Summary
将来の臨床応用のための唾液採取を考慮して、ロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブは、ヒトの口腔内に収まるように作製した。ナノLC-LTQ質量分析法による消化唾液の直接分析は、大規模なタンパク質や高濃度タンパク質を除去し、低豊富なペプチドは多くの検出可能なようにするLLUFプローブの能力を実証した。
Abstract
ヒト唾液プロテオームとペプチドーが1-2を明らかにされているが、それらはすぎなかったトリプシン唾液タンパク質の消化物から同定された。外因性の酵素による事前消化せずにヒト唾液の先住民族ペプチドーの同定は、ヒト唾液でネイティブペプチドが疾患の進行を予測し、治療効果を監視し、病気を診断するための潜在的な値を提供するので、必須となります。適切なサンプリングは、人間の土着の唾液ペプチドーの識別の強化のための重要なステップです。 3から4の残骸を削除するには、遠心分離を含むヒト唾液をサンプリングする従来の方法は時間がかかりすぎるの臨床使用のために適用可能であることかもしれません。さらに、遠心分離による瓦礫撤去は、感染した病原体のほとんどをきれいにし、多くの場合、低濃度のペプチドーの識別を妨げる高濃度タンパク質を除去することができない場合があります。
PRI、従来のプロテオミクス的手法marilyゲル内消化との結合の二次元ゲル電気泳動（2-DE）ゲルは多くの唾液タンパク質の5-6を識別することができる利用しています。しかし、このアプローチは、一般的に低濃度のペプチド/タンパク質を検出するのに十分な小文字は区別されません。液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）ベースのプロテオミクス前の2-DE分離することなくタンパク質を識別することができる代替手段です。このアプローチは、より高い感度を提供していますが、それは一般的に臨床使用が困難になってトリプシンと以前のサンプルプレ分画7とプレ消化を必要とします。
サンプル調製のために質量分析の妨害を回避するために、我々は、キャピラリ限外濾過（CUF）プローブ8から11と呼ばれる技術を開発しました。我々の研究室からのデータは、CUFプローブは、ダイナミックかつ低侵襲な方法8の動物の様々な微小環境から、生体内でタンパク質を捕捉することが可能であることを実証-11。負圧は、サンプル収集中に撤退単に注射器によって作成されているので全く遠心分離は必要ありません。 LC-MSを組み合わせたCUFプローブが成功したトリプシン消化し たタンパク質の8-11を同定した。本研究では、簡単に人間の口腔内に収まることができロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブを作成することにより、限外ろ過サンプリング技術をアップグレードしました。トリプシン消化せずにLC-MSによる直接分析では、国産ヒト唾液は様々なタンパク質に由来する多くのペプチド断片が含まれていることを示した。 LLUFプローブと唾液をサンプリングする遠心分離を避けますが、効果的に多くの大規模、高濃度タンパク質を除去。私たちの質量分析の結果は、多くの低濃度のペプチドはLLUFプローブで大きなタンパク質をフィルタリングした後に検出されなったことを示す。低濃度の唾液ペプチドの検出は、クロマトグラフィーを持つ複数のステップのサンプルの分離独立していた。臨床応用のために、LLUFプローブが組み込まれてLC-MSとdが潜在的に唾液から疾患の進行を監視するために、将来的に使用することができます。
Protocol
1。 LLUFプローブの作成
- ポリエーテルスルホン膜（2 cm 2の ） はパドルの境界線上にエポキシ樹脂接着膜により三角形のポリプロピレン製パドル（カリフォルニア大学サンディエゴ校）で密封した。 30 kDaの分子量カットオフ（MWCO）と負に帯電したポリエーテルスルホン膜を用いた。
- LLUFプローブは20 mlの注射器に接続することができますので、テフロンフッ素化エチレンプロピレンチューブ（内径/外径、0.35/0.50 cm）の三角形のポリプロピレンパドルのシリンダの出口に取り付けた。
- 培養皿（直径50mm）にヒト唾液中にポリエーテルスルホン膜を浸漬した後、負圧が注射器を取り出すことにより作成されました。負圧と注射器は、唾液からタンパク質をサンプリングするための限外ろ過プロセスを運転した。
- プローブは使用する前に、一晩70％アルコールで滅菌した。適切なシールを実証するために、我々触構造にLLUFプローブを配置し2時間2,000 kDaの平均分子量とブルーデキストラン（50 mg / ml）を含むる。採取した試料のブルーデキストランの不在は、漏れは、プローブの作製、サンプリング中に開発されないことを示した。
2。唾液コレクション
- 全唾液は6歯肉炎や虫歯のない明白な徴候で、全く薬を服用していない3つの健康なボランティア（年齢20〜40の間に2つの男性と一人の女性）から採取した。
- 水で口をすすいだ後、唾液サンプルは氷冷した容器に、化学的刺激なしで、唾によって収集された。
- すべてのサンプルが収集手順の実行中にプールし、そして氷上で保持した。
- すぐに収集した後、唾液（200μl）をLLUFプローブとサンプリングを適用した。サンプリングは4℃の部屋で行った。
- LLUFプローブコレクションの有無に関わらず唾液タンパク質は、（は1.0μg/μl）を直接ナノLC-マスsに行ったトリプシン消化せずにpectrometry分析。タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイ12を用いて測定した。
3。ナノLC-LTQ MS分析
- 非消化唾液サンプル（5μl）を直接（2％アセトニトリル％ギ酸）100％のバッファを使用して、オートサンプラでEksigentナノLCシステムのトラップカラムにロードされていました。ナノLCをオンラインでフィニガンLTQ質量分析計を結合させた。
- サンプルがロードおよび洗浄した後、バルブを切り替えていた、500 NL / minの線形勾配はトラップと分離カラム（長さ10cm、100μmのID、社内でSynergi4μmのC18を充填）に配信されました。勾配は0〜50％の緩衝液B（80％アセトニトリル％ギ酸）から45分であった。
- ナノLC-LTQ MS機器はXcaliburすることにより、データ依存モードで動作しました。 1×10 5の強さ上記4最強のMSイオンのMS / MSスペクトルは、動的な除外で収集された有効になっており、衝突エネルギーは35％に設定。
- 各サンプルは、ナノLC-LTQ MSシステムで二回実行されました。 3つの別々の製剤からのサンプルを使用した。 3つの別々のサンプルで検出可能なもののペプチドは、 補足表1および表2に記載されていた。ナノLC-LTQ MSスペクトルの代表は、 図3に示された。
4。データ解析とタンパク質のデータベース検索
- 各RAWファイルはReadw.exeを使用してmzXMLファイルに変換されました。
- mzXMLファイルがSEQUESTソーサラー2システムに入力されたバイオテクノロジー情報（NCBI）の非酵素特異性を用いたタンパク質データベースに対応するナショナルセンターから生成された人間のデータベースに対して検索されます。プリカーサイオンの質量の許容差は、1.5ダで設定されていました。 16 Daの分子量は、酸化のためのアカウントへの差を検索するためのメチオニンに追加されました。
- SEQUESTの検索後、結果が自動的に検証され、ろ過したD PeptideProphetとProteinProphet [システムバイオロジー研究所（ISB）]で表示されます。 PeptideProphetは、ペプチドの割り当てはそれSEQUESTスコア（xcorrは、ΔCn、SP、RSP）と同定された各ペプチド配列の追加情報の拠点に "正しい"と "正しくない"であることを包括的な確率（P）スコアを推定します。 ProteinProphetは、MS / MSスペクトルに割り当てられたペプチドに基づいて、各タンパク質の1から0に確率スコアを計算した。
- 偽陽性の識別を最小限に抑えるために我々は、厳格なフィルタ基準を使用していました。まず、最低限のP得点のカットオフは非常に低いエラー（多くは3％未満）と合理的に良好な感度を確保するための任意の受け入れペプチドを0.8に設定されています。 1.9 1 2.2、3.0、+2、+3料金：秒、> 0.8 Pのスコアを持つすべてのペプチドは、高い相互相関（xcorrを）同時にスコアを持っている必要があります。
5。 LLUFプローブによる口腔細菌の除去
- 削除するには、LLUFプローブの能力を決定するために、口腔内細菌、LLUFプローブコレクション（セクション3）の前後に唾液は、細菌を検出するための寒天プレート上に広げた。
- 好気性細菌は、一日のために37℃で、抗生物質フリーラウリア - ベルターニ（LB）寒天プレート上で生育させた。
- 嫌気性細菌は、一日37℃でガスパックを（BD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して、嫌気的条件下で抗生物質フリーブルセラブロス寒天プレート（BD、火花、MD）上で生育させた。
6。代表的な結果
1。模倣口腔環境でLLUFプローブとサンプリング唾液の作製
サンプリング唾液はロリポップを吸うようにして行うことができる場合、プロシージャは、収集デバイス13-14にspitted唾液の劣化を避けることができます。重要なのは、それはまた、口腔内から動的に、ローカルで患者を監視することが可能になります。唾液を用いた試料調製を簡略化することができればさらに、臨床医は、簡単にfacilう次の臨床操作上の意思決定を促進するための手順を実行しitate。質量分析は、時間の非常に短い期間で検出し、さらに配列の蛋白質に最も敏感な技術の一つである。ただし、サンプル調製のための複雑な手順は、診療所でこの手法を使用して妨げている。さらに、マスク低濃度のタンパク質は、質量分析15-16に（唾液中のアミラーゼなど）臨床サンプル中の高分子量で高い豊富な蛋白質や蛋白質が知られている。上記のハードルを克服するために、我々はLLUFプローブ（ 図1）という名前のロリポップのような限外濾過装置を開発しました。 30kDaの（ 図1A、1）のMWCOと負に帯電したポリエーテルスルホン膜がポリプロピレンパドル（ 図1A、B）に釘付けになった。それは唾液中に大きなタンパク質をフィルタリングすることを意図してLLUFプローブの前面に配置されました。ヒト口腔環境（ 図1A、Gを模倣する）、スポンジ（ 図1A、e）は培養皿（ 図1A、f）に唾液中に浸漬した。完全に注射器（ 図1A、d）を撤回した後、濾過し、唾液は、接続管（ 図1A、C）に沿って移動開始し、収集した。
2。ナノLC-LTQ MSによる土着の唾液ペプチドーの同定
LCクロマトグラムを比較すると、我々はLLUFサンプリング後の唾液中の異なるタンパク質の組成があることを示す、LLUFサンプリング（ 図2）の前後に唾液の個別のクロマトグラムを発見した。タンパク質組成を決定するために、我々は、複数のタンパク質混合物から速やかに配列のペプチドできることが知られているナノLC-LTQ質量分析法を採用しています。さらに重要なことは、臨床目的のための試料調製を簡素化するために、化学的または酵素消化せずに全唾液は、ナノLC-LTQ MS分析に適用した。不意に、131ペプチド我々再消化唾液（ 補足表1）で識別される。これらのペプチドは、様々なプロリンリッチタンパク質、アクチン、α-アミラーゼ、α1グロビン、βグロビン、histain 1、ケラチン1、ムチン7、高分子免疫グロブリン受容体、satherin、およびS100A9から派生した断片である。二十六ユニークなペプチドはLLUFプローブ（ 補足表2）でフィルタリングした後に唾液中に同定された。これらのペプチドは、主に様々なプロリンリッチタンパク質から派生した断片である。このようなポリマー免疫グロブリン受容体（83.24 kDa）とα-アミラーゼなどのタンパク質由来のペプチドは、大規模と豊富なタンパク質の除去LLUFプローブの能力を実証し、検出されなかった。 α-アミラーゼの内部ペプチドに対応するPFIAIHAEAESKLペプチドのMS / MSスペクトルは、 図3Aに示されています。最も興味深いことに、大きなタンパク質を除去した後、26塩基配列のペプチドの18 LLUFプローブサンプリング唾液（ 表で検出可能になりました1）。これらの18のペプチドは、プロリン（P）で終わったプロリンリッチタンパク質または仮想タンパク質から派生した-グルタミン（Q）（-PQ）、-SR、-SPまたは-PP C末端図3Bは、MS / MSを示したLLUFプローブサンプリング唾液で検出されたPQGPPQQGGHPRPPペプチドのスペクトル。ペプチドは、プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1と2（ 表1）に由来することができます。
図1。 LLUFプローブと人間の口腔内を模倣から全唾液のサンプリングの組成物 パネル：（1）30 kDaのMWCOを持つ半透性ポリエーテルと、（b）ポリプロピレンパドルと、（c）テフロンフッ素化エチレンプロピレンチューブ。 （d）に20 mlの注射器パネルB：スポンジ（E）（模倣舌）を作成するためにヒト唾液を含む培養皿（F）に浸漬した人工的な人間の口腔（g）を得た。完全にシリンジを取り出すことにより作成された結果の負圧は、シリンジ内で接続管（ 矢印 ）に沿って作成された領域（ 矢印 ）に向かって移動するには収集された流体を駆動します。バー：2.0センチメートル。
図2。 LLUFサンプリング前と後の唾液の差動LC / MS / MSクロマトグラムタンパク質（は1.0μg/μl）のヒト全唾液ではなく、またはLLUFプローブでろ過した。トリプシン消化せずにタンパク質は、直接材料と方法に記載されEksigentナノLCシステムと結合させたナノLC-LTQ MSに供した。唾液のベースピーククロマトグラム（44-MIMの保持時間を含む）の前に（）と後（B）LLUFサンプリングが示された。
図3。 DetecナノLC-MS LTQシーケンシングによって唾液ペプチドーのる。唾液タンパク質の前に（）と後（B）LLUFプローブとサンプリングは、実験方法に記載のナノLC-LTQ MSで分析した。トリプシン消化せずに自然な人間の唾液から派生した唾液ペプチドーは、 補足表1と表2に示されました。 α-アミラーゼに由来するペプチド（PFIAIHAEAESKL）が排他的に大規模なタンパク質を除去するのにLLUFプローブのその能力を示す、LLUFプローブ（）を使用してコレクションすることなく唾液サンプルで検出された。 -PQ多くのペプチドは、-SR、-SPまたは-PP C-末端は、限外ろ過LLUFプローブ後のサンプルではもっぱらでした。様々なプロリンリッチタンパク質由来のペプチドのいずれか（PQGPPQQGGHPRPP）は（B）が示された。特性は "y"と "b"シリーズイオンとMS / MSスペクトルは、両ペプチドのアイデンティティを確認した。
<強い>図4。LLUFプローブの間に使用し口腔内細菌の除去。材料および方法に記載されLLUFプローブを構築した。プローブは真似口腔環境（ 図1）内にヒト唾液中に配置された。 LLUFプローブの端にシリンジは唾液採取のための限外ろ過プロセスを運転した負圧を作成するために撤回された。サンプリング中、唾液には、ポリエーテルスルホン膜を介して選択的に交差させ、注射器の内部に蓄積された。 LLUFプローブによるサンプリングする前に全唾液には、コントロールを務めた。 LLUFプローブのサンプリング前と後の唾液（10μl）を細菌検出用寒天プレート上に広げたパネル 。と（+ LLUF）とせずに唾液（+ LLUF）LLUFプローブのサンプリングは、抗生物質フリーでサイド·バイ·サイドを広げた37℃でLB寒天プレート°C一日のためにパネルB：LLUFプローブのサンプリングの有無にかかわらず唾液は抗生物質フリーブルセラブロス寒天プレート上に広げました一日37℃でガスパックを（BD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して、嫌気的条件下で。細菌は好気性と同様に嫌気性口腔内細菌を排除することにLLCFプローブの能力を実証し、LLUFプローブサンプリング唾液で広がって寒天プレート上で成長していませんでした。バー：1.0センチメートル。
| ペプチド配列/測定ペプチドの質量 | 受入番号 | 名 | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485.3 | GI | 41349484 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1イソ型2前駆体 |
| GI | 41349482 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム1前駆体 | ||
| GI | 60301553 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576.9 | GI | 4826944 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2 |
| GI | 9945310 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1 | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126.2 | GI | 37537692 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー4前駆体 |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028.3 | GI | 113423660 | 予測：仮想タンパク質 |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077.8 | GI | 113423262 | 予測：仮想タンパク質アイソフォーム5 |
| GI | 41349482 | プロリンリッチタンパク質のBstNIサブファミリー1アイソフォーム1前駆体 | ||
| GI | 60301553 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー2 | ||
| GI | 113423663 | 予測：仮想タンパク質 | ||
| GI | 41349484 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1イソ型2前駆体 | ||
| GI | 41349486 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム3前駆体 | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918.5 | GI | 9945310 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1 |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131.3 | GI | 113423660 | 予測：仮想タンパク質 |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | GI | 113423663 | 予測：仮想タンパク質 |
| GI | 41349482 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム1前駆体 | ||
| GI | 113423262 | 予測：仮想タンパク質アイソフォーム5 | ||
| GI | 60301553 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866.6 | GI | 4826944 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713.8 | GI | 9945310 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1 |
| GI | 4826944 プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083.1 | GI | 9945310 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1 |
| GI | 4826944 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512.6 | GI | 4826944 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2 |
| GI | 9945310 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1 | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720.2 | GI | 113423262 | 予測：仮想タンパク質アイソフォーム5 |
| GI | 113423663 | 予測：HYpotheticalタンパク質 | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450.1 | GI | 9945310 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1 |
| GI | 4826944 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791.1 | GI | 4826944 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー2 |
| GI | 9945310 | プロリンリッチタンパク質HaeIIIでサブファミリー1 | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186.9 | GI | 113423262 | 予測：仮想タンパク質アイソフォーム5 |
| GI | 41349482 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム1前駆体 | ||
| GI | 60301553 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー2 | ||
| GI | 113423663 | 予測：仮想タンパク質 | ||
| GI | 41349484 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1イソ型2前駆体 | ||
| GI | 41349486 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム3前駆体 | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720.3 | GI | 113423663 | 予測：仮想タンパク質 |
| GI | 41349482 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー1アイソフォーム1前駆体 | ||
| GI | 113423262 | 予測：仮想タンパク質アイソフォーム5 | ||
| GI | 60301553 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870.9 | GI | 37537692 | プロリンリッチタンパク質BstNIサブファミリー4前駆体 |
表1ペプチドは、LLUF、収集されたサンプルで排他的に検出可能であった。
補足表1。 補足表1を見るにはここをクリック 。
補足表2。 補足表2を見るにはここをクリック 。
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Discussion
我々は、多くのペプチドフラグメントは、人間の消化唾液中に存在することを発見した。これらのペプチド断片は、プロリンリッチタンパク質、アクチン、α-アミラーゼ、α1グロビン、βグロビン、histain 1、ケラチン1、ムチン7、高分子免疫グロブリン受容体、satherin、S100A9の様々なフォームからの誘導体である。未定の切断部位を有するペプチドの生産に貢献する多くの要因があるかもしれません。たとえば、いくつかのペプチド断片は、ヒト全唾液中に天然に存在するかもしれません。 C-末端-PQ多くのペプチドは、（ 表1と補足表1および2）を同定した。プロリンリッチタンパク質は、酸性、塩基性またはグリコシル化タンパク質として分類することができ、単一の領域17にクラスタ化された6つの遺伝子によってコードされている。対立遺伝子変異は、差動RNAスプライシング、タンパク質分解処理、および翻訳後修飾から17以上の30種類のプロリンリッチタンパク質の結果。分泌された後、酸性プロリンリッチPROTアインズは急速に歯面と歯垢のタンパク質分解18から19によって潜在的な先天性免疫ペプチドに分解さに取り付けられている。両方のグラム陰性およびグラム陽性細菌はグリコシダーゼおよびプロテアーゼ18の様々を表現しています。それは酸性プロリンリッチタンパク質が経口球菌と放線菌種 18によって潜在的な生得的な耐性のようなペプチドに分解できることが報告されています。グルタミン（Gln） -グリシン（Gly）切断は、唾液の酸性プロリンリッチタンパク質と細菌の結合-PQ C末端18、20から22の産生細菌による分解に関して生物学的に重要である。 -PQの結合は、細菌へのプロリンリッチタンパク質の末端は、合成RGRPQペンタペプチド18を 用いたin vitro実験で確認された。我々のデータと一致して、SJフィッシャーのグループは、未消化の人間の耳下腺唾液23のC-末端-PQでいくつかのペプチドを同定することができました、いくつかのペプチドを示唆していると、PQ C-末端は、国産ヒト全唾液中に存在する可能性があります。人間の唾液は生得的な耐性の様ペプチド18、19として機能することができるC-末端-PQを持つ複数のペプチドを含んでいます。口腔内細菌が存在する場合は、プロリンリッチタンパク質は、即座に効率的に細菌を殺すためにC-末端-PQで様々な断片に分解することができます。
未消化の唾液中に存在するペプチド断片のもう一つの理由は、唾液中に存在する内因性プロテアーゼのいくつかは、サンプル調製24から25の間アクティブなままかもしれないことがあります。口腔内での内因性のプロテアーゼによって、これらの蛋白質で発生する開裂可能性が高い質量分析の前に続いた。例えば、ムチンは、細菌のクリアランス26のより多くの能力がある小型のフォームに至るまで唾液プロテアーゼによって切断される可能性があります。その口腔内細菌からのプロテアーゼは、5月を切断唾液書*前または後に経口タンパク質も可能です。N。それは、いくつかの唾液タンパク質が口腔内連鎖球菌と放線菌種27から29からプロテアーゼによってみじん切りにすることができる文書化されています。
半透膜は、LLUFプローブの重要なコンポーネントです。膜が選択的に蛋白質、口腔内細菌やごみを含むより大きな物質を除去する必要があります。 LLUFは、特定のコンポーネントの通過を許可し、人工的な口腔内の他のコンポーネントを拒否する選択的なバリアとして機能します。半透膜は、高分子を排除しながら、小さな分子は膜を通過することができます。我々の研究室から最近のデータではLLUFプローブが効果的に好気性および嫌気性の両方口腔内細菌（ 図4）を削除することができることを示した。 LLUFプローブを使用してコレクションの前と後の唾液のサンプルは、抗生物質フリーの寒天プレート上に広げ、好気性および嫌気性条件下でインキュベートした。寒天プレートはLLUFで拡散したときに細菌が増殖しなかったプローブ好気性および嫌気性口腔内細菌を除去するのにLLUFプローブの能力を実証し、唾液をサンプリング。我々は、ヒト口腔微生物のタンパク質データベースが含まれていなかった人間のデータベースとのすべてのスペクトルを検索しました。すべての口腔微生物との包括的なタンパク質データベースを確立することができれば、口腔微生物のプロテオーム/ペプチドーの識別が可能になります。有機（ポリエーテルスルホン）メンブレンをLLUFプローブを作製するために使用されていました。膜は、30kDaのMWCOを持っていることが知られていたが、サンプリング性能はまた、膜面30上に負電荷への唾液タンパク質の相互作用などの他の要因に依存していた。口腔内のpH値と温度の変化だけでなく、タンパク質の複雑さは、サンプリングのパフォーマンスに影響を与えます。我々のデータは、18ペプチドがLLUFプローブサンプリング唾液（ 表1）に独占的に存在していたことを明らかにした。 -PQで終わったペプチド、-SR、-SPまたは-PPは、C末端は、主にプロリンに富むpから導出されroteins。それはネット負に帯電したプロリンリッチタンパク質は負に帯電した表面31への強い吸着を表示することが報告されている。
要約すると、将来的にはタンパク質の特定のグループを検出する試みで、LLUFプローブの前に半透膜は、異なる表面電荷を有する様々な細孔サイズや素材を使用して変更することができます。たとえば、0.05ミクロンから1ナノメートルまでの孔径範囲を持つナノ濾過膜は、32唾液サンプルからウイルスを分離することができます。 LLUFプローブはまた、唾液試料中のグルコースと乳酸などの様々な物質の濃度を監視するために適用することができます。限外ろ過膜は遠心限外ろ過33を介してタンパク質の分離を利用しましたが、それらはほとんど半透膜を介して負圧のアプリケーションを介してタンパク質を収集するために使用されていません。このようなフーリエトンなどの高度な質量分析計でLLUFプローブのリンクransformイオンサイクロトロン共鳴（FT-ICR）は、無傷の唾液タンパク質の34から35の識別を可能にすることができる。特に、唾液プロテオームとペプチドーの動的パターンのオンライン分析がLLUFプローブの臨床応用のために不可欠である可能性があります。 LLUFプローブを使用してコレクションした後、プロリンリッチタンパク質から派生した多くのペプチド断片は、未消化の全唾液から同定された。プロリンリッチタンパク質は、う蝕36の開発に影響を与えるために口腔内細菌と相互作用することができ、ウイルス感染37から粘膜表面を保護する上で重要であるかもしれません。さらに、プロリンリッチタンパク質の発現は関節リウマチ患者38に変更されたことが文書化されています。これらの研究は、強くLLUFプローブによって収集されたプロリンリッチタンパク質は様々なヒト疾患を監視するためのバイオマーカーとして機能することをサポートしています。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、健康補助金の国立研究所（R01-AI067395-01、R21-R022754-01、およびR21-I58002-01）によってサポートされていました。私たちは、原稿の重要な読書のためにC.ニーマイヤーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
