Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Campionamento umana peptidoma Indigenous Saliva Utilizzando un Lollipop-Like Probe ultrafiltrazione: Semplificare e migliorare la rilevazione Peptide per spettrometria di massa Clinica

Published: August 7, 2012 doi: 10.3791/4108

Summary

Considerando campionamento saliva per il futuro l'applicazione clinica, un lecca-lecca-like ultrafiltrazione (LLUF) la sonda è stato fabbricato per adattarsi nella cavità orale nell'uomo. L'analisi diretta di saliva non digerito da nanoLC LTQ-spettrometria di massa ha dimostrato la capacità di sonde LLUF per rimuovere le proteine ​​di grandi dimensioni e di proteine ​​ad alta abbondanza, e rendere a basso abbondanti peptidi più rilevabile.

Abstract

Anche se saliva proteoma umano e peptidoma sono stati rivelati 1-2 sono stati identificati da majorly digerisce trittico di proteine ​​salivari. Identificazione di peptidoma indigeno di saliva umana senza preventiva digestione con enzimi esogeni diventa imperativo, in quanto i peptidi nativi nella saliva umana fornire i valori possibili per la diagnosi della malattia, prevedere la progressione della malattia, e monitorare l'efficacia terapeutica. Di un campione adeguato è un passo fondamentale per la valorizzazione di identificazione delle risorse umane peptidoma saliva indigena. I metodi tradizionali di campionamento saliva umana che coinvolge la centrifugazione per rimuovere i detriti 3-4 potrebbe essere troppo tempo per essere applicabile per uso clinico. Inoltre, la rimozione dei detriti mediante centrifugazione può essere in grado di pulire la maggior parte dei patogeni infetti e rimuovere le proteine ​​molto abbondante, che spesso ostacolano l'individuazione di peptidoma scarsa abbondanza.

Convenzionali approcci proteomici che pripalmente utilizzano bidimensionale elettroforesi su gel (2-DE) gel in coniugazione con in-gel digestione sono in grado di identificare molte proteine ​​saliva 5-6. Tuttavia, questo approccio non è in genere sufficientemente sensibile per rilevare peptidi / proteine ​​poco abbondanti. Liquida cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS) proteomica base è una alternativa che può identificare proteine ​​senza preventiva 2-DE separazione. Sebbene questo approccio fornisce una maggiore sensibilità, deve generalmente campione prima pre-frazionamento 7 e pre-digestione con tripsina, che rende difficile per l'uso clinico.

Per aggirare l'ostacolo in spettrometria di massa dovuta alla preparazione del campione, abbiamo sviluppato una tecnica chiamata ultrafiltrazione capillare (CUF) sonde 8-11. I dati del nostro laboratorio hanno dimostrato che le sonde CUF sono in grado di catturare proteine ​​in vivo da diversi microambienti in animali in modo dinamico e minimamente invasiva 8 -11. N centrifugazione è necessario in quanto una pressione negativa viene creata semplicemente siringa ritiro durante il prelievo. Le sonde CUF combinati con LC-MS sono riusciti a identificare le proteine ​​trittico-digerite 8-11. In questo studio, abbiamo aggiornato la tecnica di campionamento ultrafiltrazione con la creazione di un lecca-lecca-like ultrafiltrazione (LLUF) sonda che può facilmente adattarsi nella cavità orale nell'uomo. L'analisi da LC-MS senza digestione con tripsina ha mostrato che la saliva umana indigenamente contiene molti frammenti peptidici derivati ​​da varie proteine. Campionamento saliva con sonde LLUF evitato centrifugazione, ma rimosso in maniera efficace molte proteine ​​abbondanza più grandi e più alta. I nostri risultati di spettrometria di massa ha evidenziato che molti peptidi poco abbondanti è diventato rilevabile dopo filtrare le proteine ​​più grandi con sonde LLUF. Individuazione di peptidi a basso saliva abbondanza era indipendente multi-fase di separazione campione con cromatografia. Per l'applicazione clinica, le sonde LLUF incorporanod con LC-MS potrebbero essere utilizzati in futuro per monitorare la progressione della malattia da saliva.

