בהתחשב רוק הדגימה עבור יישומים קליניים בעתיד, כמו סוכריה על מקל (LLUF) בדיקה ultrafiltration היה מפוברק להשתלב בחלל הפה האנושי. ניתוח ישיר של רוק לא מעוכל על ידי NanoLC-LTQ ספקטרומטריית מסה הפגינו את היכולת של בדיקות LLUF להסיר חלבונים גדולים וחלבונים שפע גבוהות, ולהפוך נמוך שפע לזיהוי פפטידים יותר.
למרות רוק proteome האדם peptidome נחשפו 1-2 הם זוהו majorly מ tryptic מעכל חלבונים רוק. זיהוי peptidome המקומית של רוק אדם ללא עיכול מוקדם עם אנזימים אקסוגניים הופך הכרחי, שכן פפטידים מקומיים המצויים ברוק האדם לספק ערכים פוטנציאליים לאבחון מחלות, לחזות את התקדמות המחלה, ומעקב אחר היעילות הטיפולית. הדגימה המתאים הוא שלב קריטי להגברת ההזדהות של האדם peptidome הרוק המקומית. השיטות המסורתיות של דגימת רוק האנושי הכרוך צנטריפוגה כדי להסיר שאריות 3-4 אולי זמן רב מדי כדי להיות ישים לשימוש קליני. יתר על כן, סילוק פסולת על ידי צנטריפוגה ייתכן שלא תוכל לנקות את רוב פתוגנים נגועים ולהסיר את החלבונים שפע גבוהה כי לעתים קרובות לעכב את זיהוי peptidome שפע נמוכה.
גישות proteomic קונבנציונאלי כי פרימרילי לנצל דו מימדי ג'ל אלקטרופורזה (2-DE) ג 'ל ב הצמידה עם עיכול ג'ל מסוגלים לזהות חלבונים רוק רבים 5-6. עם זאת, גישה זו היא בדרך כלל לא רגיש מספיק כדי לזהות פפטידים שפע נמוך / חלבונים. כרומטוגרפיה נוזלית-Mass ספקטרומטריית (LC-MS) proteomics מבוססי מהווה חלופה שיכולה לזהות חלבונים ללא הפרדה 2-DE מוקדמת. אמנם גישה זו מספקת רגישות גבוהה יותר, זה בדרך כלל צריך מדגם לפני מראש חלוקה 7 ועיכול מראש עם טריפסין, אשר מקשה על שימוש קליני.
כדי לעקוף את מכשול של ספקטרומטריית מסה עקב הכנת המדגם, פיתחנו טכניקה המכונה ultrafiltration נימי (CUF) בדיקות 8-11. נתוני המעבדה שלנו הראה כי בדיקות CUF מסוגלים ללכוד חלבונים in vivo מ microenvironments שונים בבעלי חיים באופן דינמי פולשנית 8 –11. צנטריפוגה אין צורך מאז לחץ שלילי נוצר על ידי מזרק פשוט לסגת במהלך איסוף דגימה. בדיקות CUF בשילוב עם LC-MS זיהו בהצלחה חלבונים tryptic-מתעכל 8-11. במחקר זה, אנו לשדרג את טכניקת הדגימה ultrafiltration ידי יצירת דמוי סוכריה על מקל (LLUF) ultrafiltration בדיקה שיכולה בקלות להשתלב בחלל הפה האנושי. ניתוח ישירה של LC-MS ללא העיכול טריפסין הראה כי הרוק מכיל שברי אדם indigenously פפטידים רבים שמקורם חלבונים שונים. דגימת רוק עם בדיקות LLUF להימנע צנטריפוגה אבל להסיר בצורה יעילה הרבה חלבונים ושפע גדולים יותר גבוהה. תוצאות ספקטרומטריה שלנו לידי ביטוי, כי רבים פפטידים שפע נמוכות הפכה לגילוי לאחר סינון חלבונים גדולים יותר עם בדיקות LLUF. גילוי פפטידים רוק נמוכים ושפע היה בלתי תלוי ההפרדה מרובה צעד מדגם עם כרומטוגרפיה. עבור יישומים קליניים, בדיקות LLUF לשלבד עם LC-MS היא עשויה לשמש בעתיד כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה מהרוק.
מצאנו כי שברי פפטידים רבים קיימים רוק מעוכלים האדם. אלו שברי פפטיד הם נגזרות של צורות שונות של פרולין עשירים בחלבונים, אקטין, אלפא עמילאז, אלפא 1 גלובין, בטא גלובין, histain 1, קרטין 1, mucin 7, הקולטן אימונוגלובולינים פולימריות, satherin, S100A9. יכול להיות שיש גורמים רבים התורמים ליי?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 ו-R21 I58002-01). אנו מודים ג נימאייר על קריאה ביקורתית של כתב היד.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
Blue dextran | Sigma | ||
Nano LC system | Eksigent | ||
C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |