Summary
Angesichts Speichel Probenahme für zukünftige klinische Anwendung wurde ein Lollipop-ähnliche Ultrafiltration (LLUF) Sonde hergestellt, um in die menschliche Mundhöhle passen. Direkte Analyse von unverdauten Speichel mit nanoLC-LTQ Massenspektrometrie zeigten die Fähigkeit von LLUF Sonden, um große Proteine und hohe Abundanz Proteine zu entfernen, und machen Low-reiche Peptide mehr nachweisbar.
Abstract
Obwohl menschlichen Speichel Proteom-und Peptidoms worden 1-2 offenbart haben sie majorly von tryptischen Verdaus von Speichel-Proteine identifiziert. Identifizierung von indigenen Peptidoms von menschlichem Speichel ohne vorherige Spaltung mit exogenen Enzyme wird aber notwendig, da nativen Peptide im menschlichen Speichel mögliche Werte stellen für die Diagnose von Krankheiten, die Vorhersage Fortschreiten der Erkrankung sowie die Überwachung therapeutische Wirksamkeit. Entsprechende Probenahme ist ein wichtiger Schritt für die Verbesserung der Identifikation der menschlichen Speichel indigenen Peptidoms. Traditionelle Methoden der Probenahme menschlichen Speichel mit Zentrifugation, um Verschmutzungen zu entfernen 4.3 kann zu zeitaufwendig anwendbar zu sein für den klinischen Einsatz. Darüber hinaus kann Müllbeseitigung durch Zentrifugation nicht in der Lage, die meisten der infizierten Krankheitserregern reinigen und entfernen Sie die hohe Abundanz Proteine, die oft behindern die Identifikation von geringer Menge Peptidoms.
Herkömmliche Ansätze Proteomik, dass priLinie nutzen zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE Gelen) in Konjugation mit in-Gel-Verdau, imstande sind, viele Proteine Speichel 5-6. Allerdings ist dieser Ansatz im Allgemeinen nicht ausreichend empfindlich gegenüber niedrigen Häufigkeit Peptide / Proteine zu detektieren. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) basierten Proteomik ist eine Alternative, die Proteine ohne vorherige 2-DE Trennung identifizieren können. Obwohl dieser Ansatz bietet eine höhere Empfindlichkeit, muss es in der Regel vor Proben-Fraktionierung 7 und vor dem Verdau mit Trypsin, was es schwierig für den klinischen Gebrauch macht.
Um das Hindernis in der Massenspektrometrie durch Probenvorbereitung zu umgehen, haben wir eine Technik, die als Kapillare Ultrafiltration (CUF) Sonden 8-11 entwickelt. Daten aus unserem Labor gezeigt, dass die Sonden, die CUF Erfassung Proteine in vivo aus verschiedenen Mikroumgebungen bei Tieren in einem dynamischen und minimal invasiven Weise 8 -11. Keine Zentrifugation ist notwendig, da ein Unterdruck durch einfaches Herausziehen Spritze während der Probenahme erstellt wird. Die CUF-Sonden mit LC-MS kombiniert erfolgreich identifizierten tryptischen-verdaute Proteine 11.08. In dieser Studie wurden aufgerüstet wir die Ultrafiltration Sampling-Technik, indem sie einen Lutscher-wie Ultrafiltration (LLUF) Sonde, die sich leicht in die menschliche Mundhöhle kann passen. Die direkte Analyse mittels LC-MS ohne Trypsin-Verdau zeigte, dass menschliche Speichel enthält viele indigenously Peptidfragmente aus verschiedenen Proteinen abgeleitet sind. Probenahme mit Speichel LLUF Sonden vermieden Zentrifugation aber effektiv entfernt viele größere und hohe Abundanz Proteine. Unsere massenspektrometrischen Ergebnisse dargestellt, dass viele geringer Menge nachweisbar Peptide nach Herausfiltern von größeren Proteinen mit LLUF Sonden wurde. Erkennung von Peptiden geringer Menge Speichel war unabhängig von mehrstufigen Stichprobe Trennung mit Chromatographie. Für die klinische Anwendung, verfügen die Sonden LLUFd mit LC-MS könnte möglicherweise in der Zukunft genutzt werden, um den Krankheitsverlauf aus Speichel zu überwachen.