Protocol

1. Creazione di sonde LLUF

  1. Le membrane polietersulfone (2 cm 2) sono stati sigillati con pale in polipropilene triangolo (University of California, San Diego) da membrane incollaggio con resina epossidica ai confini della palette. Una membrana carica negativamente polietersulfone con un peso molecolare cut-off (MWCO) a 30 kDa è stato utilizzato.
  2. Un tubo di Teflon fluorurato etilene-propilene (diametro interno / diametro esterno, 0.35/0.50 cm) è stato attaccato ad un cilindro di uscita di una paletta polipropilene triangolo modo che la sonda LLUF può essere collegato ad una siringa da 20 ml.
  3. Dopo l'ammollo la membrana polietersolfone nella saliva umana in un piatto di coltura (50 mm di diametro), la pressione negativa è stato creato da ritirare una siringa. La siringa con pressione negativa ha guidato il processo di ultrafiltrazione per il campionamento delle proteine ​​dalla saliva.
  4. Le sonde sono stati sterilizzati con alcool al 70% durante la notte prima dell'uso. Per dimostrare la chiusura, abbiamo posizionato le sonde LLUF in una soluzionezione contenente blu destrano (50 mg / ml) con una massa molecolare medio di 2.000 kDa per 2 h. L'assenza di blu destrano nei campioni raccolti indicato che non perda sviluppato durante la fabbricazione e la sonda di campionamento.

2. Saliva Collection

  1. Saliva tutto è stato raccolto da tre volontari sani (due maschi e una femmina di età compresa tra 20 e 40) che non prendono farmaci, senza evidenti segni di gengivite o cavità 6.
  2. Dopo aver sciacquato la bocca con acqua, i campioni di saliva intero sono stati raccolti da sputare, senza stimolazione chimica, in un ghiaccio raffreddato vaso.
  3. Tutti i campioni sono stati raggruppati e mantenuto in ghiaccio durante la procedura di raccolta.
  4. Subito dopo la raccolta, la saliva (200 pl) è stata applicata per il campionamento con sonde LLUF. Il campionamento è stato eseguito in una camera 4 ° C.
  5. Proteine ​​della saliva (1,0 mg / mL), con o senza raccolta LLUF della sonda sono stati direttamente esposti al nano LC-massa sAnalisi pectrometry senza digestione triptica. Le concentrazioni di proteina sono state determinate usando un Bio-Rad Protein Assay 12.

3. NanoLC LTQ-MS Analysis

  1. Dalle Nazioni Unite digerite campioni di saliva (5 pl) sono state caricate direttamente alla colonna di scarico del sistema Eksigent nanoLC dal campionatore automatico, utilizzando il 100% tampone A (2% di acido formico acetonitrile/0.1%). Il nanoLC on-line è stato accoppiato con uno spettrometro di massa LTQ Finnigan.
  2. Dopo il caricamento del campione e il lavaggio, la valvola è stata commutata e un 500 nl / min sfumatura lineare è stato consegnato alla trappola e la colonna di separazione (10 cm di lunghezza, 100 id micron, in-house piene di Synergi 4 micron C18). Il gradiente è 0-50% tampone B (80% acetonitrile/0.1% di acido formico) in 45 min.
  3. Le nanoLC-LTQ strumenti MS sono stati operati in modalità dati dipende da Xcalibur. MS / MS spettri dei quattro forti MS ioni sopra una intensità di 1 x 10 5 sono stati raccolti con esclusione dinamicaattivata e l'energia di collisione fissato al 35%.
  4. Ogni campione è stato eseguito due volte dal nanoLC-LTQ sistema di MS. I campioni di tre preparazioni separate sono stati utilizzati. Tali peptidi rilevabili in tre campioni separati sono stati elencati nelle tabelle 1 e 2 supplementari. Rappresentativa di nanoLC LTQ-MS è stato illustrato in Figura 3.

4. Analisi dei dati e la ricerca nel database di proteine

  1. Ogni file RAW è stato convertito in un file utilizzando mzXML Readw.exe.
  2. Il file mzXML è stato inserito in un stregone SEQUEST sistema a 2 e consultati in un database umano generato dal Centro nazionale corrispondente for Biotechnology Information (NCBI) database di proteine ​​utilizzando l'enzima non-specificità. La tolleranza di massa di ioni precursore è stato fissato a 1,5 Da. Una massa molecolare di 16 Da stato aggiunto al metionina per la ricerca differenziale per tenere conto di ossidazione.
  3. Dopo la ricerca SEQUEST, i risultati sono stati filtrati automaticamente, convalidato und visualizzata da PeptideProphet e ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)]. PeptideProphet stima un completo probabilità (P), punteggio che un incarico peptide è "corretta" contro "corretto" sulle basi dei suoi punteggi SEQUEST (Xcorr, ΔCn, Sp, RSP) e ulteriori informazioni di ogni sequenza peptidica identificato. ProteinProphet calcolato un punteggio di probabilità 0-1 per ogni proteina sulla base di peptidi assegnati MS / MS.
  4. Per ridurre al minimo i falsi positivi identificazioni abbiamo utilizzato rigorosi criteri di filtro. Innanzitutto, il minimo cutoff punteggio P è fissato a 0,8 per ogni peptide accettata per assicurare errore molto bassa (meno di 3%) e sensibilità ragionevolmente buona. In secondo luogo, tutti i peptidi con> 0,8 punteggio P deve avere alte cross-correlazione (Xcorr) punteggi allo stesso tempo: 1.9, 2.2 e 3.0 per +1, +2, 3 e carica.

5. La rimozione dei batteri orali con sonde LLUF

  1. Per determinare la capacità di sonde LLUF per rimuovere l'batteri orali, la saliva prima e dopo la raccolta LLUF sonda (sezione 3) è stato diffuso su piastre di agar per la rilevazione batterica.
  2. I batteri aerobici sono state fatte crescere su un antibiotico-free Lauria-Bertani (LB) piastra di agar a 37 ° C per un giorno.
  3. I batteri anaerobici sono state coltivate su un antibiotico senza piastra di agar brodo Brucella (BD, Sparks, MD) in condizioni anaerobiche con Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) a 37 ° C per un giorno.

6. Risultati rappresentativi

1. Fabbricazione di sonde LLUF e saliva di campionamento in un ambiente imitato orale

Se la saliva di campionamento può essere eseguita come succhiare un lecca-lecca, la procedura permetterà di evitare il degrado di saliva sputato in dispositivi di raccolta 13-14. È importante sottolineare che sarà anche diventato possibile monitorare i pazienti in modo dinamico e localmente dalla cavità orale. Inoltre, se la preparazione del campione utilizzando saliva potrebbe essere semplificata, medici sarebbe facilmente facilitate la procedura per accelerare la loro decisione sulla successiva operazione clinica. La spettrometria di massa è una delle tecniche più sensibile per rivelare e anche proteine ​​di sequenza in un periodo di tempo molto breve. Tuttavia, le procedure complicate per la preparazione del campione hanno impedito di utilizzare questa tecnica in clinica. Inoltre, è noto che le proteine ​​abbondanza superiore o proteine ​​con pesi molecolari elevati in campioni clinici (amilasi ad esempio in saliva) proteine ​​abbondanza maschera cost a spettrometria di massa, 15-16. Per superare gli ostacoli di cui sopra, abbiamo sviluppato un lecca-lecca-come il dispositivo di ultrafiltrazione nome sonde LLUF (Figura 1). Una membrana carica negativamente polietersulfone con MWCO a 30 kDa (Figura 1A, a) è stato incollato ad una pala di polipropilene (Figura 1A, B). È stato posizionato davanti della sonda LLUF con l'intenzione di filtrare proteine ​​più grandi nella saliva. Per simulare l'ambiente umano per via orale (Figura 1A, g), Una spugna (Figura 1A, e) è stato impregnato in saliva in un piatto di coltura (Figura 1A, f). Dopo completare il disimpegno della siringa (Figura 1A, d), saliva filtrato iniziato a muoversi lungo un tubo di collegamento (Figura 1A, c) ed è stato raccolto.

