Summary
בהתחשב רוק הדגימה עבור יישומים קליניים בעתיד, כמו סוכריה על מקל (LLUF) בדיקה ultrafiltration היה מפוברק להשתלב בחלל הפה האנושי. ניתוח ישיר של רוק לא מעוכל על ידי NanoLC-LTQ ספקטרומטריית מסה הפגינו את היכולת של בדיקות LLUF להסיר חלבונים גדולים וחלבונים שפע גבוהות, ולהפוך נמוך שפע לזיהוי פפטידים יותר.
Abstract
למרות רוק proteome האדם peptidome נחשפו 1-2 הם זוהו majorly מ tryptic מעכל חלבונים רוק. זיהוי peptidome המקומית של רוק אדם ללא עיכול מוקדם עם אנזימים אקסוגניים הופך הכרחי, שכן פפטידים מקומיים המצויים ברוק האדם לספק ערכים פוטנציאליים לאבחון מחלות, לחזות את התקדמות המחלה, ומעקב אחר היעילות הטיפולית. הדגימה המתאים הוא שלב קריטי להגברת ההזדהות של האדם peptidome הרוק המקומית. השיטות המסורתיות של דגימת רוק האנושי הכרוך צנטריפוגה כדי להסיר שאריות 3-4 אולי זמן רב מדי כדי להיות ישים לשימוש קליני. יתר על כן, סילוק פסולת על ידי צנטריפוגה ייתכן שלא תוכל לנקות את רוב פתוגנים נגועים ולהסיר את החלבונים שפע גבוהה כי לעתים קרובות לעכב את זיהוי peptidome שפע נמוכה.
גישות proteomic קונבנציונאלי כי פרימרילי לנצל דו מימדי ג'ל אלקטרופורזה (2-DE) ג 'ל ב הצמידה עם עיכול ג'ל מסוגלים לזהות חלבונים רוק רבים 5-6. עם זאת, גישה זו היא בדרך כלל לא רגיש מספיק כדי לזהות פפטידים שפע נמוך / חלבונים. כרומטוגרפיה נוזלית-Mass ספקטרומטריית (LC-MS) proteomics מבוססי מהווה חלופה שיכולה לזהות חלבונים ללא הפרדה 2-DE מוקדמת. אמנם גישה זו מספקת רגישות גבוהה יותר, זה בדרך כלל צריך מדגם לפני מראש חלוקה 7 ועיכול מראש עם טריפסין, אשר מקשה על שימוש קליני.
כדי לעקוף את מכשול של ספקטרומטריית מסה עקב הכנת המדגם, פיתחנו טכניקה המכונה ultrafiltration נימי (CUF) בדיקות 8-11. נתוני המעבדה שלנו הראה כי בדיקות CUF מסוגלים ללכוד חלבונים in vivo מ microenvironments שונים בבעלי חיים באופן דינמי פולשנית 8 -11. צנטריפוגה אין צורך מאז לחץ שלילי נוצר על ידי מזרק פשוט לסגת במהלך איסוף דגימה. בדיקות CUF בשילוב עם LC-MS זיהו בהצלחה חלבונים tryptic-מתעכל 8-11. במחקר זה, אנו לשדרג את טכניקת הדגימה ultrafiltration ידי יצירת דמוי סוכריה על מקל (LLUF) ultrafiltration בדיקה שיכולה בקלות להשתלב בחלל הפה האנושי. ניתוח ישירה של LC-MS ללא העיכול טריפסין הראה כי הרוק מכיל שברי אדם indigenously פפטידים רבים שמקורם חלבונים שונים. דגימת רוק עם בדיקות LLUF להימנע צנטריפוגה אבל להסיר בצורה יעילה הרבה חלבונים ושפע גדולים יותר גבוהה. תוצאות ספקטרומטריה שלנו לידי ביטוי, כי רבים פפטידים שפע נמוכות הפכה לגילוי לאחר סינון חלבונים גדולים יותר עם בדיקות LLUF. גילוי פפטידים רוק נמוכים ושפע היה בלתי תלוי ההפרדה מרובה צעד מדגם עם כרומטוגרפיה. עבור יישומים קליניים, בדיקות LLUF לשלבד עם LC-MS היא עשויה לשמש בעתיד כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה מהרוק.