Protocol
1. Erstellung von LLUF Probes
- Die Polyethersulfonmembranen (2 cm 2) wurden mit Polypropylen-Dreieck Paddel (University of California, San Diego) durch Kleben mit Epoxy-Membranen an den Grenzen der Paddel versiegelt. Ein negativ geladenes Polyethersulfonmembran mit einem Molekulargewicht cut-off (MWCO) bei 30 kDa verwendet wurde.
- Ein Teflon fluorierten Ethylen-Propylen-(innerer Durchmesser / äußerer Durchmesser 0.35/0.50 cm) wurde einem Zylinder Ausgang eines Dreiecks Polypropylen Paddel befestigt, so dass die Sonde an eine LLUF 20 ml Spritze verbunden werden kann.
- Nach dem Einweichen die Polyethersulfonmembran in menschlichem Speichel in der Kulturschale (50 mm Durchmesser) wurde Unterdruck, der durch Entnahme einer Spritze erstellt. Die Spritze mit Unterdruck gefahren Die Ultrafiltration zur Entnahme von Speichel-Proteine.
- Die Sonden wurden mit 70% Alkohol über Nacht vor der Verwendung sterilisiert. Um eine einwandfreie Abdichtung zu demonstrieren, positionierten wir LLUF Sonden in eine LösungMicellenlösung mit blauem Dextran (50 mg / ml) mit einem mittleren Molekulargewicht von 2000 kDa für 2 Stunden. Das Fehlen von blauem Dextran in den gesammelten Proben zeigte, dass keine Leckagen während des Fertigungs-und Probenahme-Sonde entwickelt.
2. Speichelsammelsystem
- Ganze Speichel wurde von drei gesunden Probanden (zwei Männer und eine Frau im Alter zwischen 20 und 40) nehmen keine Medikamente gesammelt, ohne deutliche Zeichen für eine Gingivitis oder Hohlräume 6.
- Nach dem Spülen des Mundes mit Wasser wurden die gesamten Speichelproben durch Spucken gesammelt, ohne chemische Stimulation, in einer eisgekühlten Behälter.
- Alle Proben wurden gesammelt und auf Eis gehalten während der Sammelprozedur.
- Unmittelbar nach der Sammlung, wurde Speichel (200 ul) für die Probenahme mit LLUF Sonden angewendet. Die Probenahme erfolgte in einem 4 ° C Raumtemperatur durchgeführt.
- Speichel-Proteine (1,0 ug / ul) mit oder ohne Sonde LLUF Sammlung wurden direkt an Nano-LC-Masse-s ausgesetztpectrometry Analyse ohne tryptischen Verdauung. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Bio-Rad Protein Assay 12.
3. NanoLC-LTQ MS-Analyse
- Die UN-verdauten Speichelproben (5 ul) wurden direkt an die Trap-Säule des Eksigent NanoLC System durch den Autosampler geladen, mit 100% Puffer A (2% acetonitrile/0.1% Ameisensäure). Die NanoLC wurde on-line mit einem Finnigan LTQ Massenspektrometer gekoppelt.
- Nach Probe geladen und Waschen wurde das Ventil umgeschaltet und 500 nl / min linearem Gradient wurde zu dem Abscheider und der Trennsäule (10 cm Länge, 100 um ID, im eigenen Haus mit Synergi 4 um C18 verpackt) geliefert. Der Gradient war 0 bis 50% Puffer B (80% acetonitrile/0.1% Ameisensäure) in 45 min.