2. Identificazione di peptidoma saliva indigena da nanoLC LTQ-MS

Confrontando LC cromatogrammi, abbiamo trovato cromatogrammi distinte di saliva prima e dopo il prelievo LLUF (figura 2), che indica che ci sono composizioni proteiche differenti in saliva LLUF dopo la campionatura. Per determinare le composizioni proteiche, abbiamo impiegato nanoLC LTQ-spettrometria di massa che è noto per poter prontamente peptidi di sequenza da una miscela proteina multipla. Ancora più importante, per semplificare la preparazione dei campioni per scopi clinici, saliva intero senza chimica o digestione enzimatica è stata applicata per nanoLC-LTQ analisi MS. Inaspettatamente, 131 peptidi chere identificato nella saliva non digerito (Supplemental Tabella 1). Questi peptidi sono frammenti derivati ​​da varie proteine ​​ricche di prolina, actina, alfa amilasi, alfa 1 globina, beta globina, histain 1, cheratina 1, mucina 7, recettore di immunoglobulina polimerica, satherin, e S100A9. Ventisei peptidi unici sono stati identificati nella saliva dopo filtrazione con sonde LLUF supplementare (Tabella 2). Questi peptidi sono principalmente frammenti derivati ​​da varie proteine ​​ricche di prolina. Peptidi derivati ​​da proteine ​​come il recettore di immunoglobulina polimerica (83.24 kDa) e alfa amilasi, erano rilevabili, dimostrando la capacità di sonde LLUF in rimozione di proteine ​​più grandi e abbondante. A MS / MS spettro del peptide PFIAIHAEAESKL corrispondente ad un peptide interna di alfa-amilasi è illustrata in Figura 3A. Più intrigante, dopo aver tolto grandi proteine, 18 di 26 peptidi sequenziato è diventato rilevabile nella sonda-campione saliva LLUF (Tabella1). Questi 18 peptidi sono stati derivati ​​da proteine ​​ricche di prolina o proteine ​​ipotetici conclusesi con una prolina (P) -. Glutammina (Q) (-PQ),-SR,-SP-PP o C-terminale figura 3B mostrato una MS / MS spettro del peptide PQGPPQQGGHPRPP che è stato rilevato nella sonda-campione saliva LLUF. Il peptide può essere derivato da proteine ​​sottofamiglia prolina-ricca HaeIII 1 e 2 (Tabella 1).

Figura 1
Figura 1. Composizioni di sonde LLUF e campionamento di saliva umana intero da imitare cavità orale Pannello A: (a) un semi-permeabile polietersulfone con MWCO di 30 kDa, (b) una paletta polipropilene, (c) un tubo di Teflon fluorurato etilene-propilene; (d) una siringa da 20 ml Pannello B:. una spugna (e) (una linguetta mima) è stato impregnato in una piastra di coltura (f) contenente saliva umana per creareartificiale umana cavità orale (g). La pressione negativa risultante creato da completare il disimpegno una siringa spinge il fluido raccolto per muoversi lungo un tubo collegato (freccia) e verso uno spazio creato (freccia) all'interno della siringa. Bar: 2.0 cm.

Figura 2
Figura 2. Differenziale LC / MS / MS cromatogrammi di saliva prima e dopo il campionamento LLUF. Proteine ​​(1,0 pg / pl) in saliva umana intero sono state filtrate senza o con una sonda LLUF. Proteine ​​senza digestione triptica stati direttamente sottoposti a nanoLC LTQ-MS che è stato coniugato con un sistema Eksigent Nano LC come descritto in Materiali e Metodi. La base di punta cromatogrammi (con 44-mim tempi di ritenzione) di saliva prima (A) e dopo (B) LLUF di campionamento sono state illustrate.

Figura 3
Figura 3. DATECzione di peptidoma saliva da nanoLC LTQ-MS. sequenziamento proteine ​​della saliva prima (A) e dopo (B) il campionamento con sonde LLUF sono stati analizzati mediante nanoLC LTQ-MS come descritto nelle procedure sperimentali. Peptidoma saliva derivata da naturale saliva umana senza digestione triptica sono stati dimostrati nelle tabelle 1 e 2 supplementari. Un peptide (PFIAIHAEAESKL) derivato da alfa-amilasi è stata rilevata esclusivamente in un campione di saliva raccolta senza con sonde LLUF (A), che illustra la capacità di sonde LLUF nella rimozione di proteine ​​grandi. Molti peptidi con-PQ,-SR,-SP-PP o C-terminali erano esclusivamente in campioni dopo sonde LLUF ultrafiltrazione. One (PQGPPQQGGHPRPP) di peptidi derivati ​​da varie proteine ​​ricco in prolina hanno mostrato (B). MS / MS con la caratteristica "y" e "B" ioni della serie ha confermato le identità di entrambi i peptidi.

