلين تفلون الاثيلين المفلورة أنبوب (القطر الداخلي / القطر الخارجي، 0.35/0.50 سم) إلى الخروج من الاسطوانة مثلث مجداف البولي بروبيلين بحيث يمكن توصيلها لجنة التحقيق LLUF إلى حقنة مل 20.
- بعد تمرغ لغشاء polyethersulfone في لعاب الإنسان في طبق ثقافة (50 قطرها ملم)، تم إنشاء ضغط سلبي عن طريق سحب حقنة. قاد المحقنة مع الضغط السلبي على عملية الترشيح الفائق لأخذ عينات من اللعاب البروتينات.
- تم تعقيمها تحقيقات مع الكحول 70٪ بين عشية وضحاها قبل استخدامها. لإثبات ختم الصحيح، نحن في وضع مجسات LLUF في المحاليلنشوئها التي تحتوي على اللون الأزرق ديكستران (50 ملغ / مل) مع كتلة والجزيئية في المتوسط 2000 كيلو دالتون لمدة 2 ساعة. وأشار لعدم وجود دكستران أزرق في العينات التي تم جمعها أن عدم وجود تسرب وضعت خلال تلفيق التحقيق وأخذ العينات.
2. لعاب مجموعة
- وقد تم جمع لعاب كل من ثلاثة متطوعين أصحاء (اثنان ذكور وأنثى واحدة تتراوح أعمارهم بين 20 و 40) عدم اتخاذ أي الأدوية، مع عدم وجود علامات العلني من 6 التهاب اللثة أو تسوس الأسنان.
- بعد المضمضة بالماء، تم جمع عينات من اللعاب كله عن طريق البصق، دون تحفيز الكيميائية، إلى وعاء الثلج المبردة.
- وكان يتم تجميع جميع العينات ويحرص على الجليد أثناء عملية جمع.
- مباشرة بعد جمع، وطبقت لعاب (200 ميكرولتر) لأخذ العينات مع تحقيقات LLUF. تم إجراء أخذ العينات في غرفة 4 درجات مئوية.
- وتعرض مباشرة بروتينات اللعاب (1.0 ميكروغرام / ميكرولتر) مع أو من دون جمع مسبار LLUF إلى LC-S الشامل نانوتحليل pectrometry بدون هضم زيتية. تم تحديد تركيزات بروتين باستخدام الفحص البروتين بيو راد 12.
3. NanoLC LTQ-MS تحليل
- تم تحميلها مباشرة على عينات من اللعاب من الامم المتحدة وهضمها (5 ميكرولتر) إلى العمود فخ النظام NanoLC Eksigent من الاوتوماتيكى، وذلك باستخدام 100٪ وعازلة. (2٪ acetonitrile/0.1٪ حمض الفورميك) وكان على الخط اقترنت NanoLC مع كتلة Finnigan مطياف LTQ.
- بعد عينة التحميل وغسيل، وتبديل صمام و تم تسليم 500 الانحدار الخطي NL / دقيقة الى فخ والعمود فصل (10 سم في الطول، 100 معرف ميكرون، في منزل محملة C18 4 ميكرون Synergi). وكان الانحدار 0-50٪ B العازلة (80٪ acetonitrile/0.1٪ حمض الفورميك) في 45 دقيقة.
- تم تشغيل nanoLC-MS LTQ الصكوك في وضع البيانات التي تعتمد من قبل Xcalibur. وقد تم جمع MS / MS أطياف الأيونات 4 أقوى MS فوق كثافة من 1 × 10 5 مع استبعاد ديناميكيتمكين وطاقة التصادم التي حددت في 35٪.
- تم تشغيل كل عينة مرتين من قبل نظام MS-NanoLC LTQ. واستخدمت عينات من ثلاثة الاستعدادات منفصلة. وقد أدرجت هذه الببتيدات التي يمكن اكتشافها في ثلاث عينات منفصلة في الجدولين 1 و 2 إضافي. وقد تجلى ممثل أطياف MS-NanoLC LTQ في الشكل 3.
4. تحليل البيانات والبروتين البحث في قاعدة البيانات
- تم تحويل كل ملف RAW إلى ملف mzXML باستخدام Readw.exe.