- Die nanoLC-LTQ MS Instrumente wurden in der Daten abhängig von Xcalibur-Modus betrieben. MS / MS-Spektren von den vier stärksten MS Ionen oberhalb einer Intensität von 1 × 10 5 wurden mit der dynamischen Ausschluss gesammeltaktiviert ist und die Aufprallenergie bei 35% festgelegt.
- Jede Probe wurde zweimal von der Nano-LC-MS LTQ System laufen. Die Proben aus drei verschiedenen Präparaten verwendet wurden. Diese Peptide nachweisbar in drei separaten Proben wurden in Supplemental Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Vertreter der nanoLC-LTQ MS-Spektren wurde in Abbildung 3 dargestellt.
4. Datenanalyse und Protein-Datenbank Suche
- Jeder RAW-Datei wurde in eine Datei mit mzXML Readw.exe umgewandelt.
- Die Datei war mzXML Eingang in ein SEQUEST Sorcerer 2-System und suchte gegen einen menschlichen Datenbank aus dem entsprechenden National Center for Biotechnology Information (NCBI) Protein-Datenbank unter Verwendung von nicht-Enzym-Spezifität generiert. Die Masse Toleranz von Vorläufer-Ion wurde bei 1,5 Da setzen. Ein Molekulargewicht von 16 Da wurde Methionin-Differential Suche auf angemeldet zur Oxidation zugegeben.
- Nach SEQUEST suchen, waren die Ergebnisse automatisch gefiltert, validiert eind durch PeptideProphet und ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)] angezeigt. PeptideProphet schätzt ein umfassendes Wahrscheinlichkeit (P) Ergebnis, dass ein Peptid Zuordnung "richtige" vs "falsch" auf den Grundlagen der es SEQUEST Scores (XCORR, ΔCn, Sp, RSP) und weitere Informationen der einzelnen Peptid-Sequenz identifiziert ist. ProteinProphet berechnet einen Wahrscheinlichkeitswert 0-1 für jedes Protein auf der Grundlage von Peptiden zugeordneten MS / MS-Spektren.
- Um falsch positive Identifizierungen zu minimieren verwendeten wir strenge Filterkriterien. Zunächst wird die minimale Punktzahl P Cutoff von 0,8 für alle akzeptierten Peptid gesetzt zu sehr niedrige Fehlerrate (viel weniger als 3%) und recht gute Empfindlichkeit zu gewährleisten. Zweitens müssen alle Peptide mit> 0,8 P Punktzahl haben hohe Kreuzkorrelation (XCORR) erzielt ein Tor zur gleichen Zeit: 1,9, 2,2 und 3,0 für 1, 2, 3 und Ladung.
5. Entfernung von Bakterien in der Mundhöhle mit LLUF Probes
- Um die Leistungsfähigkeit von LLUF Sonden ermitteln, um die zu entfernenBakterien in der Mundhöhle, Speichel vor und nach LLUF Sonde Sammlung (Abschnitt 3) wurde auf Agarplatten für Nachweis von Bakterien zu verbreiten.
- Aerobe Bakterien wurden auf einem Antibiotika-freie Lauria-Bertani (LB)-Agar-Platte bei 37 ° C für einen Tag zugenommen.
- Anaerobe Bakterien wurden auf einer Antibiotika-freien Brucella-Bouillon-Agar-Platte (BD, Sparks, MD) unter anaeroben Bedingungen mit Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) bei 37 ° C für einen Tag gewachsen.