Figura 4
<strong> Figura 4. rimozione dei batteri orali che utilizzano sonde durante LLUF. Una sonda LLUF stato costruito come descritto in Materiali e metodi. La sonda è stata posizionata nella saliva umana in un ambiente imitato orale (Figura 1). La siringa di fine LLUF sonda è stata ritirata per creare una pressione negativa che ha portato il processo di ultrafiltrazione per il campionamento saliva. Durante il campionamento, saliva intera attraversato selettivamente attraverso la membrana polietersolfone e accumulato all'interno di una siringa. Saliva intera prima del campionamento con una sonda LLUF serviva come controllo. Saliva (10 pl) prima e dopo il campionamento LLUF sonda è stata sparsa su piastre di agar per il rilevamento batterica Panel A:. Saliva con (+ LLUF) e senza (+ LLUF) LLUF campionamento sonda è stata diffusa fianco a fianco su un antibiotico-free LB piastra di agar a 37 ° C per un giorno Panel B:. saliva con e senza campionamento LLUF sonda è stata spalmata su un antibiotico senza piastra di agar brodo Brucellain condizioni anaerobiche mediante Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) a 37 ° C per un giorno. I batteri non sono cresciuti su piastre di agar si sviluppa con LLUF sonda-campione di saliva, dimostrando la capacità di sonde LLCF nell'eliminazione aerobica e anaerobica dei batteri orali. Bar: 1.0 cm.

Sequenza peptidica / massa peptide misurato Numero di adesione Nome
1 AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ

2.485,3
gi | 41349484 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 2 precursore
gi | 41349482 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 1 precursore
gi | 60301553 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 2
2 GGHQQGPPPPPPGKPQ
1.576,9
gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
3 GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3.126,2
gi | 37537692 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 4 precursore
4 GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2.028,3
gi | 113423660 Previsto: proteina ipotetica
5 GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2.077,8
gi | 113423262 Previsto: isoforma proteica ipotetica 5
gi | 41349482 Proline-ricchi di proteine ​​BstNI sottofamiglia 1 isoforma 1 precursore
gi | 60301553 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 2
gi | 113423663 Previsto: proteina ipotetica
gi | 41349484 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 2 precursore
gi | 41349486 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 3 precursore
6 GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2.918,5
gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
7 GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2.131,3
gi | 113423660 Previsto: proteina ipotetica
8 GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030
gi | 113423663 Previsto: proteina ipotetica
gi | 41349482 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 1 precursore
gi | 113423262 Previsto: isoforma proteica ipotetica 5
gi | 60301553 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 2
9 GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1.866,6
gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
10 GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1.713,8
gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
11 GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2.083,1
gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
12 GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2.512,6
gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
13 NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2.720,2
gi | 113423262 Previsto: isoforma proteica ipotetica 5
gi | 113423663 Previsto: HYproteine ​​pothetical
14 PQGPPQQGGHPRPP
1.450,1
gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
15 QGRPQGPPQQGGHPRPP
1.791,1
gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
16 SPPGKPQGPPPQ
1.186,9
gi | 113423262 Previsto: isoforma proteica ipotetica 5
gi | 41349482 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 1 precursore
gi | 60301553 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 2
gi | 113423663 Previsto: proteina ipotetica
gi | 41349484 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 2 precursore
gi | 41349486 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 3 precursore
17 SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2.720,3
gi | 113423663 Previsto: proteina ipotetica
gi | 41349482 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 1 precursore
gi | 113423262 Previsto: isoforma proteica ipotetica 5
gi | 60301553 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 2
18 SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1.870,9
gi | 37537692 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 4 precursore

Peptidi Tabella 1. Erano esclusivamente rilevabile in LLUF-raccolto campioni.

Tabella supplementare 1. Clicca qui per vedere Tabella 1 supplementare .