Protocol
1. יצירה של בדיקות LLUF
- הממברנות polyethersulfone (2 ס"מ 2) נחתמו עם משוטים משולש פוליפרופילן (אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו) על ידי ממברנות הדבקה עם אפוקסי על גבולות משוטים. קרום מטען שלילי polyethersulfone עם משקל מולקולרי חתוכים (MWCO) בשעה 30 kDa היה בשימוש.
- פרופילן fluorinated טפלון אתילן צינור (בקוטר פנימי / קוטר חיצוני, 0.35/0.50 ס"מ) היתה מחוברת ליציאה של צילינדר ההנעה פוליפרופילן המשולש כך בדיקה LLUF ניתן לחבר מזרק 20 מ"ל.
- לאחר השריית קרום polyethersulfone לתוך הרוק האדם בצלחת תרבות (50 מ"מ קוטר), לחץ שלילי נוצר על ידי נסיגה מזרק. מזרק עם לחץ שלילי הסיע את תהליך ultrafiltration של הדגימה חלבונים מהרוק.
- הבדיקות היו מעוקרים עם אלכוהול 70% לפני לילה לשימוש. כדי להדגים איטום הולם, אנחנו בעמדה בדיקות LLUF אל Solution המכיל כחול dextran (50 מ"ג / מ"ל) בעל מסה מולקולרית ממוצעת של 2,000 kDa עבור H 2. היעדר כחול dextran בדגימות שנאספו עולה כי ההדלפות לא פיתח במהלך ייצור בדיקה ודגימה.
2. אוסף רוק
- הרוק כולו נאסף שלושה מתנדבים בריאים (שני זכרים ונקבה אחת בין הגילאים 20 ו 40) אשר לא נטלו תרופות, ללא סימנים גלויים של 6 דלקת חניכיים או עששת.
- לאחר שטיפת הפה עם מים, דגימות רוק שלמים נאספו על ידי יריקה, ללא גירוי כימי, לתוך כלי קרח מקורר.
- כל הדגימות היו אספו ושמרו על הקרח במהלך הליך האיסוף.
- מיד לאחר איסוף, רוק (200 μl) נתבקש הדגימה עם בדיקות LLUF. הדגימה בוצעה על חדר 4 ° C.
- חלבונים רוק (1.0 מיקרוגרם / μl) עם או בלי אוסף בדיקה LLUF היו נתונים ישירות של ננו LC-המוניתpectrometry ניתוח ללא העיכול tryptic. ריכוז חלבון נקבעו באמצעות Assay ביו רד חלבון 12.
3. NanoLC LTQ-MS ניתוח
- את בלתי מתעכל דגימות רוק (5 μl) הועלו ישירות בעמודה מלכודת של מערכת NanoLC Eksigent ידי autosampler, באמצעות 100 חיץ% (2% חומצה פורמית acetonitrile/0.1%). NanoLC היה on-line יחד עם ספקטרומטר מסה פיניגן LTQ.
- אחרי המדגם טעינה כביסה, שסתום היה עבר ו 500 NL / דקה שיפוע ליניארית נמסר מלכודת והעמודה ההפרדה (10 ס"מ אורך, 100 מיקרומטר איד, בבית, עמוסות Synergi 4 מיקרומטר C18). שיפוע היה 0-50 מאגר% B (80% acetonitrile/0.1% חומצה פורמית) ב 45 דקות.
- NanoLC-LTQ המכשירים טרשת נפוצה הופעלו במצב הנתונים תלויה על ידי Xcalibur. MS / MS ספקטרום של ארבע יונים החזקים טרשת נפוצה מעל בעוצמה של 1 × 10 5 נאספו למעט דינמימופעלת האנרגיה התנגשות נקבע על 35%.
- מדגם זה הופעלה פעמיים על ידי מערכת MS-NanoLC LTQ. דוגמאות משלושה ההכנות נפרדים שימשו. פפטידים אלו לגילוי בשלוש דגימות נפרדות המפורטים בטבלאות תוספת 1 ו -2. נציג NanoLC-MS LTQ ספקטרה היה באיור 3.
4. ניתוח נתונים ו מסד הנתונים חיפוש חלבון
- כל קובץ RAW שהומר לקובץ mzXML באמצעות Readw.exe.
- קובץ mzXML היה קלט לתוך המערכת הקוסם 2 SEQUEST וחיפשו מול מסד נתונים האנושי שנוצר המרכז הלאומי למידע המתאים ביוטכנולוגיה (צמח השדה) באתר חלבון באמצעות אי - אנזים הספציפיות. סובלנות המונית של יון מבשר נקבע דה 1.5. המסה המולקולרית של 16 דה נוספה מתיונין לחיפוש ההפרש להסביר חמצון.
- לאחר חיפוש SEQUEST, התוצאות היו מסוננים באופן אוטומטי, תוקףD מוצג על ידי PeptideProphet ו ProteinProphet [המכון מערכות ביולוגיה (ISB)]. PeptideProphet מעריך ציון מקיף (P) ההסתברות המשימה פפטיד הוא "נכון" מול "לא נכון" על הבסיס של עשרות SEQUEST של זה (Xcorr, ΔCn, SP, RSp) ומידע נוסף על כל רצף הפפטיד מזוהה. ProteinProphet מחושב ציון הסתברות 0-1 עבור כל חלבון על בסיס פפטידים שהוקצו MS / MS ספקטרה.
- כדי למזער את זיהויים חיוביים שווא השתמשנו בקריטריונים המחמירים הסינון. ראשית, הפסקת הציון המינימלי P נקבע על 0.8 פפטיד כל המקובלת להבטיח שגיאה נמוך מאוד (פחות מ 3%) ורגישות טובה למדי. שנית, כל פפטידים עם ציון> P 0.8 חייב להיות גבוה בין קורלציה (Xcorr) עשרות רבות בעת ובעונה אחת: 1.9, 2.2, ו -3.0 ל 1, 2, ו 3 תשלום.
5. הסרת חיידקים דרך הפה עם בדיקות LLUF
- כדי לקבוע את היכולת של בדיקות LLUF להסירחיידקים דרך הפה, רוק לפני ואחרי LLUF בדיקה אוסף (סעיף 3) נפרש על צלחות אגר לגילוי חיידקי.
- חיידקים אירוביים גדלו על צלחת אנטיביוטיקה ללא (LB) Lauria-Bertani אגר על 37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד.
- חיידקים אנאירוביים גדלו על צלחת אנטיביוטיקה ללא מרק Brucella אגר (BD, ניצוצות, MD) בתנאים אנאירוביים באמצעות גז פאק (BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה) בשעה 37 ° C ליום אחד.
6. נציג תוצאות
1. ייצור של בדיקות LLUF ורוק הדגימה בסביבת הפה חיקה
אם רוק הדגימה יכול להתבצע למצוץ סוכריה על מקל, ההליך יהיה למנוע הידרדרות של רוק הקיף במכשירים איסוף 13-14. חשוב לציין, זה יהיה גם להיות אפשרי לעקוב אחר החולים באופן דינמי במקום מחומרי עששת בפה. בנוסף, אם הכנת המדגם באמצעות הרוק יכול להיות פשוט יותר, קלינאים היה בקלות facilitate ההליך לזרז את ההחלטה על המבצע הקליני הבא. ספקטרומטריית מסה היא אחת הטכניקות הכי רגישים כדי לזהות ואפילו חלבונים רצף בתקופה קצרה מאוד של זמן. עם זאת, הליכים מורכבים עבור הכנת המדגם יש הכבידו באמצעות טכניקה זו במרפאה. יתר על כן, ידוע כי שפע חלבונים גבוהה יותר או חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה בדגימות קליניות (למשל עמילאז ברוק) נמוך מסכת חלבונים בשפע ניתוח ספקטרומטריה 15-16. כדי להתגבר על המכשולים שצוינו לעיל, פיתחנו מכשיר דמוי סוכריה על מקל ultrafiltration בשם בדיקות LLUF (איור 1). מטען שלילי polyethersulfone קרום עם MWCO ב 30 kDa (איור 1 א, א) היה דבוק ההנעה פוליפרופילן (איור 1 א, ב). זה היה ממוקם מול בדיקה LLUF מתוך כוונה סינון חלבונים גדולים ברוק. כדי לחקות את סביבת הפה האנושי (איור 1 א ', ג'), ספוג (איור 1 א, ה) היה ספוג לתוך הרוק בצלחת התרבות (איור 1 א, ו). לאחר הנסיגה באופן מלא את המזרק (איור 1 א, ד), רוק מסוננים החל לנוע לאורך צינור המחובר (איור 1 א, ג) ו נאסף.
2. זיהוי peptidome הרוק המקומית על ידי NanoLC LTQ-MS
השוואת LC chromatograms, מצאנו chromatograms שונים של רוק לפני ואחרי הדגימה LLUF (איור 2), המציין כי יש יצירות חלבונים שונים ברוק אחרי הדגימה LLUF. כדי לקבוע את יצירות חלבון, אנחנו עובדים NanoLC-LTQ ספקטרומטריית מסה כי ידוע להיות מסוגל מיד פפטידים רצף מתערובת חלבונים נפוצה. יתרה מכך, כדי לפשט את הכנת המדגם לצרכים קליניים, רוק שלם בלי כימי או עיכול אנזימטי יושמה לניתוח NanoLC MS-LTQ. באופן בלתי צפוי, 131 פפטידים לנומחדש מזוהה רוק מעוכל (לוח משלימה 1). פפטידים אלו הם שברי הנגזרות השונות חלבונים עשירים פרולין, אקטין, אלפא עמילאז, אלפא 1 גלובין, הבטא גלובין, histain 1, 1 קרטין, mucin 7, הקולטן אימונוגלובולינים פולימריות, satherin, ו S100A9. עשרים ושש פפטידים ייחודיים זוהו הרוק לאחר סינון באמצעות בדיקות LLUF (לוח משלימה 2). פפטידים אלו הם שברים שמקורם בעיקר פרולין עתירי חלבונים שונים. פפטידים שמקורם חלבונים כגון הקולטן אימונוגלובולינים פולימריות (83.24 KDA) ו אלפא עמילאז, היו בלתי ניתן לגילוי, הוכחת יכולת של בדיקות LLUF בסילוק חלבונים גדולים יותר ורב. ספקטרום MS / MS של הפפטיד PFIAIHAEAESKL המתאים פפטיד הפנימי של אלפא עמילאז ממחישה איור 3 א. מסקרן ביותר, לאחר הסרת חלבונים גדולים יותר, 18 של 26 פפטידים רצף הפך לזיהוי רוק LLUF בדיקה, דגימה (לוח ב '1). 18 פפטידים אלה נגזרו פרולין עתירי חלבונים או חלבונים היפותטיים שהסתיימו עם פרולין (P) -. גלוטמין (ש) (-PQ),-SR,-SP-PP או C-הסופית 3B איור הראה MS / MS הספקטרום של הפפטיד PQGPPQQGGHPRPP כי זוהה הרוק LLUF בדיקה, שנדגמו. הפפטיד יכול לנבוע subfamily פרולין עשיר בחלבון HaeIII 1 ו - 2 (טבלה 1).
באיור 1. יצירות של בדיקות LLUF ו דגימה של רוק כולו לחקות את חלל הפה האנושי לוח: (א) חצי חדיר polyethersulfone עם MWCO של 30 kDa (ב) ההנעה פוליפרופילן (ג) פרופילן fluorinated טפלון צינור אתילן; (ד) מזרק 20 מ"ל לוח ב ':. ספוג (ה) (לשון חיקה) היה ספוג לתוך צלחת תרבות (ו) המכיל רוק האדם ליצורחלל מלאכותית הפה האנושי (ז). לחץ שלילי וכתוצאה מכך נוצר על ידי נסיגה מלאה מזרק שמניע את הנוזלים שנאספו לנוע לאורך צינור המחובר (חץ) וכלפי החלל שנוצר (ראש חץ) בתוך מזרק. בר: 2.0 ס"מ.
איור 2. ההפרש LC / MS / MS chromatograms של הרוק לפני ואחרי הדגימה LLUF. חלבונים (1.0 מיקרוגרם / μl) המצויים ברוק כל אדם סוננו בלי או עם בדיקה LLUF. חלבונים ללא העיכול tryptic היו נתונים ישירות NanoLC LTQ-MS שהיה מצומד עם מערכת ננו LC Eksigent כמתואר חומרים ושיטות. בסיס השיא chromatograms (עם 44-MIM פעמים שימור) של הרוק לפני () ואחרי (B) הדגימה LLUF באו לידי ביטוי.
איור 3. Detection של peptidome רוק ידי NanoLC-LTQ טרשת נפוצה רצפי חלבונים. ריר לפני () ואחרי (ב) דגימה עם בדיקות LLUF נותחו על ידי NanoLC-MS LTQ כמתואר נהלים ניסיוניים. Peptidome רוק נגזר רוק אנושית טבעית ללא העיכול tryptic הודגמו בלוחות תוספת 1 ו -2. הפפטיד (PFIAIHAEAESKL) נגזר אלפא עמילאז זוהה באופן בלעדי, ללא אוסף עם בדיקות LLUF (א) דגימת רוק, הממחישות את היכולת של בדיקות LLUF בהסרת חלבונים גדולים. פפטידים רבים עם-PQ,-SR היו-SP-PP או C-Termini אך ורק לאחר בדיקות דגימות LLUF ultrafiltration. אחת (PQGPPQQGGHPRPP) של פפטידים הנגזרים שונים חלבונים עשירים פרולין הוצגו (ב '). MS / MS ספקטרום אופייני עם "Y" ו "B" יונים סדרת אישרו את זהותם של שני פפטידים.
<strong> איור 4. סילוק החיידקים באמצעות הפה במהלך בדיקות LLUF. בדיקה LLUF נבנה כמתואר חומרים ושיטות. החללית היתה ממוקמת לתוך הרוק האדם בסביבת הפה חיקה (איור 1). מזרק בסוף LLUF בדיקה בוטל ליצור לחץ שלילי כי הסיע את תהליך ultrafiltration הדגימה רוק. במהלך הדגימה, רוק שלם עבר דרך קרום בררני polyethersulfone וצברה בתוך מזרק. הרוק לפני כל דגימה עם החללית LLUF שימש פקד. רוק (10 μl) לפני ואחרי הדגימה בדיקה LLUF נפרש על צלחות אגר לגילוי חיידקי לוח:. הרוק עם (+ LLUF) וללא (+ LLUF) הדגימה LLUF בדיקה התפשטה Side-by-הצד על אנטיביוטיקה ללא אגר LB צלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד ב 'פאנל:. הרוק עם ובלי הדגימה בדיקה LLUF היה פרוש על צלחת אנטיביוטיקה ללא אגר Brucella מרקבתנאים אנאירוביים באמצעות גז פאק (BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה) בשעה 37 ° C ליום אחד. חיידקים לא גדל על צלחות אגר מתפשטים עם הרוק בדיקה, שנדגמו LLUF, הוכחת יכולת של בדיקות LLCF לחסל אירובית כמו גם חיידקים אנארוביים בעל פה. בר: 1.0 ס"מ.
| רצף הפפטיד / מסת פפטיד מדוד | ההצטרפות מספר | שם | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485.3 | gi | 41349484 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 1 איזופורם 2 מבשר |
| gi | 41349482 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 1 איזופורם 1 מבשר | ||
| gi | 60301553 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576.9 | gi | 4826944 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 2 |
| gi | 9945310 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 1 | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126.2 | gi | 37537692 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 4 מבשר |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028.3 | GI | 113423660 | חזה: היפותטית חלבון |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077.8 | GI | 113423262 | חזה: איזופורם חלבון היפותטי 5 |
| gi | 41349482 | פרולין עשיר בחלבון BSTNI subfamily 1 איזופורם 1 מבשר | ||
| gi | 60301553 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 2 | ||
| GI | 113423663 | חזה: היפותטית חלבון | ||
| gi | 41349484 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 1 איזופורם 2 מבשר | ||
| gi | 41349486 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 1 איזופורם 3 מבשר | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918.5 | gi | 9945310 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 1 |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131.3 | GI | 113423660 | חזה: היפותטית חלבון |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | GI | 113423663 | חזה: היפותטית חלבון |
| gi | 41349482 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 1 איזופורם 1 מבשר | ||
| GI | 113423262 | חזה: איזופורם חלבון היפותטי 5 | ||
| gi | 60301553 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866.6 | gi | 4826944 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713.8 | gi | 9945310 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 1 |
| gi | 4826944 פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 2 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083.1 | gi | 9945310 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 1 |
| gi | 4826944 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512.6 | gi | 4826944 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 2 |
| gi | 9945310 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 1 | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720.2 | GI | 113423262 | חזה: איזופורם חלבון היפותטי 5 |
| GI | 113423663 | חזה: הייpothetical חלבון | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450.1 | gi | 9945310 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 1 |
| gi | 4826944 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791.1 | gi | 4826944 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 2 |
| gi | 9945310 | פרולין עשיר בחלבון HaeIII subfamily 1 | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186.9 | GI | 113423262 | חזה: איזופורם חלבון היפותטי 5 |
| gi | 41349482 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 1 איזופורם 1 מבשר | ||
| gi | 60301553 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 2 | ||
| GI | 113423663 | חזה: היפותטית חלבון | ||
| gi | 41349484 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 1 איזופורם 2 מבשר | ||
| gi | 41349486 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 1 איזופורם 3 מבשר | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720.3 | GI | 113423663 | חזה: היפותטית חלבון |
| gi | 41349482 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 1 איזופורם 1 מבשר | ||
| GI | 113423262 | חזה: איזופורם חלבון היפותטי 5 | ||
| gi | 60301553 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870.9 | gi | 37537692 | פרולין עשיר בחלבון BstNI subfamily 4 מבשר |
פפטידים לוח 1. היה ניתן להבחין אך ורק LLUF, אספו דגימות.
לוח משלימה 1. לחץ כאן לקבלת לוח משלים 1 .
לוח משלימה 2. לחץ כאן לקבלת לוח משלימה 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מצאנו כי שברי פפטידים רבים קיימים רוק מעוכלים האדם. אלו שברי פפטיד הם נגזרות של צורות שונות של פרולין עשירים בחלבונים, אקטין, אלפא עמילאז, אלפא 1 גלובין, בטא גלובין, histain 1, קרטין 1, mucin 7, הקולטן אימונוגלובולינים פולימריות, satherin, S100A9. יכול להיות שיש גורמים רבים התורמים לייצור פפטידים עם אתרים מחשוף לא נקבעה. לדוגמה, כמה שברי פפטיד עשוי להיות נוכח באופן טבעי רוק כל אדם. פפטידים רבים עם PQ-C-Termini זוהו (טבלה 1 ורשימות תוספת 1 ו - 2). פרולין עתירי חלבונים יכולה להיות מסווגת, חלבונים חומציים או בסיסיים glycosylated ו מקודדים על ידי שישה גנים מקובצים באזור אחד 17. יותר מ 30 שונה פרולין עתירת חלבונים הנובעות וריאציה allelic, שחבור רנ"א ההפרש, עיבוד פרוטאוליטים, ופוסט של תרגום שינויים 17. לאחר הפרשה, פרולין Prot חומצי עשירEins מחוברים במהירות משטחי השן והשפילו את הפוטנציאל פפטידים חסינות מולדת ידי proteolysis רובד דנטלי 18-19. שני חיידקים גרם שליליים ו גראם חיוביים להביע מגוון של glycosidases ו פרוטאזות 18. זה כבר דווח כי חומציים פרולין עתירי חלבונים יכול להיות מושפל אל המולדת, חסינות דמויי פפטידים פוטנציאליים על ידי סטרפטוקוקוס אוראלי מינים Actinomyces 18. גלוטמין (Gln) - גליצין (גלאי) המחשוף הוא קריטי מבחינה ביולוגית ביחס השפלה חיידקי של חלבונים חומציים הרוק עשירים פרולין וייצור הסופית-C החיידקים מחייב-PQ 18, 20-22. הכריכה של-PQ טרמיני של פרולין עתירי חלבונים חיידקים אושרה על ידי בניסוי במבחנה באמצעות סינתטי RGRPQ pentapeptide 18. בהסכם עם הנתונים שלנו, הקבוצה ש"י של פישר הצליח לזהות פפטידים עם מספר-PQ C-Termini ברוק מעוכלים הפרוטיד אדם 23,דבר המצביע על מספר פפטידים עם PQ-C-Termini indigenously יכול להתקיים ברוק כל אדם. רוק האדם מכיל מספר רב של פפטידים עם PQ-C-Termini אשר יפעלו כמו חסינות מולדת, כמו פפטידים 18, 19. כאשר חיידקים דרך הפה קיימים, פרולין עתירי חלבונים יכול מיד לשבור לרסיסים שונים עם PQ-C-Termini כדי להרוג את החיידקים ביעילות.
סיבה נוספת שברי פפטידים הקיימים רוק מעוכלים הן כי חלק פרוטאזות אנדוגניים הנמצאים ברוק כולו עשוי להישאר פעיל במהלך הכנת המדגם 24-25. מחשוף המתרחשים חלבונים אלה על ידי פרוטאזות פנימיים בחלל הפה סביר לפני הניתוח המשיך ספקטרומטריית מסה. לדוגמה, mucin ניתן ביקע ידי פרוטאז הרוק עד טופס קטן כי הוא מוכשר יותר אישור בקטריאלי 26. ייתכן גם כי פרוטאזות של חיידקים דרך הפה עשויה לדבוק החלבונים בעל פה לפני או אחרי collectio רוקn. זה תועד כי חלבונים רוק כמה ניתן קצוץ ידי פרוטאזות של סטרפטוקוקוס אוראלי Actinomyces מינים 27-29.