6. Repräsentative Ergebnisse
1. Herstellung von Sonden und LLUF Probenahme Speichel in einer nachgeahmten Mundmilieu
Wenn Probenahme Speichel als das Saugen einen Lutscher durchgeführt werden können, wird das Verfahren vermeiden den Abbau von aufgespießt Speichel in Auffangvorrichtungen 13-14. Wichtig ist, dass es auch möglich geworden, Patienten dynamisch und lokal zu überwachen von Mundhöhle. Darüber hinaus, wenn Probenvorbereitung mit Speichel vereinfacht werden könnten, würde Kliniker leicht faciltern die Vorgehensweise, um ihre Entscheidung auf der nächsten klinischen Betrieb zu beschleunigen. Massenspektrometrie ist eine der am empfindlichsten zu detektieren und sogar Sequenz Proteine in einem sehr kurzen Zeitraum. Allerdings haben komplizierte Verfahren für die Probenvorbereitung behindert mit dieser Technik in der Klinik. Weiterhin ist es bekannt, dass höhere Mengen vorhandenen Proteine oder Proteine mit hohem Molekulargewicht in klinischen Proben (z. B. Amylase im Speichel) Maske geringen Mengen vorhandenen Proteine für die massenspektrometrische Analyse 15-16. Um die Hürden zu überwinden oben erwähnt, haben wir ein Lollipop-ähnliche Gerät mit dem Namen Ultrafiltration LLUF Sonden (Abbildung 1). Ein negativ geladenes Polyethersulfon-Membran mit einem MWCO von 30 kDa (1A, a) wurde auf einer Polypropylen-Schaufel (1A, b) verklebt ist. Es wurde vor dem LLUF Sonde mit der Absicht Herausfiltern größere Proteine im Speichel angeordnet ist. Um die menschliche Mundhöhle (Abbildung 1A, g nachahmen) Wurde ein Schwamm (Abbildung 1A, e) in den Speichel in der Kulturschale (Abbildung 1A, f) getränkt. Nach dem vollständigen Zurückziehen der Spritze (1A, d), filtriert begonnen Speichel Bewegen entlang eines verbundenen Rohr (1A, c) und wurde gesammelt.
2. Identifizierung von indigenen Speichel Peptidoms mit nanoLC-MS LTQ
Vergleichen LC-Chromatogramme, fanden wir verschiedene Chromatogramme von Speichel vor und nach LLUF Abtasten (2), was anzeigt, dass es verschiedene Protein-Zusammensetzungen im Speichel nach LLUF Probenahme. Um die Protein-Zusammensetzungen zu bestimmen, verwendeten wir NanoLC-LTQ Massenspektrometrie, die bekanntermaßen in der Lage, schnell Sequenz Peptide von einem Vielfachen Proteingemisch wird. Noch wichtiger ist, an die Probenvorbereitung für klinische Zwecke zu vereinfachen, wurde ganze Speichel ohne chemische oder enzymatische Verdauung für nanoLC-LTQ MS-Analyse angewandt. Unerwarteterweise, 131 Peptide wirunverdaut im Speichel (Supplemental Tabelle 1) identifiziert erneut. Diese Peptide sind Fragmente von verschiedenen Prolin reiche Proteine, Actin, alpha-Amylase, Alpha-1-Globin, beta-Globin, histain 1, Keratin 1, Muzin 7, polymeren Immunglobulin-Rezeptor, satherin, und S100A9 abgeleitet. Sechsundzwanzig einzigartige Peptide wurden im Speichel nach dem Filtern mit LLUF Sonden (Supplemental Tabelle 2) identifiziert. Diese Peptide sind Bruchstücke hauptsächlich aus verschiedenen Prolin-reiche Proteine abgeleitet. Peptide aus Proteinen, wie dem polymeren Immunglobulin-Rezeptor (83,24 kDa) und alpha-Amylase abgeleitet nicht erkannt werden konnten, was die Fähigkeit LLUF Sonden zur Entfernung von größeren und vorkommenden Proteine. Eine MS / MS-Spektrum der PFIAIHAEAESKL Peptid, das eine interne Peptid alpha-Amylase in 3A dargestellt. Am verblüffendsten ist, nach dem Entfernen größerer Proteine, wurden 18 von 26 sequenzierten Peptide in der LLUF-Sonde abgetastet Speichel (Tabelle nachweisbar1). Diese 18 Peptide wurden von Prolin-reiche Proteine oder hypothetischen Proteinen, die mit einem Prolin (P) beendet abgeleitet -. Glutamin (Q) (-VE),-SR,-SP oder PP-C-Terminus 3B gezeigt, eine MS / MS Spektrum der PQGPPQQGGHPRPP Peptid, das in der LLUF-Sonde abgetastet Speichel nachgewiesen wurde. Das Peptid konnte von Prolin-reiche Protein HaeIII Unterfamilie 1 und 2 (Tabelle 1) abgeleitet werden.
Abbildung 1. Zusammensetzungen LLUF Sonden und Probenahme von Speichel von ganzen imitieren menschlichen Mundhöhle Panel A:. (A) eine semipermeable Polyethersulfon mit einer Molekulargewichtsschwelle von 30 kDa, (b) ein Polypropylen Paddel, (c) eine Teflon-fluoriertem Ethylen-Propylen-Rohr; (d) eine 20 ml Spritze Panel B:. ein Schwamm (e) (a nachgeahmten Zunge) wurde in einer Kulturschale (f) mit menschlichem Speichel zu schaffen getränkteine künstliche menschliche Mundhöhle (g). Der entstehende Unterdruck durch die vollständige Entnahme einer Spritze erstellt treibt die gesammelte Flüssigkeit entlang einer Röhre verbunden (Pfeil) und hin zu einem Raum geschaffen (Pfeilspitze) in der Spritze zu bewegen. Bar: 2,0 cm.
Abbildung 2. Differentielle LC / MS / MS-Chromatogramme von Speichel vor und nach der Probenahme LLUF. Proteine (1,0 ug / ul) in menschlichen Speichel ganzen wurden ohne oder mit einer Sonde LLUF gefiltert. Proteine ohne tryptischen Verdau wurden direkt an NanoLC-LTQ MS, konjugiert mit einem Eksigent Nano-LC-System wurde wie in Material und Methoden beschrieben ist. Die Basis-Peak Chromatogramme (mit 44-mim Retentionszeiten) von Speichel vor (A) und nach (B) LLUF Probenahme wurden dargestellt.
Abbildung 3. UVEKtion von Speichel Peptidoms mit nanoLC-LTQ MS-Sequenzierung. Speichel-Proteine vor (A) und nach (b) Probenahme mit LLUF Sonden wurden durch Nano-LC-MS LTQ wie im experimentellen Verfahren beschrieben, analysiert. Speichel Peptidoms aus natürlichen menschlichen Speichel ohne tryptischen Verdau abgeleitet wurden Zusätzliche Tabellen 1 und 2 gezeigt. Ein Peptid (PFIAIHAEAESKL) aus alpha-Amylase aus ausschließlich in einer Speichelprobe ohne Erhebung mit LLUF Sonden (A) erfasst wird, zeigt, dass die Fähigkeit LLUF Sonden bei der Entfernung von großen Proteinen. Viele Peptide mit PQ-,-SR,-SP oder PP-C-Terminus waren nur in Proben nach der Ultrafiltration LLUF Sonden. Ein (PQGPPQQGGHPRPP) von Peptiden aus verschiedenen prolinreichen Proteinen abgeleitet wurden (B) gezeigt. MS / MS-Spektren mit charakteristischen "y" und "b"-Serie Ionen bestätigte die Identität der beiden Peptide.
<strong> Abbildung 4. Entfernung von Bakterien in der Mundhöhle mit Hilfe während LLUF Sonden. Eine Sonde wurde LLUF ausgebildet, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Die Sonde wurde in den menschlichen Speichel innerhalb eines imitierten oralen Milieu (1) angeordnet ist. Die Spritze am Ende LLUF Sonde wurde entfernt, um einen negativen Druck, der Ultrafiltration für Speichel Probenahme fuhren erstellen. Bei der Probenahme, querte die Speichel selektiv durch die Polyethersulfonmembran und akkumuliert in einer Spritze. Ganze Speichel vor der Abtastung mit einem LLUF Sonde diente als Kontrolle. Speichel (10 ul) vor und nach der Probenahme LLUF Sonde wurde auf Agarplatten für Nachweis von Bakterien verbreiten Panel A:. Speichel mit (+ LLUF) und ohne (+ LLUF) LLUF Probennahme wurde Seite an Seite auf einer Antibiotika-freien verbreiten LB-Agar-Platte bei 37 ° C für einen Tag Panel B:. Speichel mit und ohne LLUF Probennahme wurde auf einer Antibiotika-freie Brucella-Bouillon-Agar-Platte verteiltunter anaeroben Bedingungen mit Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) bei 37 ° C für einen Tag. Bakterien nicht auf Agarplatten mit LLUF-Sonde abgetastet Speichel verbreiten wachsen, was die Fähigkeit der LLCF Sonden bei der Beseitigung von aeroben sowie anaeroben Bakterien in der Mundhöhle. Bar: 1,0 cm.
| Peptidsequenz / Gemessene peptide mass | Zugangsnummer | Name | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485,3 | gi | 41349484 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform 2-Vorläufer |
| gi | 41349482 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform ein Vorläufer | ||
| gi | 60301553 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576,9 | gi | 4826944 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2 |
| gi | 9945310 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1 | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126,2 | gi | 37537692 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 4-Precursor |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028,3 | gi | 113423660 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077,8 | gi | 113423262 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein Isoform 5 |
| gi | 41349482 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform ein Vorläufer | ||
| gi | 60301553 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 2 | ||
| gi | 113423663 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein | ||
| gi | 41349484 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform 2-Vorläufer | ||
| gi | 41349486 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform 3 Vorläufer | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918,5 | gi | 9945310 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1 |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131,3 | gi | 113423660 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | gi | 113423663 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein |
| gi | 41349482 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform ein Vorläufer | ||
| gi | 113423262 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein Isoform 5 | ||
| gi | 60301553 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866,6 | gi | 4826944 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713,8 | gi | 9945310 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1 |
| gi | 4826944 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083,1 | gi | 9945310 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1 |
| gi | 4826944 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512,6 | gi | 4826944 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2 |
| gi | 9945310 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1 | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720,2 | gi | 113423262 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein Isoform 5 |
| gi | 113423663 | Vorhergesagt: hyhypothetischen Protein | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450,1 | gi | 9945310 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1 |
| gi | 4826944 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791,1 | gi | 4826944 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2 |
| gi | 9945310 | Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1 | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186,9 | gi | 113423262 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein Isoform 5 |
| gi | 41349482 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform ein Vorläufer | ||
| gi | 60301553 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 2 | ||
| gi | 113423663 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein | ||
| gi | 41349484 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform 2-Vorläufer | ||
| gi | 41349486 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform 3 Vorläufer | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720,3 | gi | 113423663 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein |
| gi | 41349482 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform ein Vorläufer | ||
| gi | 113423262 | Vorhergesagt: hypothetisches Protein Isoform 5 | ||
| gi | 60301553 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870,9 | gi | 37537692 | Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 4-Precursor |
Tabelle 1. Die Peptide wurden ausschließlich nachweisbar LLUF-gesammelten Proben.
Ergänzende Tabelle 1. Klicken Sie hier zur Ansicht ergänzende Tabelle 1 .
Ergänzende Tabelle 2. Klicken Sie hier zur Ansicht ergänzende Tabelle 2 .
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Discussion
Wir haben festgestellt, dass viele Peptidfragmente in menschlichen unverdaute Speichel abgegeben. Diese Peptidfragmente sind Derivate aus verschiedenen Formen von Prolin-reiche Proteine, Actin, alpha-Amylase, Alpha-1-Globin, beta-Globin, histain 1, Keratin 1, Muzin 7, polymeren Immunglobulin-Rezeptor, satherin, S100A9. Es könnte viele Faktoren, die die Produktion von Peptiden mit ungeklärter Spaltstellen sein. Zum Beispiel können einige Peptidfragmente natürlich vorhanden sein in menschlichem Gesamtblut Speichel. Viele Peptide mit PQ-C-Termini wurden (Tabelle 1 und eine zusätzliche Tabellen 1 und 2). Prolin-reiche Proteine können als sauer, basisch oder glykosylierte Proteine klassifiziert werden und werden durch sechs Gene in einem einzigen Cluster-Region 17 codiert. Mehr als dreißig Prolin-reiche Proteine ergeben sich aus allele Variation, Differential RNA-Spleißen, proteolytische Prozessierung, und post-translationale Modifikationen 17. Nach der Sekretion, der saure Prolin-reiche proteins sind schnell auf-und abgebaut Zahnoberflächen in potentielle angeborenen Immunität Peptide durch Zahnbelag Proteolyse 18-19 angebracht. Beide gram-negative und gram-positive Bakterien exprimieren eine Vielzahl von Glycosidasen und Proteasen 18. Es wurde berichtet, dass saure Prolin-reiche Proteine abgebaut werden kann in potentielle angeborenen-Immunität-ähnlichen Peptiden durch orale Streptococcus und Actinomyces species 18. Das Glutamin (Gln) - Glycin (Gly)-Spaltung ist biologisch kritisch im Hinblick auf den bakteriellen Abbau von Speichel-saure Prolin-reiche Proteine und Produktion einer Bakterien-binding-PQ C-Terminus 18, 20-22. Die Bindung von PQ-Termini von Prolin-reiche Proteine, Bakterien wurde durch einen in vitro-Experiment unter Verwendung eines synthetischen RGRPQ Pentapeptid 18 bestätigt. In Absprache mit unseren Daten war SJ Fisher-Gruppe in der Lage, mehrere Peptide mit PQ-C-Termini in der unverdauten menschlichen Parotisspeichel 23 zu identifizieren,darauf hindeutet, mehrere Peptide mit PQ-C-Termini kann indigenously in menschlichen Speichel ganze existieren. Der menschliche Speichel enthält mehrere Peptide mit PQ-C-Termini, die als angeborene Immunität-like-Peptide 18, 19 funktionieren kann. Wenn Bakterien in der Mundhöhle vorhanden sind, können Prolin-reiche Proteine sofort brechen, um verschiedene Fragmente mit PQ-C-Termini, um effizient die Bakterien abtöten.
Ein weiterer Grund für Peptidfragmente bestehenden unverdauten in Speichel, dass einige der endogenen Proteasen, die in nativem Speichel bleiben kann bei der Probenvorbereitung 24-25 aktiv. Die Spaltung auftritt in diesen Proteinen durch endogene Proteasen in der Mundhöhle geeignet fortgesetzt, bevor Massenspektrometrie-Analyse. Zum Beispiel könnte Mucin von Speichel Protease auf eine kleinere Form, die zuständigen in bakteriellen Clearance 26 gespalten werden. Es ist auch möglich, dass Proteasen aus Bakterien in der Mundhöhle Mai spalten die mündliche Proteine vor oder nach dem Speichel Collection. Es wurde dokumentiert, dass mehrere Speichel-Proteine durch Proteasen, die aus oralen Streptokokken und Actinomyces-Arten 27-29 kann gehackt werden.
Die semipermeable Membran ist eine Schlüsselkomponente des LLUF Sonden. Die Membran ist notwendig, um selektiv zu entfernen, größere Substanzen wie Proteine, Bakterien in der Mundhöhle und Schutt. LLUF wirkt als selektive Barriere, die den Durchgang von bestimmten Komponenten ermöglicht und weist andere Komponenten innerhalb eines künstlichen Mundhöhle. Die semipermeable Membran ermöglicht kleine Moleküle, um die Membran passieren unter Ausschluss Makromoleküle. Jüngste Daten aus unserem Labor zeigten, dass LLUF Sonden wirksam beseitigt werden können sowohl aeroben und anaeroben Bakterien in der Mundhöhle (Abbildung 4). Speichelproben vor und nach der Sammlung mit LLUF Sonden wurden auf Antibiotika-freien Agarplatten verteilt und inkubiert unter aeroben und anaeroben Bedingungen. Bakterien nicht wachsen, wenn Agarplatten mit LLUF verbreitet wurden probe-abgetasteten Speichel, was die Fähigkeit LLUF Sonden bei der Entfernung von aeroben und anaeroben Bakterien in der Mundhöhle. Wir suchten alle Spektren mit einem menschlichen Datenbank, die nicht enthalten waren Protein-Datenbanken der menschlichen oralen Mikroben. Bezeichnung des Proteoms / Peptidoms von oralen Mikroben werden möglich, wenn eine umfassende Protein-Datenbank mit allen oralen Mikroorganismen hergestellt werden kann. Eine organische (Polyethersulfon)-Membran wurde verwendet, um die LLUF Sonden herzustellen. Obwohl die Membran war bekannt als ein 30 kDa MWCO haben, die Abtastleistungsfähigkeit auch abhängig von anderen Faktoren wie das Zusammenspiel von Speichel Proteine die negativen Ladungen auf der Membran 30 auf. Die Veränderungen im pH-Wert und Temperatur sowie Protein Komplexität in der Mundhöhle beeinflussen auch die Abtastleistungsfähigkeit. Unsere Daten zeigten, dass 18 Peptide ausschließlich in LLUF-Sonde abgetastet Speichel (Tabelle 1) waren. Die Peptide endete mit PQ-,-SR,-SP oder PP-C-Termini werden hauptsächlich aus Prolin-reiche p abgeleitetroteins. Es wurde berichtet, dass das Netz negativ geladenen Prolin-reiche Proteine zeigten eine starke Adsorption an eine negativ geladene Oberfläche 31.
Zusammenfassend kann in einem Versuch, spezifische Gruppen von Proteinen in der Zukunft, semipermeable Membranen vor LLUF Sonden erfassen verändert mit verschiedenen Porengrößen und Materialien, die unterschiedliche Oberflächenladungen aufweisen. Zum Beispiel reichen Nanofiltrationsmembranen mit Porengrößen von 0,05 Mikrometer bis 1 Nanometer kann Viren aus Speichel-Proben 32 zu trennen. LLUF Sonden können auch zur Überwachung der Konzentration von verschiedenen Substanzen, wie Glucose und Lactat in Speichel-Proben angewendet werden. Obwohl Ultrafiltrationsmembranen Verwendung von Protein Trennung mittels Zentrifugalkraft Ultrafiltration 33 sind gemacht, sie haben kaum benutzt, um Proteine durch Auftragen des Unterdrucks über eine semipermeable Membran zu sammeln. Die Verknüpfung der LLUF Sonden mit fortgeschrittenem Massenspektrometer wie Fourier-transform Ionen-Zyklotron-Resonanz (FT-ICR) erlaubt die Identifizierung der Proteine intakt Speichel 34-35. Bemerkenswert ist, kann on-line Analyse der dynamischen Muster des Speichels Proteom-und Peptidoms entscheidend sein für die klinische Anwendung der LLUF Sonden. Nach der Sammlung mit LLUF Sonden wurden viele Peptidfragmente von Prolin-reiche Proteine abgeleitet von unverdaute ganze Speichel identifiziert. Prolin-reiche Proteine können mit oralen Bakterien interagieren, um die Entwicklung von Karies 36 zu beeinflussen und kann für den Schutz Schleimhautoberflächen von einer Virusinfektion 37 Wesentliche. Darüber hinaus wurde dokumentiert, dass die Expression von Prolin-reiche Proteine in den Patienten mit rheumatoider Arthritis 38 wurde verändert. Diese Studien unterstützen mit Nachdruck, dass Prolin-reiche Proteine, die von LLUF Sonden erfasst werden, können als Biomarker zur Überwachung verschiedener Krankheiten des Menschen dienen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 und R21-I58002-01) unterstützt. Wir danken C. Niemeyer für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
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