Tabella supplementare 2. Clicca qui per vedere Tabella supplementare 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Abbiamo scoperto che esistono molti frammenti peptidici in saliva umana non digerito. Questi frammenti peptidici sono derivati ​​dalle varie forme di prolina ricchi di proteine, actina, alfa amilasi, alfa 1 globina, beta globina, histain 1, cheratina 1, mucina 7, del recettore immunoglobuline polimerico, satherin, S100A9. Ci possono essere molti fattori che contribuiscono alla produzione di peptidi con siti di clivaggio indeterminato. Per esempio, alcuni frammenti peptidici possono essere naturalmente presenti in tutta saliva umana. Molti peptidi con PQ-C-terminali sono stati identificati (Tabella 1 e Tabelle supplementari 1 e 2). Proteine ​​ricche di prolina può essere classificato come acidi, proteine ​​basiche o glicosilata e sono codificati da sei geni raggruppati in un'unica regione 17. Più di 30 differenti prolina-ricca di proteine ​​dal risultato variazione allelica, differenziale splicing dell'RNA, maturazione proteolitica e modificazioni post-traduzionali 17. Dopo la secrezione, l'acido prolina ricco di protEins stanno rapidamente attaccati alle superfici dei denti e degradate in potenziali peptidi dell'immunità innata mediante proteolisi placca dentale 18-19. Entrambi i batteri gram-negativi e gram-positivi esprimere una varietà di glicosidasi e proteasi 18. È stato riportato che acide proteine ​​ricche di prolina può essere degradato in-immunità innata potenziali peptidi simili per via orale e Streptococcus specie Actinomyces 18. La glutammina (Gln) - glicina (Gly) scissione è biologicamente critico rispetto alla degradazione batterica di proteine ​​salivari acide ricco in prolina e produzione di un batterio-legante-PQ C-terminale 18, 20-22. Il legame di-PQ terminali di proteine ​​ricche di prolina per i batteri è stata confermata da un esperimento in vitro usando una sintetica RGRPQ pentapeptide 18. In accordo con i nostri dati, il gruppo di SJ Fisher è stato in grado di identificare i peptidi diversi con-PQ C-Termini, nel non digerito saliva umana parotide 23,suggerendo diversi peptidi con-PQ C-terminali possono esistere India e in tutta la saliva umana. Saliva umana contiene peptidi multiple con PQ-C-terminali, che possono funzionare come immunità innata-peptidi simili 18, 19. Quando i batteri orali sono presenti, prolina proteine ​​ricche può immediatamente abbattere di vari frammenti con PQ-C-terminali per uccidere i batteri efficiente.

Un'altra ragione per frammenti peptidici esistenti in saliva digerito sono che alcune delle proteasi endogene presenti nella saliva intera può rimanere attivo durante la preparazione del campione 24-25. La scissione avviene in queste proteine ​​da parte di proteasi endogene nella cavità orale probabile continuato prima analisi di spettrometria di massa. Ad esempio, mucina potrebbe essere scissa dalla proteasi salivare fino a un formato più piccolo che è più competente in clearance batterica 26. È anche possibile che proteasi da batteri orali possono scindere le proteine ​​orali prima o dopo collectio salivan. E 'stato documentato che le proteine ​​della saliva possono essere più tagliato da proteasi orale da Streptococcus e Actinomyces specie di 27-29.

La membrana semi-permeabile è un componente chiave di sonde LLUF. La membrana è necessario rimuovere selettivamente più sostanze incluse proteine, batteri orali e detriti. LLUF agisce come una barriera selettiva che permette il passaggio di alcuni componenti e respinge altri componenti all'interno di una cavità artificiale orale. La membrana semipermeabile piccola molecola consente di passare attraverso la membrana escludendo macromolecole. Dati recenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che le sonde LLUF può rimuovere efficacemente i batteri orali, sia aerobici e anaerobici (Figura 4). Campioni di saliva prima e dopo la raccolta con sonde LLUF erano sparsi sul antibiotici privi di piastre di agar e incubate in condizioni aerobiche e anaerobiche. I batteri non crescono quando piastre di agar sono state diffuse con LLUF probe-saliva campionato, dimostrando la capacità di sonde LLUF di eliminare i batteri orali aerobi e anaerobi. Abbiamo cercato tutti gli spettri con un database umano che non comprende banche dati di proteine ​​umane di microbi orali. Identificazione del proteoma / peptidoma di microbi orali sarà possibile se un database proteico completo con tutti i microbi orali può essere stabilita. An (polietersulfone) organico membrana stato impiegato per fabbricare le sonde LLUF. Sebbene la membrana era noto per avere un MWCO 30 kDa, la prestazione di campionamento dipende anche da altri fattori quali l'interazione di proteine ​​saliva di cariche negative sulla superficie della membrana 30. I cambiamenti nei valori di pH e di temperatura nonché la complessità proteina in cavità orale influenzano anche la prestazione di campionamento. I nostri dati hanno dimostrato che 18 peptidi erano esclusivamente presenti nella saliva LLUF sonda-campione (Tabella 1). I peptidi conclusa con PQ-,-SR,-SP-PP o C-terminali derivano principalmente da prolina-ricco proteins. E 'stato riportato che la rete caricata negativamente proteine ​​ricche di prolina mostrato un forte adsorbimento ad una superficie caricata negativamente 31.