- وكان ملف mzXML مساهمة في نظام SEQUEST 2 الساحر وتفتيش ضد قاعدة بيانات البشرية الناتجة عن المركز الوطني المطابق لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) قاعدة بيانات باستخدام بروتين غير إنزيم التحديد. تم تعيين التسامح كتلة أيون السلائف بنحو 1.5 دا. وأضيف الكتلة الجزيئية من 16 دا إلى الميثيونين للبحث الفرق لحساب أكسدة.
- بعد البحث SEQUEST، وكانت النتائج التي تمت تصفيتها تلقائيا، والتحقق من صحة 1د المعروضة بواسطة PeptideProphet وProteinProphet [معهد بيولوجيا الأنظمة (ISB)]. PeptideProphet تقديرات شاملة احتمال (P) درجة أن مهمة الببتيد هو "الصحيح" مقابل "غير صحيحة" على أسس من عشرات SEQUEST انها (Xcorr، ΔCn، SP، RSP) ومعلومات إضافية من كل تسلسل الببتيد التي تم تحديدها. ProteinProphet تحسب درجة احتمال 0-1 لكل من البروتين على أساس من الببتيدات المخصصة لMS / MS الأطياف.
- للحد من التعرف ايجابية كاذبة استخدمنا معايير التصفية الصارمة. أولا، يتم تعيين درجة ف قطع الحد الأدنى بنسبة 0.8 في أي الببتيد المقبول أن أؤكد خطأ منخفضة جدا (أقل من 3٪)، وحساسية جيدة إلى حد معقول. ثانيا، يجب على جميع الببتيدات مع درجة> P 0،8 تحتوى على نسبة عالية عبر الارتباط (Xcorr) العشرات في نفس الوقت: 1.9، 2.2، و 3.0 ل+1، +2، وتهمة +3.
5. إزالة البكتيريا عن طريق الفم مع تحقيقات LLUF
- لتحديد قدرة تحقيقات LLUF لإزالةتم نشر البكتيريا عن طريق الفم واللعاب قبل وبعد LLUF مسبار جمع (المادة 3) على لوحات أجار للكشف عن البكتيريا.
- وقد نمت البكتيريا الهوائية على المضادات الحيوية خالية من لوريا، Bertani لوحة أجار (LB) في 37 درجة مئوية ليوم واحد.
- وقد نمت البكتيريا اللاهوائية على صفيحة البروسيلا المضادات الحيوية خالية أجار مرق (BD، سباركس، MD) في الظروف اللاهوائية باستخدام الغاز الباكستانية دينار بحريني (علوم الأحياء، سان خوسيه، كاليفورنيا) في 37 درجة مئوية ليوم واحد.
6. ممثل النتائج
1. تلفيق تحقيقات LLUF واللعاب أخذ العينات في بيئة عن طريق الفم مقلدة
إذا لا يمكن أن يؤديها لعاب أخذ العينات كما مص مصاصة، فإن الإجراء تجنب تدهور اللعاب يشتم في أجهزة جمع 13-14. الأهم من ذلك، سيصبح من الممكن أيضا لمراقبة المرضى بشكل حيوي ومحليا من تسوس الأسنان عن طريق الفم. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان من الممكن تبسيط إعداد نموذج باستخدام اللعاب، فإن الأطباء facil بسهولةitate الإجراء إلى تسريع قرارهم بشأن عملية السريرية اللاحقة. قياس الطيف الكتلي هو واحد من أكثر التقنيات الحساسة للكشف عن البروتينات، وحتى تسلسل في فترة قصيرة جدا من الزمن. ومع ذلك، أعاقت إجراءات معقدة لإعداد العينات باستخدام هذه التقنية في العيادة. وعلاوة على ذلك، فمن المعروف أن بروتينات أعلى وفرة أو البروتينات مع أوزان جزيئية عالية في العينات السريرية (على سبيل المثال الأميليز في اللعاب) البروتينات قناع وفرة منخفضة في التحليل الطيفي الشامل 15-16. للتغلب على العقبات المذكورة أعلاه، قمنا بتطوير جهاز الترشيح الفائق مصاصة مثل اسمه تحقيقات LLUF (الشكل 1). وغشاء polyethersulfone سالبة مع MWCO في 30 كيلو دالتون (الشكل 1A، أ) تم لصقه على مجداف البولي بروبلين (الشكل 1A، ب). تم تعديل وضعه أمام لجنة التحقيق LLUF بقصد تصفية أكبر من البروتينات الموجودة في اللعاب. لمحاكاة البيئة البشرية عن طريق الفم (الشكل 1A، ز)، وكان ينقع اسفنجة (الشكل 1A، ه) في اللعاب في صحن الثقافة (الشكل 1A، و). بعد الانسحاب الكامل للمحقنة (الشكل 1A، د)، التي تمت تصفيتها لعاب تتحرك على طول أنبوب توصيل (الشكل 1A، ج) والتي تم جمعها و.
2. تحديد peptidome اللعاب الأصلية NanoLC LTQ-MS
مقارنة LC المخططات الاستشرابية، وجدنا المخططات الاستشرابية متميزة من اللعاب قبل وبعد أخذ العينات LLUF (الشكل 2)، مشيرا إلى أن هناك تركيبات مختلفة من البروتين في اللعاب بعد أخذ العينات LLUF. لتحديد مكونات البروتين، واستخدمنا NanoLC-LTQ قياس الطيف الكتلي ما هو معروف لتكون قادرة على الببتيدات تسلسل فورا من خليط من البروتين متعددة. الأهم من ذلك، لتبسيط إعداد عينة لأغراض سريرية، وطبق لعاب كامل بدون مادة كيميائية أو الهضم الأنزيمي للتحليل MS-NanoLC LTQ. بشكل غير متوقع، 131 الببتيدات نحنإعادة تحديدها في لعاب عسر الهضم (الجدول إضافي 1). هذه الببتيدات هي أجزاء مستمدة من مختلف البروتينات الغنية البرولين، الأكتين، ألفا الأميليز، ألفا غلوبين 1، بيتا غلوبين، histain 1، الكيراتين 1، الميوسين 7، البوليمرية مستقبلات المناعي، satherin، وS100A9. وقد تم تحديد ستة وعشرين الببتيدات فريدة من نوعها في اللعاب بعد تصفية مع تحقيقات LLUF (إضافي الجدول 2). هذه الببتيدات هي أجزاء مستمدة أساسا من البروتينات الغنية البرولين مختلف. وكانت الببتيدات المستمدة من البروتينات مثل مستقبلات المناعي البوليمرية (83.24 كيلو دالتون) والأميليز ألفا، لا يمكن الكشف عنها، مما يدل على قدرة تحقيقات LLUF في ازالة البروتينات أكبر وفيرة. ويتضح لطيف MS / MS من الببتيد PFIAIHAEAESKL الموافق 1 الببتيد الداخلية ألفا الأميليز في 3A الشكل. معظم يثير الاهتمام والفضول، بعد إزالة أكبر من البروتينات، وأصبح 18 من 26 الببتيدات التسلسل كشفها في اللعاب مسبار-عينات LLUF (الجدول1). وقد استمدت هذه الببتيدات 18 من البرولين الغنية البروتينات أو البروتينات النظرية التي انتهت برولين (P) - الجلوتامين (س) (-PQ) ريال سعودي،، SP-أو-PP C-3B نهاية الشكل أظهر MS / MS طيف من الببتيد PQGPPQQGGHPRPP أن تم الكشف في لعاب مسبار-عينات LLUF. ويمكن اشتقاق الببتيد من البرولين الغنية بالبروتينات HaeIII فصيلة 1 و 2 (الجدول 1).
الشكل 1. تركيبة من تحقيقات LLUF وأخذ عينات من لعاب كل من تقليد تجويف الفم الإنسان لوحة ج: (أ) polyethersulfone شبه منفذ مع MWCO من 30 كيلو دالتون، (ب) مجداف البولي بروبيلين، (ج) والبروبيلين تفلون الاثيلين المفلورة أنبوب؛ (د) حقنة 20 مل لوحة (ب): كانت غارقة اسفنجة (ه) (لسان تحاكي) في طبق ثقافة (و) التي تحتوي على لعاب الإنسان إلى خلق.مصطنعة تجويف الفم الإنسان (ز). الضغوط الناتجة السلبية الناجمة عن الانسحاب الكامل حقنة يدفع السوائل التي تم جمعها للتحرك على طول أنبوب توصيل (السهم)، ونحو خلق الفضاء (رأس السهم) في حقنة. شريط: 2.0 سم.
الشكل 2. تم ترشيح الفرق LC / MS / MS المخططات الاستشرابية من اللعاب قبل وبعد أخذ العينات LLUF. البروتينات (1.0 ميكروغرام / ميكرولتر) في اللعاب البشري كله بدون أو مع لجنة التحقيق LLUF. وتعرض مباشرة بدون هضم البروتينات تريبسيني إلى NanoLC LTQ-MS الذي كان مترافق مع نظام Eksigent LC نانو كما هو موضح في المواد وطرق. في المخططات الاستشرابية قاعدة فترة الذروة (مع الاحتفاظ مرات 44-MIM) من قبل لعاب (A) وبعد (ب) ويتضح LLUF أخذ العينات.
الشكل 3. Detecنشوئها من peptidome اللعاب بواسطة NanoLC-LTQ بروتينات اللعاب MS التسلسل. قبل (A) وبعد (B) وقد تم تحليل العينات مع تحقيقات LLUF بواسطة NanoLC LTQ-MS على النحو المبين في الإجراءات التجريبية. وقد أثبتت peptidome اللعاب المستمدة من لعاب الإنسان الطبيعية دون هضم زيتية في جداول إضافي 1 و 2. تم الكشف على وجه الحصر الببتيد (PFIAIHAEAESKL) مشتقة من ألفا الأميليز في عينة لعاب من دون جمع مع تحقيقات LLUF (A)، مما يوضح أن القدرة على تحقيقات LLUF في إزالة البروتينات الكبيرة. الببتيدات مع العديد-PQ، SR-كانت،-SP-PP أو C-مصطلحات فقط في عينات بعد تحقيقات LLUF الترشيح الفائق. وعرضت واحدة (PQGPPQQGGHPRPP) من الببتيدات المستمدة من البروتينات المختلفة الغنية البرولين (B). MS / MS أكد الأطياف مع "ذ" مميزة والأيونات "ب" سلسلة من هوية كل من الببتيدات.
<قوي> الشكل 4. إزالة البكتيريا عن طريق الفم خلال استخدام مجسات LLUF. تم انشاء وحدة التحقيق LLUF كما هو موضح في المواد والأساليب. كان وضعه التحقيق في لعاب الإنسان داخل بيئة عن طريق الفم يحتذى (الشكل 1). تم سحب الحقنة في نهاية التحقيق LLUF لخلق الضغط السلبي الذي قاد عملية الترشيح الفائق لأخذ عينات من اللعاب. خلال أخذ العينات، وعبرت لعاب كلها بشكل انتقائي من خلال الغشاء polyethersulfone والمتراكمة داخل حقنة. خدم لعاب كامل قبل أخذ العينات مع التحقيق الذي تجريه LLUF كمجموعة تحكم. انتشر لعاب (10 ميكرولتر) قبل وبعد أخذ العينات مسبار LLUF على لوحات أجار للكشف عن بكتيريا لوحة ج: اللعاب مع (+ LLUF) وبدون انتشر (+ LLUF) أخذ العينات مسبار LLUF جنبا إلى جنب على خالية من المضادات الحيوية LB لوحة أجار عند 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد ب لوحة: تم نشر اللعاب مع وبدون أخذ العينات مسبار LLUF على صفيحة البروسيلا المضادات الحيوية خالية أجار مرقفي الظروف اللاهوائية باستخدام الغاز الباكستانية دينار بحريني (علوم الأحياء، سان خوسيه، كاليفورنيا) في 37 درجة مئوية ليوم واحد. لم لا تنمو البكتيريا على لوحات أجار نشر التحقيق مع اللعاب، عينات LLUF، مما يدل على قدرة تحقيقات LLCF في القضاء الهوائية فضلا عن البكتيريا عن طريق الفم اللاهوائية. شريط: 1.0 سم.
| الببتيد تسلسل / المقاسة الشامل الببتيد | انضمام عدد | اسم | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485.3 | غي | 41349484 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 1 2 السلائف شكل الإسوي |
| غي | 41349482 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 1 1 شكل الإسوي السلائف | ||
| غي | 60301553 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576.9 | غي | 4826944 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 2 |
| غي | 9945310 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 1 | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126.2 | غي | 37537692 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 4 السلائف |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028.3 | غي | 113423660 | توقع: البروتين افتراضية |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077.8 | غي | 113423262 | توقع: افتراضية شكل الإسوي بروتين 5 |
| غي | 41349482 | البرولين الغنية بالبروتينات BSTNI فصيلة شكل الإسوي 1 1 السلائف | ||
| غي | 60301553 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 2 | ||
| غي | 113423663 | توقع: البروتين افتراضية | ||
| غي | 41349484 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 1 2 السلائف شكل الإسوي | ||
| غي | 41349486 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين شكل الإسوي 1 3 السلائف | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918.5 | غي | 9945310 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 1 |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131.3 | غي | 113423660 | توقع: البروتين افتراضية |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | غي | 113423663 | توقع: البروتين افتراضية |
| غي | 41349482 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 1 1 شكل الإسوي السلائف | ||
| غي | 113423262 | توقع: افتراضية شكل الإسوي بروتين 5 | ||
| غي | 60301553 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866.6 | غي | 4826944 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713.8 | غي | 9945310 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 1 |
| غي | 4826944 البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 2 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083.1 | غي | 9945310 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 1 |
| غي | 4826944 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512.6 | غي | 4826944 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 2 |
| غي | 9945310 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 1 | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720.2 | غي | 113423262 | توقع: افتراضية شكل الإسوي بروتين 5 |
| غي | 113423663 | توقع: HYpothetical بروتين | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450.1 | غي | 9945310 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 1 |
| غي | 4826944 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791.1 | غي | 4826944 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 2 |
| غي | 9945310 | البرولين الغنية فصيلة HaeIII بروتين 1 | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186.9 | غي | 113423262 | توقع: افتراضية شكل الإسوي بروتين 5 |
| غي | 41349482 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 1 1 شكل الإسوي السلائف | ||
| غي | 60301553 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 2 | ||
| غي | 113423663 | توقع: البروتين افتراضية | ||
| غي | 41349484 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 1 2 السلائف شكل الإسوي | ||
| غي | 41349486 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين شكل الإسوي 1 3 السلائف | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720.3 | غي | 113423663 | توقع: البروتين افتراضية |
| غي | 41349482 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 1 1 شكل الإسوي السلائف | ||
| غي | 113423262 | توقع: افتراضية شكل الإسوي بروتين 5 | ||
| غي | 60301553 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870.9 | غي | 37537692 | البرولين الغنية فصيلة BstNI بروتين 4 السلائف |
وكان الجدول 1. هضميدات للكشف على وجه الحصر في LLUF، جمع عينات.
الجدول التكميلي 1. انقر هنا لعرض الجدول التكميلي 1 .
