Summary
향후 임상 응용을위한 타액 표본 추출을 고려 롤리팝 같은 ultrafiltration (LLUF) 프로브는 인간의 구강에 맞게 가공되었다. NanoLC-LTQ 질량 분석법에 의한 소화되지 않은 타액의 직접적인 분석은 큰 단백질과 높은 풍부한 단백질을 제거하고 낮은 풍부한 펩티드 더 감지하게 LLUF 프로브의 능력을 보여주었다.
Abstract
인간의 타액 프로테옴 및 peptidome가 1-2 공개되어 있지만 그들은 majorly tryptic 타액 단백질의 소화에서 발견되었다. 인간의 타액에있는 원시 펩티드는 질병을 진단하는 질병의 진행을 예측하고, 치료 효능을 모니터링을위한 잠재적인 가치를 제공하기 때문에 외인성 효소와 사전 소화하지 않고 인간의 타액의 토착 peptidome의 확인은 필수적이된다. 적절한 샘플링은 인간 원주민 침이 peptidome의 식별 향상을위한 중요한 단계입니다. 3-4 파편을 제거하는 원심 분리를 포함한 인간의 타액을 샘플링의 전통적인 방법은 너무 시간이 많이 걸리는 임상 사용을위한 적용하는 것입니다. 또한, 원심 분리에 의한 잔해 제거는 감염된 병원균의 대부분을 청소하고 종종 낮은 풍요의 peptidome의 식별을 방해 높은 풍부한 단백질을 제거하지 못할 수 있습니다.
종래의 proteomic 접근법 해당 PRI인 겔 소화와 활용에 marily 활용 2 차원 겔 전기 영동 (2-DE)이 젤 많은 타액 단백질에게 5-6를 식별하는 능력이있다. 그러나,이 접근 방법은 일반적으로 낮은 풍요의 펩티드 / 단백질을 감지할 충분히 구분하지 않습니다. 액체 크로마 토그래피 - 질량 분석계 (LC-MS) 기반 proteomics은 사전 2-DE 분리하지 않고 단백질을 식별할 수있는 대안입니다. 이 방법은 높은 감도를 제공하지만, 그것은 일반적으로 사전에 샘플을 미리 분별화 7 어렵게 임상 사용하기 위해 만들어 트립신과 미리 소화 필요합니다.
샘플 준비로 인한 질량 분광법에 지장을 회피하기 위해, 우리는 모세관 ultrafiltration (CUF) 프로브 8-11이라는 기술을 개발했습니다. 저희 연구실에서 데이터 CUF 프로브는 역동적이고 최소한 침략적 태도 8의 동물의 다양한 microenvironments에서 생체내의 단백질을 캡처하는 능력이있다 는걸 증명 -11. 부정적인 압력이 샘플 수집하는 동안 철수 단순히 주사기에 의해 만들어진 이후로 원심 분리가 필요하지 않습니다. LC-MS와 결합 CUF 프로브를 성공적 tryptic - 소화 단백질에게 8-11을 확인했습니다. 본 연구에서는 우리가 쉽게 사람의 구강에 맞을 수있는 롤리팝 같은 ultrafiltration (LLUF) 프로브를 만들어 ultrafiltration 샘플링 기법을 업그레 이드. 트립신의 소화없이 LC-MS에 의한 직접적인 분석은 indigenously 인간 타액은 다양한 단백질에서 파생된 많은 펩타이드 조각을 포함했다. LLUF 프로브와 타액을 샘플링하면 원심 분리를 피할 수 있지만 효과적으로 많은 크고 높은 풍부한 단백질을 제거했습니다. 우리 대량 spectrometric 결과는 많은 낮은 풍요로움의 펩티드가 LLUF 프로브로 큰 단백질을 걸러 후 감지 된 그림. 낮은 풍요의 타액 펩티드가 탐지 크로마 토그래피로 여러 단계의 시료 분리 독립했습니다. 임상 응용의 경우 LLUF 프로브가 통합LC-MS와 D는 잠재적으로 타액에서 질병의 진행을 모니터링하는 미래에 사용될 수 있습니다.
Protocol
1. LLUF 프로브의 창조
- polyethersulfone의 점막 (2cm 2) 충격기의 테두리에 에폭시와 gluing의 점막에 의해 삼각형 폴리 프로필렌의 심폐 (캘리포니아 대학, 샌디에고)의 맹세했습니다. 30 kDa의 분자량 절단 (MWCO)와 부정 청구 polyethersulfone 막가 사용되었습니다.
- LLUF 프로브는 20 ML의 주사기에 연결된 수 있도록 테플론 플루오르 에틸렌 프로필렌 튜브 (내경 / 외경, 0.35/0.50 ㎝) 삼각형 폴리 프로필렌 패들의 실린더 출구에 붙어 있 었지.
- 문화 요리 (50 밀리미터 직경)에 인간의 타액으로 polyethersulfone 막에 몸을 담근 후, 부정적인 압력이 주사기를 철수하여 만들었습니다. 부정적인 압력과 주사기는 타액에서 단백질을 샘플링을위한 ultrafiltration 과정을 버린 것이다.
- 프로브가 사용 하룻밤 전에 70 % 알코올로 소독했다. 적절한 씰링을 증명하기 위해, 우리는 solu로 LLUF 프로브를 위치2 시인데 2,000 kDa의 평균 분자 질량과 파란색 dextran을 (50 밀리그램 / ML)이있는 기. 수집된 샘플의 푸른 dextran의 부재는 더 누수 프로브 제조 및 샘플링 동안 개발한 없다는 것을 지적했다.
2. 침이 수집
- 전체 타액은 치은염이나 충치 6없이 명백한 징후로, 어떤 약품을 복용하지 세 건강한 자원 봉사자 (두 남성과 나이 20와 40 사이에 한 명, 여자)로부터 수집되었다.
- 물로 입을 rinsing 후 전체 타액 샘플은 얼음으로 냉각 선박으로, 화학 자극없이 뱉기에 의해 수집되었다.
- 모든 샘플은 수집 과정에서 풀링된 얼음에 보관되었다.
- 즉시 수령 후 타액은 (200 μl) LLUF 프로브와 샘플 신청했습니다. 샘플링은 4 ° C에서 실에서 수행되었다.
- LLUF 프로브 수령 여부에 상관없이 타액 단백질은 (1.0 μg / μl)에 직접 나노 LC-대량의를 받게되었다tryptic 소화없이 pectrometry 분석. 단백질 농도는 바이오 - 방사선 단백질 분석 12를 사용하여 결정됩니다.
3. NanoLC-LTQ MS 분석
- 취소 소화 타액 샘플 (5 μl)가 직접 100 %의 버퍼를 사용 autosampler에 의해 Eksigent NanoLC 시스템의 트랩 열에 로드된되었다 (2 % acetonitrile/0.1 %의 개미의 산). NanoLC는 온라인 Finnigan LTQ 질량 분석기와 결합되었다.
- 샘플 로딩과 세탁 후, 밸브가 전환되었고 500 NL / 분 선형 기울기는 트랩과 분리 칼럼 (길이 10cm, 100 μm의 아이디, 사내 Synergi 4 μm의 C18 즐비)에게 전달되었다. 기울기는 0~50% 버퍼 B (80 % acetonitrile/0.1 % 개미의 산성)에서 45 분에.
- nanoLC-LTQ 석사 악기 Xcalibur에 의해 데이터가 종속 모드로 운영되었다. 1 × 10 5의 강도 위의 네 가지 최강의 MS 이온의 MS / MS 스펙트럼은 동적 배제으로 수집되었다활성화 및 충돌 에너지는 35 %로 설정합니다.
- 각 샘플은 NanoLC-LTQ MS 시스템에 의해 두 번 실행되었다. 별도의 세 가지 준비의 표본이 사용되었다. 별도의 세 가지 샘플에 감지 이러한 펩티드는 보충 표 1과 2에 나열했다. NanoLC-LTQ MS 스펙트럼 대표는 그림 3과 그림되었다.
4. 데이터 분석 및 단백질 데이터베이스 검색 중
- 각 원시 파일 Readw.exe을 사용 mzXML 파일로 변환되었습니다.
- mzXML 파일 SEQUEST 마법사 2 시스템에 입력했고 생명 공학 정보 (NCBI) 이외의 효소 특이성을 이용한 단백질 데이터베이스에 해당하는 국립 센터에서 발생하는 인간의 데이터베이스에 대해 검색했습니다. 전구체 이온의 질량 오차는 1.5 다에서 설정되었습니다. 16 다의 분자 질량은 산화에 대한 계정에 차등 검색을위한 메티오닌에 추가되었습니다.
- SEQUEST의 검색하면 결과가 자동으로 필터링된 확인했다D PeptideProphet 및 ProteinProphet [시스템 생물학 연구소 (ISB)]로 표시됩니다. PeptideProphet는 펩타이드 임무가 그것의 SEQUEST 점수 (Xcorr, ΔCn, SP, RSp) 및 식별된 각 펩타이드 시퀀스의 추가 정보 기반의 "올바른"대 "잘못"이라는 포괄적인 확률 (P) 점수를 추정하고있다. ProteinProphet은 MS / MS 스펙트럼에 할당 펩티드에 기초하여 각각의 단백질에 대해 0에서 1로 확률 점수를 계산합니다.
- 거짓 긍정적인 식별을 최소화하기 위해 우리는 엄격한 필터 기준을 사용. 첫째, 최소한의 P 점수 컷오프은 매우 낮은 오류 (훨씬 적은 3보다 %)와 합리적으로 좋은 감도를 보장하기 위해 모든 인정된 펩타이드에 대해 0.8에서 설정됩니다. 1.9, 1에 대해 2.2 및 3.0, 2 및 3 요금 : 둘째,> 0.8 P 점수를 가진 모든 펩티드가 높은 교차 상관 관계 (Xcorr) 동시에 점수를 가지고 있어야합니다.
5. LLUF 프로브로 구강 박테리아 제거
- 을 제거 LLUF 프로브의 기능을 확인하려면구강 박테리아, LLUF 프로브 수집 (제 3) 전후에 타액은 세균의 검출을위한 한천 플레이트에 확산되었다.
- 에어로빅 박테리아는 하루를 위해 37 ° C에서 항생제없는 Lauria-Bertani (LB) 한천 플레이트에서 성장했다.
- 무산소 박테리아는 하루 37 ° C에서 가스 박을 (BD Biosciences, 산호세, CA)를 사용하여 혐기성 조건 하에서 항생제가없는 브루셀라속의 국물 한천 플레이트 (BD, 스파크, MD)에서 성장했다.
6. 대표 결과
1. 모방 구강 환경에서 LLUF 프로브 및 샘플링 타액의 제작
샘플링 타액이 롤리팝을 빠는으로 수행할 수있는 경우 절차는 수집 장치 13-14에서 spitted 타액의 저하를 막을 수있을 겁니다. 중요한 것은, 그것은 또한 구강 충치로부터 동적으로 로컬 환자를 모니터링 할 수있게됩니다. 타액을 사용하여 샘플 준비가 간소화 될 수있다면 또한, 임상 쉽게 facil 것다음 임상 작업에 자신의 결정을 신속히하기위한 절차를 itate. 질량 분석법은 짧은 시간 동안 시퀀스 단백질을 감지조차 가장 민감한 기법 중 하나입니다. 그러나, 샘플 준비를위한 복잡한 절차는 병원에서이 기술을 사용하여 방해했습니다. 또한, 그것은 알려져 그 질량 spectrometric 분석 15-16에서는 임상 샘플에 고분자 중량 (타액의 아밀라아제 예) 마스크 낮은 풍부 단백질 높은 풍부한 단백질 또는 단백질. 위에서 언급한 장애물을 극복하기 위해 우리는 LLUF 프로브 (그림 1)이라는 롤리팝 같은 ultrafiltration 장치를 개발했다. 30 kDa (그림 1A,)는 폴리 프로필렌 패들 (그림 1A, B)에 붙어되었다에서 MWCO와 부정 청구 polyethersulfone 막. 그것은 타액에 큰 단백질을 걸러의 의도로 LLUF 프로브 앞에 배치되었다. 인간의 구강 환경 (그림 1A, G를 모방하려면), 스펀지 (그림 1A, 전자)가 문화 접시 (그림 1A, F)에서 타액에 젖었습니다. 완전히 주사기 (그림 1A, D)를 철수 후, 여과 타액이 연결된 튜브 (그림 1A, C)를 따라 이동하기 시작하고 수집했다.
2. NanoLC-LTQ MS에 의한 토착 침이 peptidome의 식별
LC chromatograms을 비교, 우리는 서로 다른 단백질 성분이 LLUF 샘플링 후 타액에있다는 것을 나타냅니다 LLUF 샘플링 (그림 2) 전후의 타액의 독특한 chromatograms을 발견. 단백질 성분을 확인하려면, 우리는 여러 단백질 혼합물로부터 즉시 시퀀스 펩티드 수있을 것으로 알려져 있습니다 NanoLC-LTQ 질량 분광법을 채용. 더 중요한 건, 임상 목적을위한 시료 준비를 단순화하기 위해, 화학적 또는 효소 소화하지 않고 전체를 타액은 NanoLC-LTQ MS 분석에 적용되었다. 예기치 131 펩티드 우리다시 소화되지 않은 타액 (보충 표 1)에서 확인. 이 펩티드는 다양한 프롤린 풍부한 단백질, actin, 알파 아밀라아제, 알파 1 globin, 베타 globin, histain 1, 케라틴 1, mucin 7, 고분자 면역 글로불린 수용체, satherin 및 S100A9에서 파생된 파편입니다. 스물 여섯 독특한 펩티드는 LLUF 프로브 (보충 표 2)로 필터링 후 타액에서 발견되었다. 이 펩티드는 주로 다양한 프롤린 풍부한 단백질에서 파생된 파편입니다. 이러한 고분자 면역 글로불린 수용체 (83.24 kDa) 및 알파 아밀라아제와 같은 단백질에서 추출한 펩티드는 크고 풍부한 단백질의 제거에 LLUF 프로브의 능력을 보여주 탐지했다. 알파 - 아밀라아제의 내부 펩타이드에 해당 PFIAIHAEAESKL 펩타이드의 MS / MS 스펙트럼은 그림 3A에 그림 있습니다. 대부분의 intriguingly, 큰 단백질을 제거 후, 18 26 호기의 펩티드는 LLUF 프로브 - 샘플 타액 (표에서 감지되었다1). 이러한 18 펩티드는 (P) 프롤린의 죽음과 프롤린 풍부한 단백질이나 가상 단백질에서 파생되었다 -. 글루타민 (Q) (-PQ),-SR,-SP 또는 PP의 C-말단 그림 3B는 MS / MS를 보여주 LLUF 프로브 - 샘플 타액에서 검출되었다 PQGPPQQGGHPRPP의 펩타이드의 스펙트럼. 펩타이드는 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과 1과 2 (표 1)에서 파생된 수 있습니다.
1 그림. LLUF 프로브과 인간의 구강을 모방으로부터 전체 타액 샘플의 작곡 패널 :. () 30 kDa의 MWCO있는 반 투과 polyethersulfone, (B) 폴리 프로필렌 패들, (C) 테플론 플루오르 에틸렌 프로필렌 튜브; (D) 20 ML의 주사기는 패널 B :. 스폰지가 (E) (했었 혀) 만드는 인간의 타액을 포함하는 문화 요리 (F)에 젖었습니다인조 인간의 구강 (G). 완전히 주사기를 철수하여 만든 결과 부정적인 압력이 주사기 내에 연결된 튜브 (화살표)를 따라하며 만든 공간 (화살촉) 방향으로 이동 수집된 유체를 조절합니다. 바 : 2.0 cm.
그림 2. LLUF 샘플링 전후 타액의 차동 LC / MS / MS chromatograms. 단백질 (1.0 μg / μl) 인간의 전체 타액에는없이 또는 LLUF 프로브와 필터링되었습니다. tryptic 소화없는 단백질은 직접 재료와 방법에 설명된대로 Eksigent 나노 LC 시스템과 복합이었다 NanoLC-LTQ MS를 받게되었다. 타액의베이스 - 피크 chromatograms은 (44-밈 유지 시간 포함) (A)과 후 (B) LLUF 샘플링은 그림 전에요.
그림 3. Detec전에 NanoLC-LTQ MS 시퀀싱. 타액 단백질 by 침이 peptidome의 기 ()와 (B) LLUF 프로브와 샘플링이 같은 실험 절차에 설명된 NanoLC-LTQ MS에게 의뢰했다 후. tryptic 소화하지 않고 자연적인 인간의 타액에서 파생 침이 peptidome는 보충 표 1과 2에서 시연되었다. 알파 - 아밀라아제에서 유래 펩타이드 (PFIAIHAEAESKL)가 독점적으로 보여주는, LLUF 프로브 (A)와 모음없이 타액 샘플에서 검출되었다 그 큰 단백질 제거에 LLUF 프로브의 능력. -PQ있는 많은 펩티드는,-SR,-SP 또는 PP의 C-테르는 ultrafiltration의 LLUF 프로브 후 샘플에 전적으로 있었다. 다양한 프롤린 풍부한 단백질에서 유래 펩티드 중 하나 (PQGPPQQGGHPRPP)는 (B) 표시되었습니다. MS / MS 특색있는 "Y"와 "B"시리즈 이온과 스펙트럼은 두 펩티드의 신원을 확인했다.
<strong>를 그림 4. LLUF 프로브 동안 사용하는 구강 세균 제거. 재료 및 방법에 설명된대로 LLUF 프로브가 건설되었다. 프로브는 모방 구강 환경 (그림 1) 이내에 인간의 타액에 배치되었다. LLUF 탐침의 끝 부분에 주사기는 침이 샘플링을위한 ultrafiltration 과정을 몰고 부정적인 압력을 만들 철회되었다. 샘플링 기간 동안 전체 타액은 polyethersulfone 막 통해 선택적으로 건넌 주사기 내부에 축적. LLUF 탐침과 시료 채취 전에 전체 타액이 컨트롤을 역임했습니다. LLUF 프로브 샘플링 전후 타액 (10 μl)이 세균 검출을위한 한천 플레이트에 확산되었다 패널 :.와 (+ LLUF)과없는 타액 (+ LLUF) LLUF 프로브 샘플링은 항생제 프리에 나란히 확산되었다 37 LB 한천 플레이트 ° C에서 하루를 위해 패널 B :. LLUF 프로브 샘플링와의없이 타액은 항생제없는 브루셀라속의 국물 한천 플레이트에 확산되었다하루 동안 37 ° C에서 가스 박을 (BD Biosciences, 산호세, CA)를 사용하여 혐기성 조건 하에서. 박테리아는 호기성 제거뿐만 아니라 무산소 구강 박테리아의 LLCF 프로브의 능력을 보여주 LLUF 프로브 - 샘플 타액으로 확산 한천 플레이트에 성장하지 않았다. 바 : 1.0 cm.
| 펩타이드 시퀀스 / 측정된 펩티드 질량 | 가입 번호 | 이름 | |
| 일 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485.3 | GI | 41349484 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 1 이소형 두 전구체 |
| GI | 41349482 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 1 이소형 1 전구체 | ||
| GI | 60301553 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과이 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576.9 | GI | 4,826,944 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과이 |
| GI | 9,945,310 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과 일 | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126.2 | GI | 37537692 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 4 전구체 |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028.3 | GI | 113,423,660 | 예측 : 가상 단백질 |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077.8 | GI | 113,423,262 | 예측 : 가상 단백질 이소형 5 |
| GI | 41349482 | 프롤린 풍부한 단백질 BSTNI의 아과 1 이소형 1 전구체 | ||
| GI | 60301553 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과이 | ||
| GI | 113,423,663 | 예측 : 가상 단백질 | ||
| GI | 41349484 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 1 이소형 두 전구체 | ||
| GI | 41349486 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 1 이소형 3 전구체 | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918.5 | GI | 9,945,310 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과 일 |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131.3 | GI | 113,423,660 | 예측 : 가상 단백질 |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | GI | 113,423,663 | 예측 : 가상 단백질 |
| GI | 41349482 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 1 이소형 1 전구체 | ||
| GI | 113,423,262 | 예측 : 가상 단백질 이소형 5 | ||
| GI | 60301553 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과이 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866.6 | GI | 4,826,944 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과이 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713.8 | GI | 9,945,310 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과 일 |
| GI | 4,826,944 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과이 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083.1 | GI | 9,945,310 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과 일 |
| GI | 4,826,944 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과이 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512.6 | GI | 4,826,944 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과이 |
| GI | 9,945,310 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과 일 | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720.2 | GI | 113,423,262 | 예측 : 가상 단백질 이소형 5 |
| GI | 113,423,663 | 예측 : HYpothetical 단백질 | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450.1 | GI | 9,945,310 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과 일 |
| GI | 4,826,944 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과이 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791.1 | GI | 4,826,944 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과이 |
| GI | 9,945,310 | 프롤린 풍부한 단백질 HaeIII의 아과 일 | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186.9 | GI | 113,423,262 | 예측 : 가상 단백질 이소형 5 |
| GI | 41349482 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 1 이소형 1 전구체 | ||
| GI | 60301553 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과이 | ||
| GI | 113,423,663 | 예측 : 가상 단백질 | ||
| GI | 41349484 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 1 이소형 두 전구체 | ||
| GI | 41349486 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 1 이소형 3 전구체 | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720.3 | GI | 113,423,663 | 예측 : 가상 단백질 |
| GI | 41349482 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 1 이소형 1 전구체 | ||
| GI | 113,423,262 | 예측 : 가상 단백질 이소형 5 | ||
| GI | 60301553 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과이 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870.9 | GI | 37537692 | 프롤린 풍부한 단백질 BstNI의 아과 4 전구체 |
표 1. 펩티드는 LLUF - 수집된 샘플에 독점적으로 감지했다.
보충 표 1. 보충 표에게 1 보려면 여기를 클릭하십시오 .
보충 표 2. 보충 표 2를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
우리는 많은 펩타이드 조각은 인간의 소화되지 않은 타액에 존재하는 것으로 확인되었습니다. 이러한 펩타이드 조각은 프롤린 풍부한 단백질, actin, 알파 아밀라아제, 알파 1 globin, 베타 globin, histain 1, 케라틴 1, mucin 7, 고분자 면역 글로불린 수용체, satherin, S100A9 다양한 형태의 파생 상품입니다. 불확 실한 절단 사이트와 펩티드의 생산에 기여 여러 가지 요인이있을 수 있습니다. 예를 들어, 일부 펩타이드 조각은 인간의 전체 타액에서 자연스럽게 나타날 수 있습니다. C-테르-PQ있는 많은 펩티드는 (표 1과 보충 표 1과 2) 식별되었다. 프롤린 풍부한 단백질은 산성, 기본 또는 glycosylated 단백질로 분류 할 수 있으며, 단일 지역 17에 클러스터된 여섯 유전자에 의해 인코딩됩니다. allelic 편차, 차동 RNA의 접합, proteolytic 처리 및 사후 translational 개조 17 일부터 더보기 30여 가지 프롤린 풍부한 단백질 결과. 분비 후, 산성 프롤린 풍부한 보호해주는eins는 급속하게 치아 표면과 치아 플라크의 proteolysis 18-19 의한 잠재적인 타고난 면역 펩티드로 저하에 붙어있다. 두 그람 음성 및 그람 양성 세균은 glycosidases 및 프로 테아제 18 다양한 표현. 그것은 산성 프롤린 풍부한 단백질이 구강 연쇄상 구균 및 Actinomyces 종 18에 의한 잠재적인 타고난-면역과 같은 펩티드로 강등 될 수 있다고보고되었습니다. 글루타민 (Gln) - 글리신 (Gly) 절단은 침의 산성 프롤린 풍부한 단백질과 세균 바인딩-PQ의 C-말단 18, 20-22의 생산 세균의 저하와 관련하여 생물학적으로 중요합니다. -PQ의 바인딩은 박테리아에 프롤린 풍부한 단백질 테르는 합성 RGRPQ pentapeptide 18를 사용하여 시험 관내 실험에 의해 확인되었다. 우리의 데이터 계약에 SJ 피셔의 그룹은, 소화되지 않은 인간의 귀밑샘 침 23 C, 테르-PQ 여러 펩티드를 식별할 수 있었다C-테르-PQ 여러 펩티드를 제안하는 것은 indigenously 인간 전체를 타액에 존재하는 수도 있습니다. 인간의 타액은 - PQ와 여러 펩티드를 포함 펩티드 18, 19 타고난-면역과 같은 역할 있습니다 C-테르. 구강 세균이 존재하면, 프롤린 풍부한 단백질은 순식간에 효율적으로 박테리아를 죽이기 위해서는 C, 테르-PQ와 함께 다양한 조각으로 분해됩니다.
소화되지 않은 타액에 존재하는 펩타이드 조각을위한 또 하나의 이유는 전체 타액에있는 내생적인 프로 테아제의 일부 샘플 준비 24-25 동안 활성 상태로 유지 수 있습니다. 구강의 내생적인 프로 테아제에 의해 이러한 단백질에서 발생 절단 가능성이 대량 분광 분석을하기 전에 계속했다. 예를 들어, mucin은 세균성 통관 26보다 경쟁력있는 작은 형태로 다운 타액 단백 분해 효소에 의해 죽습 수 있습니다. 그것은 또한 가능하다는 것을 구강 박테리아의 프로 테아제 5 월 쪼개다 침이 collectio 전후 구두 단백질N. 그것은 여러 타액 단백질이 구강 연쇄상 구균 및 Actinomyces 종 27-29에서 프로 테아제에 의해 처단 수 있도록 문서화되었습니다.
반 투과 막가 LLUF 프로브의 핵심 구성 요소입니다. 멤브레인 선택적으로 단백질, 구강 박테리아와 부스러기를 포함한 더 큰 물질을 제거할 필요가 있습니다. LLUF는 특정 구성 요소의 통과를 허용하고 인공 구강 내에 다른 컴포넌트를 거부하는 선택적 장벽 역할을합니다. 반 투과 막가 macromolecules를 제외하면서 작은 분자가 세포막을 통과하실 수 있습니다. 저희 연구실에서 최근의 데이터는 LLUF 프로브 효과적으로 호기성 및 혐기성 모두 구강 박테리아 (그림 4)을 제거할 수 있는지 보여주었다. LLUF 프로브와 수집 전후에 타액 표본은 항생제가없는 한천 플레이트에 확산 및 호기성과 혐기성 조건 하에서 incubated되었다. 한천 플레이트가 LLUF으로 확산되었을 때 박테리아가 자라지 않는 군 프로브 -호기성 및 혐기성 구강 박테리아 제거에 LLUF 프로브의 기능을 시연, 타액을 채집. 우리는 인간의 구강 미생물의 단백질 데이터베이스를 포함하지 않은 인간의 데이터베이스와 모든 스펙트럼을 검색했습니다. 모든 구강 미생물과 포괄적인 단백질 데이터베이스를 설정할 수있다면 구강 미생물의 프로테옴 / peptidome의 식별이 가능 될 것이다. 유기 (polyethersulfone) 멤브레인는 LLUF 프로브를 조작하는 데 사용되었다. 멤브레인은 30 kDa MWCO을하는 것으로 알려져되었지만, 샘플링 성능 또한 멤브레인 표면 30 일에 부정적인 요금 타액 단백질의 상호 작용과 같은 다른 요인에 의존. 산도 가치와 온도뿐만 아니라 구강에있는 단백질의 복잡의 변화는 또한 샘플링 성능에 영향을 미칩니다. 우리의 데이터는 18 펩티드는 LLUF 프로브 - 샘플 타액 (표 1)에서 단독으로 존재라고 보여주었다. 펩티드는 함께-PQ를 종료,-SR,-SP 또는 PP는 C-테르 주로 프롤린 풍부한 P에서 파생됩니다roteins. 그것은 그물이 부정적인 프롤린 풍부한 단백질은 부정 청구 표면에 31 강한 흡착을 표시 요금이 청구되는 것으로보고되었습니다.
요약에서 LLUF 프로브 앞 미래 반 투과 세포막에서 단백질의 특정 그룹을 감지하기 위해 서로 다른 표면 요금을 가지고 다양한 기공 크기와 재료를 사용하여 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 기공 크기로 nanofiltration의 점막은 0.05 미크론에서 1 나노미터로 범위는 타액 샘플을 32 바이러스를 분리할 수 있습니다. LLUF 프로브는 또한 타액 샘플에 포도당과 젖산 등 다양한 물질의 농도를 모니터링을 위해 적용할 수 있습니다. ultrafiltration의 점막이 원심 ultrafiltration 33를 통해 단백질 분리의 사용을 만들었지만, 그들은 거의 반 투과 막에 걸쳐 부정적인 압력의 적용을 통해 단백질을 수집하는 데 사용되지 않았습니다. 같은 푸리에 t 같은 고급 질량 분석계로 LLUF 프로브를 연결ransform 이온 사이클로 트론 공명 (FT-ICR)은 그대로 타액의 신분은 34-35을 단백질을 허용할 수 있습니다. 특히, 타액 프로테옴 및 peptidome의 동적 패턴의 온라인 분석 LLUF 프로브의 임상적 응용 프로그램에 대한 필수적인 것입니다. LLUF 프로브와 수거 후, 프롤린 풍부한 단백질에서 파생된 많은 펩티드 조각이 소화되지 않은 전체 타액에서 발견되었다. 프롤린 풍부한 단백질은 치과 카리 에스 36 개발에 영향을하고 바이러스성 감염 37에서 점막 표면을 보호하는 의미있을 수 구강 박테리아와 상호 작용할 수 있습니다. 또한, 그것은 프롤린 풍부한 단백질의 표현이 류마티스 관절염 환자 38 변경되었음을 문서화되었습니다. 이러한 연구는 강력히 LLUF 프로브에 의해 수집된 프롤린 풍부한 단백질은 다양한 인간 질병을 모니터하는 생체 역할을 수있는 지원합니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 보조금의 국립 연구소 (R01-AI067395-01, R21-R022754-01, 그리고 R21-I58002-01)에 의해 지원되었다. 우리는 원고의 비판적 읽기를 위해 C. Niemeyer 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
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