קרום חדיר למחצה הוא מרכיב מרכזי של בדיקות LLUF. הממברנה יש צורך להסיר באופן סלקטיבי חומרים גדולים יותר, כולל חלבונים, חיידקים דרך הפה ופסולת. LLUF משמש כמחסום בררני המאפשר מעבר של רכיבים מסוימים ודוחה רכיבים אחרים בתוך חלל הפה מלאכותית. קרום חדיר למחצה מאפשר מולקולה קטנה לעבור דרך הממברנה תוך למעט מקרומולקולות. נתונים אחרונים של המעבדה שלנו הראה כי בדיקות LLUF יכול, למעשה, להסיר חיידקים דרך הפה הן אירובית וגם אנאירובית (איור 4). דגימות רוק לפני ואחרי אוסף עם בדיקות LLUF פוזרו על אנטיביוטיקה נטולי צלחות אגר ו מודגרות בתנאים אירוביים ו אנאירובי. חיידקים לא גדל כאשר צלחות אגר היו פרושים עם LLUF בדיקה,דגימה רוק, הוכחת יכולת של בדיקות LLUF בהסרת חיידקים דרך הפה אירובי אנאירובי. חיפשנו את כל ספקטרום עם מסד נתונים אנושי לא כלל מאגרי החלבון של החיידקים בפה האדם. זיהוי proteome / peptidome של חיידקים דרך הפה תתאפשר אם מסד נתונים מקיף על כל חלבון חיידקים דרך הפה ניתן להקים. קרום (polyethersulfone) אורגנית שימש לפברק בדיקות LLUF. למרות קרום היה ידוע כבעל kDa MWCO 30, ביצועים הדגימה גם תלוי בגורמים נוספים, כגון אינטראקציה של חלבונים רוק לשם המטענים השליליים על פני הממברנה 30. השינויים ערכי ה-pH וטמפרטורה, כמו גם המורכבות חלבונים בחלל הפה גם להשפיע על ביצועי הדגימה. הנתונים שלנו הראו כי 18 פפטידים נכחו אך ורק רוק LLUF בדיקה, דגימה (טבלה 1). פפטידים הסתיים-PQ, SR-,-SP-PP או C-Termini נגזרים בעיקר פרולין עשיר עמ 'roteins. זה כבר דווח כי נטו מטען שלילי פרולין עתירי חלבונים מוצג ספיחה חזקה על משטח מטען שלילי 31.
לסיכום, בניסיון לזהות קבוצות ספציפיות של חלבונים בעתיד, קרום חדיר למחצה מול בדיקות LLUF ניתן לשנות באמצעות גודל הנקבוביות שונים וחומרים בעלי חיובים שונים על פני השטח. למשל, קרומים nanofiltration עם הגדלים הנקבוביות נע בין 0.05 מיקרון ל 1 ננומטר וירוסים יכולים להפריד בין דגימות רוק 32. בדיקות LLUF גם ניתן ליישם לניטור ריכוז חומרים שונים, כגון גלוקוז לקטט בדגימות רוק. למרות ממברנות ultrafiltration עשו שימוש ההפרדה חלבון דרך ultrafiltration צנטריפוגלי 33, הם רק לעתים נדירות נעשה שימוש כדי לאסוף חלבונים באמצעות הפעלת לחץ שלילי על פני קרום חדיר למחצה. קישור בדיקות LLUF עם ספקטרומטר מסה מתקדמים כגון פורייה transform יון הציקלוטרון תהודה (FT-ICR) עשוי לאפשר זיהוי של רוק ללא פגע חלבונים 34-35. יש לציין, on-line ניתוח של דפוסי דינמיים של הרוק proteome ו peptidome עשויה להיות חיונית עבור היישום הקליני של בדיקות LLUF. לאחר איסוף עם בדיקות LLUF, שברי פפטידים רבים שמקורם פרולין עתירי חלבונים זוהו מהרוק כל מעוכלים. פרולין עתירי חלבונים יכול לקיים אינטראקציה עם חיידקים דרך הפה להשפיע על התפתחות עששת שיניים 36 ו עשויים להיות משמעותיים בהגנה על המשטחים הריריים של זיהום ויראלי 37. יתר על כן, תועד כי ביטוי של חלבונים עתירי פרולין שונה אצל החולים דלקת מפרקים שגרונית 38. מחקרים אלה תומכים כי פרולין עתירי חלבונים שנאספו על ידי בדיקות LLUF יכול לשמש סמנים ביולוגיים למעקב אחר מחלות אנושיות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 ו-R21 I58002-01). אנו מודים ג נימאייר על קריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