الجدول التكميلي 2. انقر هنا لعرض الجدول التكميلي 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد وجدنا أن وجود العديد من شظايا الببتيد في لعاب الإنسان عسر الهضم. هذه الشظايا الببتيد هي مشتقات من أشكال مختلفة من البرولين الغنية والبروتينات، والأكتين، ألفا الأميليز، ألفا غلوبين 1، بيتا غلوبين، histain 1، الكيراتين 1، الميوسين 7، البوليمرية مستقبلات المناعي، satherin، S100A9. يمكن أن يكون هناك العديد من العوامل التي تسهم في إنتاج الببتيدات مع مواقع انشقاق غير محدد. على سبيل المثال، قد يكون بعض شظايا الببتيد تكون موجودة بشكل طبيعي في اللعاب البشري كله. وقد تم تحديد العديد من الببتيدات مع PQ-C-مصطلحات (الجدول رقم 1 وجداول إضافي 1 و 2). ويمكن تصنيف البرولين الغنية البروتينات والبروتينات، والحمضية الأساسية أو الغليكوزيلاتي ويتم ترميز لمدة ستة جينات عنقودية في منطقة واحدة 17. أكثر من ثلاثين مختلفة نتيجة البروتينات البرولين الغنية من اختلاف الأليلي، الفرق الربط الجيش الملكي النيبالي، وتجهيز بروتين، ومرحلة ما بعد التعديلات متعدية 17. بعد إفراز، والحمضية الغنية البرولين بروتوترد بسرعة eins على أسطح الأسنان وتدهور محتمل في الببتيد المناعة الفطرية بواسطة التحلل البروتيني لوحة الأسنان 18-19. كل من الجراثيم سلبية وإيجابية غرام تعبير عن مجموعة متنوعة من glycosidases والبروتياز 18. فقد أفيد أن الحمضية البرولين الغنية البروتينات يمكن أن يتحلل إلى الببتيدات الفطرية، مثل الحصانة المحتملة من قبل بكتيريا الفم والأنواع الشعية 18. والجلوتامين (GLN) - جليكاين (الغليسين) الانقسام أمر بالغ الأهمية من الناحية البيولوجية فيما يتعلق بتدهور البكتيرية من البروتينات اللعابية البرولين الحمضية الغنية والإنتاج من نقطة وصول-C البكتيريا ملزمة PQ 18، 20-22. الربط من-PQ وأكد مصطلحات من البرولين الغنية البروتينات للبكتيريا عن طريق التجربة في المختبر باستخدام الاصطناعية RGRPQ خماسي الببتيد 18. في اتفاق مع البيانات المتوفرة لدينا، وكانت مجموعة SJ فيشر قادرا على تحديد العديد من الببتيدات مع PQ-C-تيرميني في لعاب الإنسان غير مهضوم النكفية 23،قد يوحي الببتيدات مع عدة-C-PQ مصطلحات محليا موجودة في اللعاب البشري كله. لعاب الإنسان يحتوي على الببتيد متعددة مع PQ-C-مصطلحات التي قد تعمل على حصانة فطرية، مثل الببتيدات 18 و 19. عندما البكتيريا عن طريق الفم موجودة، قد البرولين الغنية البروتينات كسر فورا وصولا الى شظايا مع مختلف-C-PQ مصطلحات من أجل قتل البكتيريا بكفاءة.
سبب آخر لشظايا الببتيد الموجودة في لعاب عسر الهضم هي أن بعض البروتياز الذاتية موجودة في لعاب كل قد تبقى نشطة أثناء إعداد عينة 24-25. والانقسام الذي يحدث في هذه البروتينات من البروتياز المحلية في تجويف الفم واصل على الأرجح قبل تحليل الطيف الكتلي. على سبيل المثال، يمكن أن المشقوق الميوسين بواسطة الأنزيم البروتيني اللعابية وصولا الى أصغر شكل يمكن أن يكون أكثر كفاءة في إزالة البكتيريا 26. ومن الممكن أيضا أن البروتياز من البكتيريا عن طريق الفم قد يلتصق البروتينات عن طريق الفم قبل أو بعد collectio اللعابن. وقد تم توثيق أنه يمكن المفروم بروتينات اللعاب عدة البروتياز من بكتيريا الفم والشعية الأنواع 27-29.
غشاء شبه منفذ هو عنصر أساسي من تحقيقات LLUF. الغشاء هو ضروري لازالة انتقائية أكبر من المواد بما في ذلك البروتينات والبكتيريا عن طريق الفم والحطام. LLUF يعمل كحاجز انتقائية تسمح بمرور مكونات معينة وترفض العناصر الأخرى داخل تجويف شفوي الاصطناعي. غشاء شبه منفذ يسمح جزيء صغير بالمرور عبر غشاء مع استبعاد الجزيئات. وأظهرت بيانات حديثة من مختبرنا أن تحقيقات LLUF يمكن إزالة بكتيريا الفم على نحو فعال على حد سواء الهوائية واللاهوائية (الشكل 4). وانتشرت عينات من اللعاب قبل وبعد جمع مع تحقيقات LLUF على المضادات الحيوية خالية من لوحات أجار والمحتضنة في ظل الظروف الهوائية واللاهوائية. لم لا تنمو البكتيريا عندما تم نشر لوحات أجار مع LLUF التحقيق،عينات من اللعاب، مما يدل على قدرة تحقيقات LLUF في إزالة بكتيريا الفم الهوائية واللاهوائية. بحثنا كل الأطياف مع قاعدة بيانات الإنسان التي لم تشتمل على قواعد البيانات من البروتين عن طريق الفم من الميكروبات الإنسان. سوف تحديد بروتيوم / peptidome من الميكروبات عن طريق الفم يصبح من الممكن إذا كان يمكن إنشاء قاعدة بيانات شاملة مع كل بروتين الميكروبات عن طريق الفم. تم استخدام (polyethersulfone) العضوية غشاء الى افتعال تحقيقات LLUF. على الرغم من أنه معروف الغشاء لديها 30 كيلو دالتون MWCO، وأداء لأخذ العينات يعتمد أيضا على عوامل أخرى مثل التفاعل من بروتينات اللعاب على الشحنات السالبة على سطح غشاء 30. التغييرات في قيم درجة الحموضة ودرجة الحرارة، فضلا عن تعقيد البروتينات في تجويف الفم تؤثر أيضا على أداء لأخذ العينات. أظهرت البيانات المتوفرة لدينا ان 18 الببتيدات كانت موجودة حصرا في لعاب LLUF التحقيق، أخذ عينات (الجدول 1). والببتيدات انتهت-PQ، SR-، أو PP-SP-C-مصطلحات مستمدة أساسا من البرولين الغنية صroteins. وأفادت التقارير أن صافي سلبا تهمة البرولين الغنية البروتينات عرض قوي الامتزاز على سطح سلبا تهمة 31.
وباختصار، قد وذلك في محاولة للكشف عن مجموعات معينة من البروتينات في أغشية مستقبل شبه منفذ، أمام تحقيقات LLUF يمكن تغييرها باستخدام أحجام المسام والمواد المختلفة التي تهم سطح مختلفة. ويمكن على سبيل المثال، والأغشية nanofiltration مع أحجام المسام تتراوح من 0.05 ميكرون إلى 1 نانومتر فصل الفيروسات من عينات لعاب 32. تحقيقات LLUF يمكن أن تطبق أيضا لرصد تركيز المواد المختلفة مثل الجلوكوز واللاكتات في عينات من اللعاب. على الرغم من أغشية الترشيح الفائق والاستفادة من فصل البروتين عن طريق الترشيح الفائق الطرد المركزي 33، ونادرا ما كانت هذه المادة تستخدم لجمع البروتينات عن طريق تطبيق الضغط السلبي عبر غشاء شبه منفذ. ربط تحقيقات LLUF مع مطياف الكتلة المتقدمة مثل تي فورييهقد ransform ايون سيكلوترون صدى (FT-ICR) تسمح بتحديد لعاب سليمة البروتينات 34-35. خصوصا، قد على الخط تحليل الأنماط الديناميكية للبروتيوم اللعاب وpeptidome أمرا حيويا لتطبيق السريرية للتحقيقات LLUF. بعد جمع مع تحقيقات LLUF، وقد تم تحديد العديد من شظايا الببتيد المستمدة من البرولين الغنية البروتينات من لعاب كل غير مهضوم. يمكن البرولين الغنية البروتينات تتفاعل مع البكتيريا عن طريق الفم في التأثير على تطور تسوس الأسنان 36 و قد تكون كبيرة في حماية الأسطح المخاطية من عدوى فيروسية 37. وعلاوة على ذلك، وقد تم توثيق أنه تم تغيير التعبير من البرولين الغنية البروتينات في مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي 38. هذه الدراسات تدعم بقوة أن البرولين الغنية البروتينات التي جمعتها تحقيقات LLUF قد تكون بمثابة المؤشرات الحيوية لرصد الأمراض التي تصيب الإنسان المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (R01-AI067395-01، R21-R022754-01، و R21-01-I58002). نشكر جيم نيماير لقراءة نقدية للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