In sintesi, nel tentativo di rilevare gruppi specifici di proteine ​​in futuro, le membrane semipermeabili di fronte sonde LLUF può essere modificata utilizzando dimensioni dei pori e materiali diversi che hanno cariche superficiali differenti. Ad esempio, membrane nanofiltrazione con dimensioni dei pori variano da 0,05 micron a 1 nanometro può separare i virus da campioni di saliva 32. LLUF sonde possono anche essere applicati per il monitoraggio della concentrazione di varie sostanze quali glucosio e lattato in campioni di saliva. Sebbene membrane di ultrafiltrazione hanno fatto uso di separazione delle proteine ​​mediante ultrafiltrazione centrifuga 33, essi sono raramente utilizzato per raccogliere le proteine ​​mediante applicazione di pressione negativa attraverso una membrana semipermeabile. Collegare le sonde LLUF con spettrometro di massa avanzate come Fourier transform ion ciclotrone risonanza (FT-ICR) può consentire l'identificazione di proteine ​​della saliva intatta 34-35. In particolare, on-line l'analisi dei modelli dinamici di saliva proteoma e peptidoma può essere importantissimo per l'applicazione clinica di sonde LLUF. Dopo la raccolta con sonde LLUF, molti frammenti peptidici derivati ​​da prolina ricche di proteine ​​sono state identificate dalla saliva non digerito tutto. Proline proteine ​​ricche possono interagire con i batteri orali di influenzare lo sviluppo di carie dentali 36 e può essere significativo nel proteggere le superfici mucose da infezione virale 37. Inoltre, è stato documentato che l'espressione di proteine ​​ricche di prolina è stato alterato nei pazienti con artrite reumatoide 38. Questi studi sostengono fortemente che prolina proteine ​​ricche raccolti da sonde LLUF possono servire come marcatori per il monitoraggio di varie malattie umane.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Grants Salute (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 e R21-I58002-01). Ringraziamo C. Niemeyer per la lettura critica del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethersulfone membranes Pall Corporation 30 kDa MWCO
Teflon fluorinated ethylene propylene tube Upchurch Scientific
Blue dextran Sigma
Nano LC system Eksigent
C18 trap column Agilent 5065-9913
LTQ linear ion-trap mass spectrometer Thermo Fisher
Sorcerer 2 Sage-N Research
Acetonitrile-0.1% formic acid J.T. Baker 9832-03 LC/MS grade
Water-0.1% formic acid J.T. Baker 9834-03 LC/MS grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
  2. Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
  3. Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
  4. Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
  5. Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
  6. Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
  7. Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
  8. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
  9. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
  10. Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
  11. Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
  12. Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
  13. Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
  14. Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
  15. Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
  16. Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
  17. Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
  18. Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
  19. Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
  20. Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
  21. Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
  22. Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
  23. Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
  24. Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
  25. Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
  26. Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
  27. Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
  28. Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
  29. Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
  30. Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
  31. Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
  32. Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
  33. Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
  34. Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
  35. Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
  36. Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
  37. Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
  38. Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).

Tags

Medicina Numero 66 Biologia Molecolare Genetica Sampling Saliva peptidoma ultrafiltrazione spettrometria di massa
Campionamento umana peptidoma Indigenous Saliva Utilizzando un Lollipop-Like Probe ultrafiltrazione: Semplificare e migliorare la rilevazione Peptide per spettrometria di massa Clinica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, W., Gallo, R. L., Huang, C. M.More

Zhu, W., Gallo, R. L., Huang, C. M. Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (66), e4108, doi:10.3791/4108 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter