Summary
Vurderer spytt prøvetaking for fremtidig klinisk anvendelse, ble en lollipop-lignende ultrafiltrasjon (LLUF) sonde fabrikert for å passe i den menneskelige munnhulen. Direkte analyse av ufordøyd spytt ved NanoLC-LTQ massespektrometri demonstrert evne LLUF sonder for å fjerne store proteiner og høye overflod proteiner, og gjør lite tallrike peptider mer synlig.
Abstract
Selv om menneskelige spytt proteomet og peptidome har blitt avslørt 1-2 de ble majorly identifisert fra tryptic oppsummeringer av spytt proteiner. Identifisering av urfolk peptidome av menneskers spytt uten forutgående fordøyelsen med eksogene enzymer blir viktig, ettersom innfødte peptider i human saliva gi potensielle verdier for diagnostisering sykdom, forutsi sykdomsutvikling, og overvåking terapeutisk effekt. Egnet prøvetaking er et kritisk punkt for forbedring av identifisering av menneskelig innfødte spytt peptidome. Tradisjonelle metoder for prøvetaking menneskelig spytt involverer sentrifugering for å fjerne rusk 3-4 kan være for tidkrevende å være aktuelt for klinisk bruk. Videre kan rusk fjerning ved sentrifugering være ute av stand til å rense de fleste av de smittede patogener og fjern de høye overflod proteiner som ofte hindrer identifisering av lav overflod peptidome.
Konvensjonelle proteomikk tilnærminger som prifremst utnytte to-dimensjonal elektroforese (2-DE) gels i konjugering med i-gel fordøyelse er i stand til å identifisere mange spytt proteiner 5-6. Imidlertid er denne tilnærmingen som regel ikke tilstrekkelig følsom for å oppdage lav overflod peptider / proteiner. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) baserte proteomikk er et alternativ som kan identifisere proteiner uten forutgående to-DE separasjon. Selv om denne tilnærmingen gir høyere følsomhet, må det vanligvis før prøven før fraksjonering 7 og pre-fordøyelse med trypsin, som gjør det vanskelig for klinisk bruk.
For å omgå hindringen i massespektrometri grunn prøveopparbeidelse, har vi utviklet en teknikk som kalles kapillær ultrafiltrasjon (CUF) sonder 8-11. Data fra vårt laboratorium viste at CUF sondene er i stand til å fange proteiner in vivo fra ulike microenvironments i dyr i en dynamisk og minimalt invasiv måte 8 -11. Ingen sentrifugering er nødvendig fordi et undertrykk blir skapt ved å sprøyte trekke under prøvetakingen. De CUF prober kombinert med LC-MS har blitt identifisert tryptic-fordøyde proteiner 8-11. I denne studien, oppgradert vi ultrafiltrasjon prøvetaking teknikken ved å opprette en lollipop-lignende ultrafiltrasjon (LLUF) sonde som lett kan passe i den menneskelige munnhulen. Den direkte analyse av LC-MS uten trypsin fordøyelsen viste at menneskelige spytt indigenously inneholder mange peptidfragmenter fra ulike proteiner. Prøvetaking spytt med LLUF sonder unngått sentrifugering men effektivt fjernet mange større og høy individtetthet proteiner. Våre massespektrometrisk resultater vist at mange lav overflod peptider ble påvisbar etter å filtrere ut større proteiner med LLUF sonder. Påvisning av lav overflod spytt peptider var uavhengig av flere trinn prøve separasjon med kromatografi. For klinisk anvendelse, de LLUF sonder innlemmed med LC-MS kan potensielt brukes i fremtiden for å overvåke sykdomsutvikling fra spytt.
Protocol
1. Opprettelse av LLUF Probes
- De polyetersulfon membraner (2 cm 2) ble forseglet med trekant polypropylen padleårer (University of California, San Diego) som limes membraner med epoxy på grensene til padleårer. Et negativt ladet polyetersulfon membran med en molekylvekt cut-off (MWCO) på 30 kDa ble brukt.
- En teflon fluorinert etylen propylen tube (indre diameter / ytre diameter, 0.35/0.50 cm) ble festet til en sylinder exit av en trekant polypropylen padle så LLUF sonden kan kobles til en 20 ml sprøyte.
- Etter soaking polyetersulfon membranen inn human spytt i en kultur tallerken (50 mm diameter), ble negativt press skapt ved å trekke en sprøyte. Sprøyten med undertrykk kjørte ultrafiltrasjon prosessen for prøvetaking proteiner fra spytt.
- Sondene ble sterilisert med 70% alkohol natten før bruk. For å demonstrere riktig tetning, posisjonert vi LLUF sonder inn i en løsningsjon inneholder blå dekstran (50 mg / ml) med en gjennomsnittlig molekylvekt på 2000 kDa for 2 timer. Fraværet av blå dekstran i de innsamlede prøvene indikerte at ingen lekkasjer utviklet under sonde fabrikasjon og prøvetaking.
2. Spytt Collection
- Hele spytt ble samlet inn fra tre friske frivillige (to hanner og en tispe er mellom 20 og 40) tar ingen medisiner, ingen klare tegn på tannkjøttbetennelse eller hulrom 6.
- Etter å skylle munnen med vann, ble hele spytt prøvene innsamlet av spytting, uten kjemisk stimulering, i en is-avkjølte fartøy.
- Alle prøver ble samlet og oppbevart på is under samlingen prosedyren.
- Umiddelbart etter samlingen, ble spytt (200 mL) søkt om prøvetakingen med LLUF sonder. Prøvetakingen ble utført på en 4 ° C rom.
- Spytt proteiner (1,0 mikrogram / mL) med eller uten LLUF sonde samling ble direkte utsatt for nano LC-masse spectrometry analyse uten tryptic fordøyelsen. Protein konsentrasjoner ble bestemt med en Bio-Rad Protein Assay 12.
3. NanoLC-LTQ MS Analysis
- De un-fordøyd spytt prøver (5 mL) ble direkte lastet til fellen kolonne i Eksigent NanoLC systemet ved autosampler, med 100% buffer A (2% acetonitrile/0.1% maursyre). Den NanoLC ble på linje kombinert med en Finnigan LTQ massespektrometer.
- Etter prøven lasting og vasking, ble ventilen slått og en 500 nl / min lineær gradient ble levert til fellen og separasjon kolonnen (10 cm i lengde, 100 mikrometer id, in-house fullpakket med Synergi 4 mikrometer C18). Stigningen var 0-50% buffer B (80% acetonitrile/0.1% maursyre) i 45 min.
- De nanoLC-LTQ MS instrumentene ble operert i dataene avhengige modus ved Xcalibur. MS / MS spektra av de fire sterkeste MS ioner over en intensitet av 1 × 10 5 ble samlet inn med dynamisk uttrekkaktivert og kollisjonsenergien satt til 35%.
- Hver prøve ble kjørt to ganger av NanoLC-LTQ MS system. Prøver fra tre separate preparater ble brukt. Disse peptidene påvises i tre separate prøver ble oppført i supplerende tabell 1 og 2. Representant for NanoLC-LTQ MS spektra ble illustrert i figur 3.
4. Dataanalyse og Protein Database Søker
- Hver RAW filen ble konvertert til en mzXML fil ved hjelp Readw.exe.
- Den mzXML filen var innspill til en SEQUEST Sorcerer 2 system og søkte mot et menneske database genereres fra tilsvarende National Center for Biotechnology Information (NCBI) protein database ved hjelp av ikke-enzymet spesifisitet. Massen toleranse av forløperen ion ble satt til 1,5 Da. En molekylær masse på 16 Da ble lagt til metionin for differensial søke å ta hensyn til oksidasjon.
- Etter SEQUEST søking, var resultatene automatisk filtrert, validert end vises av PeptideProphet og ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)]. PeptideProphet anslår en omfattende sannsynlighet (P) score som et peptid oppgave er "riktig" vs "feil" på basene sine SEQUEST score (Xcorr, ΔCn, Sp, RSP) og ytterligere informasjon om hver peptidsekvens identifisert. ProteinProphet beregnet en sannsynlighet Resultat 0-1 for hvert protein på grunnlag av peptider tildelt MS / MS spektra.
- For å minimere falske positive identifikasjoner vi brukt strenge filterkriterier. Først blir minimum P poengsummen cutoff satt til 0,8 for noen akseptert peptid å sikre svært lav feilrate (mye mindre enn 3%) og rimelig god følsomhet. Det andre må alle peptider med> 0,8 P poengsummen har høye cross-korrelasjon (Xcorr) scorer samtidig: 1.9, 2.2, og 3.0 for en, +2, og tre lade.
5. Fjerning av munnbakterier med LLUF Probes
- For å bestemme evnen LLUF sonder for å fjernemuntlige bakterier, spytt før og etter LLUF sonde samling (§ 3) ble spredt på agar plater for bakteriell gjenkjenning.
- Aerobe bakterier ble dyrket på en antibiotika-free Lauria-Bertani (LB) agarskål ved 37 ° C for en dag.
- Anaerobe bakterier ble dyrket på en antibiotika-free Brucella buljong agar plate (BD, Sparks, MD) under anaerobe forhold ved hjelp av gass-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) ved 37 ° C for en dag.
6. Representative Resultater
1. Fabrikasjon av LLUF prober og prøvetaking spytt i en imitert muntlig miljø
Dersom prøvetaking spytt kan utføres som suger en lollipop, vil prosedyren unngå degradering av spitted spytt i samlingen enheter 13-14. Viktigere, vil det også bli mulig å overvåke pasienter dynamisk og lokalt fra munnhulen. I tillegg, hvis prøveopparbeidelse bruker spytt kan forenkles, ville klinikere lett anlitate prosedyren for å fremskynde sin avgjørelse på neste klinisk drift. Massespektrometri er en av de mest følsomme teknikker for å oppdage og selv sekvens proteiner i en svært kort periode av tid. Imidlertid har kompliserte prosedyrer for prøveopparbeidelse hemmet bruker denne teknikken i klinikken. Videre er det kjent at høyere overflod proteiner eller proteiner med høy molekylvekt i kliniske prøver (f.eks amylase i spytt) maske lav overflod proteiner i massespektrometrisk analyse 15-16. For å overvinne hindrene nevnt ovenfor, har vi utviklet en lollipop-lignende ultrafiltrasjon enhet kalt LLUF prober (figur 1). Et negativt ladet polyetersulfon membran med en MWCO på 30 kDa (Figur 1a, a) ble limt fast til en polypropylen padle (Figur 1A, b). Den ble plassert foran LLUF sonde med tanke på å filtrere ut større proteiner i spyttet. Å etterligne den menneskelige muntlig miljø (Figur 1A, g), Ble en svamp (Figur 1A, e) dynket i spytt i en kultur tallerken (Figur 1A, f). Etter fullt uttak sprøyten (figur 1A, d), startet filtrert spytt beveger seg langs en tilkoblet rør (figur 1A, c) og ble samlet inn.
2. Identifisering av urfolk spytt peptidome av NanoLC-LTQ MS
Sammenligning av LC kromatogrammer, fant vi tydelige kromatogrammer av spytt før og etter LLUF prøvetaking (Figur 2), indikerer at det finnes ulike protein komposisjoner i spytt etter LLUF prøvetaking. For å bestemme protein komposisjoner, benyttet vi NanoLC-LTQ massespektrometri som er kjent for å være i stand til straks sekvens peptider fra en multippel protein blanding. Enda viktigere, for å forenkle prøveopparbeidelse for kliniske formål, ble hele spytt uten kjemisk eller enzymatisk fordøyelse søkt NanoLC-LTQ MS analyse. Uventet, 131 peptider vire identifisert i ufordøyd spytt (Supplemental tabell 1). Disse peptidene er fragmenter fra ulike Proline rike proteiner, aktin, alfa amylase, alpha 1 globin, beta globin, histain 1, keratin 1, mucin 7, polymeriske immunglobulin reseptoren, satherin, og S100A9. Twenty-seks unike peptider ble identifisert i spytt etter filtrering med LLUF prober (Supplemental tabell 2). Disse peptidene er fragmenter i hovedsak hentet fra ulike prolin-rike proteiner. Peptider som stammer fra proteiner som polymere immunglobulin reseptoren (83.24 kDa) og alfa amylase, var umulig å oppdage, demonstrere evnen LLUF sonder i fjerning av større og rikelig proteiner. En MS / MS spekteret av PFIAIHAEAESKL peptid som tilsvarer en intern peptid av alfa-amylase er illustrert i figur 3A. Mest intrigere, etter fjerning større proteiner, ble 18 av 26 sekvensert peptider påvises i det LLUF probe-samplet spytt (tabell1). Disse 18 peptidene ble avledet fra prolin-rike proteiner eller hypotetiske proteiner som endte med en prolin (P) -. Glutamin (Q) (-PQ),-SR,-SP eller-PP C-terminus Figur 3B viser en MS / MS spekteret av PQGPPQQGGHPRPP peptid som ble oppdaget i LLUF probe-samplet spytt. Peptid kan være avledet fra prolin-rike protein HaeIII underfamilie 1 og 2 (tabell 1).
Figur 1. Komposisjoner av LLUF prober og prøvetaking av hele spytt fra etterligne menneskelige munnhulen Panel A: (a) en semi-permeabel polyetersulfon med en MWCO av 30 kDa, (b) en polypropylen padle, (c) en teflon fluorisert etylen propylen tube; (d) en 20 ml sprøyte Panel B:. en svamp (e) (en etterlignet tunge) ble dynket i en kultur fat (f) som inneholder menneskelig spytt for å skapeen kunstig menneske munnhulen (g). Den resulterende undertrykk opprettet av fullt trekke en sprøyte driver samles væsken å bevege seg langs en tilkoblet rør (pil) og mot et skapt rom (pilspiss) innen sprøyte. Bar: 2,0 cm.
Figur 2. Differential LC / MS / MS kromatogrammer av spytt før og etter LLUF prøvetaking. Proteiner (1,0 mikrogram / mL) i human hele spytt ble filtrert uten eller med en LLUF sonde. Proteiner uten tryptic fordøyelsen ble direkte utsatt for NanoLC-LTQ MS som var konjugert med en Eksigent Nano LC system som beskrevet i Materiale og metode. Base-peak kromatogrammer (med 44-MIM retensjonstider) av spytt før (A) og etter (B) LLUF prøvetaking ble illustrert.
Figur 3. Detecsjon av spytt peptidome ved NanoLC-LTQ MS sekvensering. Spytt proteiner før (A) og etter (B) prøvetaking med LLUF prober ble analysert ved NanoLC-LTQ MS som beskrevet i eksperimentelle prosedyrer. Spytt peptidome avledet fra naturlig menneskelig spytt uten tryptic fordøyelsen ble påvist i supplerende tabell 1 og 2. Et peptid (PFIAIHAEAESKL) avledet fra alfa-amylase ble utelukkende oppdaget i en spytt prøve uten samling med LLUF prober (A), illustrerer at evnen til LLUF sonder i å fjerne store proteiner. Mange peptider med-PQ,-SR,-SP eller-PP C-Termini var utelukkende i prøvene etter ultrafiltrasjon LLUF sonder. Ett (PQGPPQQGGHPRPP) av peptider som stammer fra ulike Proline rike proteiner ble vist (B). MS / MS spektra med karakteristiske "y" og "B"-serien ioner bekreftet identiteten til begge peptider.
<strong> Figur 4. Fjerning av orale bakterier som bruker under LLUF sonder. En LLUF sonde ble bygget som beskrevet i Materialer og metoder. Sonden ble plassert inn i den menneskelige spytt innenfor en imiterte muntlig miljø (Figur 1). Sprøyten i slutten av LLUF sonden ble trukket tilbake for å skape et undertrykk som kjørte ultrafiltrasjon prosessen for spytt prøvetaking. Under prøvetaking, krysset hele spytt selektivt gjennom polyetersulfon membranen og akkumulert i en sprøyte. Hele spytt før prøvetaking med en LLUF sonde fungert som en kontroll. Spytt (10 mL) før og etter LLUF sonde prøvetaking ble spredt på agar plater for bakteriell deteksjon Panel A:. Spytt med (+ LLUF) og uten (+ LLUF) LLUF sonde prøvetaking ble spredt side-by-side på en antibiotika-fri LB agar plate ved 37 ° C for en dag Panel B:. Spytt med og uten LLUF sonde prøvetaking ble spredt på en antibiotika-free Brucella buljong agarskålunder anaerobe forhold ved hjelp av gass-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) ved 37 ° C for en dag. Bakterier vokste ikke på agar plater spredt med LLUF probe-samplet spytt, demonstrere evnen LLCF sonder i eliminerer aerobic samt anaerobe muntlige bakterier. Bar: 1,0 cm.
| Peptidsekvens / Measured peptid masse | Tiltredelse nummer | Navn | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485.3 | GI | 41349484 | Proline-rik protein BstNI underfamilie en isoformen 2 forløper |
| GI | 41349482 | Proline-rik protein BstNI underfamilie en isoformen en forløper | ||
| GI | 60301553 | Proline-rik protein BstNI underfamilie 2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576.9 | GI | 4826944 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 2 |
| GI | 9945310 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 1 | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126.2 | GI | 37537692 | Proline-rik protein BstNI underfamilie 4 forløper |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028.3 | GI | 113423660 | Spådd: hypotetisk protein |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077.8 | GI | 113423262 | Spådd: hypotetisk protein isoformen 5 |
| GI | 41349482 | Proline-rik protein BSTNI underfamilie en isoformen en forløper | ||
| GI | 60301553 | Proline-rik protein BstNI underfamilie 2 | ||
| GI | 113423663 | Spådd: hypotetisk protein | ||
| GI | 41349484 | Proline-rik protein BstNI underfamilie en isoformen 2 forløper | ||
| GI | 41349486 | Proline-rik protein BstNI underfamilie en isoformen 3 forløper | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918.5 | GI | 9945310 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 1 |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131.3 | GI | 113423660 | Spådd: hypotetisk protein |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | GI | 113423663 | Spådd: hypotetisk protein |
| GI | 41349482 | Proline-rik protein BstNI underfamilie en isoformen en forløper | ||
| GI | 113423262 | Spådd: hypotetisk protein isoformen 5 | ||
| GI | 60301553 | Proline-rik protein BstNI underfamilie 2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866.6 | GI | 4826944 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713.8 | GI | 9945310 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 1 |
| GI | 4826944 Proline-rik protein HaeIII underfamilie 2 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083.1 | GI | 9945310 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 1 |
| GI | 4826944 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512.6 | GI | 4826944 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 2 |
| GI | 9945310 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 1 | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720.2 | GI | 113423262 | Spådd: hypotetisk protein isoformen 5 |
| GI | 113423663 | Spådd: hypothetical protein | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450.1 | GI | 9945310 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 1 |
| GI | 4826944 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791.1 | GI | 4826944 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 2 |
| GI | 9945310 | Proline-rik protein HaeIII underfamilie 1 | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186.9 | GI | 113423262 | Spådd: hypotetisk protein isoformen 5 |
| GI | 41349482 | Proline-rik protein BstNI underfamilie en isoformen en forløper | ||
| GI | 60301553 | Proline-rik protein BstNI underfamilie 2 | ||
| GI | 113423663 | Spådd: hypotetisk protein | ||
| GI | 41349484 | Proline-rik protein BstNI underfamilie en isoformen 2 forløper | ||
| GI | 41349486 | Proline-rik protein BstNI underfamilie en isoformen 3 forløper | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720.3 | GI | 113423663 | Spådd: hypotetisk protein |
| GI | 41349482 | Proline-rik protein BstNI underfamilie en isoformen en forløper | ||
| GI | 113423262 | Spådd: hypotetisk protein isoformen 5 | ||
| GI | 60301553 | Proline-rik protein BstNI underfamilie 2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870.9 | GI | 37537692 | Proline-rik protein BstNI underfamilie 4 forløper |
Tabell 1. Peptider var utelukkende påvises i LLUF-innsamlede prøver.
Supplemental Tabell 1. Klikk her for å vise supplerende Tabell 1 .
Supplemental Tabell 2. Klikk her for å vise supplerende Tabell 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har funnet at mange peptidfragmenter eksisterer i menneskets ufordøyd spytt. Disse peptidfragmenter er derivater fra ulike former for prolin-rike proteiner, aktin, alfa amylase, alpha 1 globin, beta globin, histain 1, keratin 1, mucin 7, polymeriske immunglobulin reseptoren, satherin, S100A9. Det kan være mange faktorer som bidrar til produksjon av peptider med undetermined kutteseter. For eksempel kan noen peptidfragmenter være naturlig tilstede i menneskelig helhet spytt. Mange peptider med-PQ C-Termini ble identifisert (Tabell 1 og supplerende tabell 1 og 2). Proline-rike proteiner kan klassifiseres som sure, grunnleggende eller glykosylert proteiner og er kodet av seks gener som er samlet i en enkelt region 17. Mer enn tretti forskjellige prolin-rike proteiner resultat fra alleliske variasjon, differensial RNA-spleising, proteolytisk prosessering, og posttranslasjonelle modifikasjoner 17. Etter sekresjon, den sure Proline-rik protEins raskt knyttet til tann overflater og degradert til potensielle medfødt immunitet peptider av plakk proteolyse 18-19. Både gram-negative og gram-positive bakterier uttrykke en rekke glycosidases og proteaser 18. Det har blitt rapportert at sure prolin-rike proteiner kan være degradert til potensielle medfødt-immunitet-lignende peptider ved oral Streptococcus og Actinomyces arter 18. Den Glutamin (Gln) - Glycine (Gly) cleavage er biologisk kritisk med hensyn til bakteriell nedbrytning av spytt sure Proline rike proteiner og produksjon av en bakterie-bindende-PQ C-terminus 18, 20-22. Bindingen av-PQ Termini av prolin-rike proteiner til bakterier ble bekreftet av en in vitro eksperiment ved hjelp av en syntetisk RGRPQ pentapeptide 18. Etter avtale med våre data, var SJ Fisher-gruppen i stand til å identifisere flere peptider med-PQ C-Termini i ufordøyd menneskelige parotid spytt 23,tyder flere peptider med-PQ C-Termini kan indigenously eksistere i menneskelig helhet spytt. Menneskelig spytt inneholder flere peptider med-PQ C-termini som kan fungere som medfødt-immunitet-lignende peptider 18, 19. Når oral bakterier er til stede, kan Proline-rike proteiner umiddelbart bryte ned til ulike fragmenter med-PQ C-Termini for å effektivt drepe bakteriene.
En annen grunn til peptidfragmenter eksisterende i ufordøyd spytt er at noen av de endogene proteaser stede i hele spytt kan forbli aktive under tillagingen 24-25. Den cleavage forekommende i disse proteinene ved endogene proteaser i munnhulen sannsynlig fortsatte før massespektrometri analyse. For eksempel kan mucin spaltes av spytt protease ned til en mindre form som er mer kompetent i bakteriell clearance 26. Det er også mulig at proteaser fra muntlige bakterier kan kløve muntlige proteiner før eller etter spytt collection. Det har blitt dokumentert at flere spytt proteiner kan hakkes med proteaser fra oral Streptococcus og Actinomyces arter 27-29.
Den semi-permeabel membran er en nøkkelkomponent i LLUF sonder. Membranen er nødvendig for å selektivt fjerne større stoffer, inkludert proteiner, muntlige bakterier og rusk. LLUF fungerer som en selektiv barriere som tillater passasje av visse komponenter og avviser andre komponenter innenfor en kunstig munnhulen. Den semi-permeabel membran gjør lite molekyl til å passere gjennom membranen, mens eksklusive makromolekyler. Nyere data fra vårt laboratorium viste at LLUF prober kan effektivt fjerne både aerob og anaerob munnbakterier (figur 4). Spytt prøver før og etter samlingen med LLUF prober ble spredt på antibiotika-free agar plater og inkubert under aerobe og anaerobe forhold. Bakterier vokste ikke når agar plater ble spredd med LLUF probe-samplet spytt, demonstrere evnen LLUF sonder i fjerne aerobe og anaerobe muntlige bakterier. Vi søkte alle spektra med et menneskelig database som ikke inneholder protein databaser av menneskelige orale mikrober. Identifisering av proteomet / peptidome av muntlige mikrober vil bli mulig hvis en omfattende protein database med alle muntlige mikrober kan etableres. En organisk (polyetersulfon) membran ble brukt til å dikte de LLUF sonder. Selv om membranen var kjent for å ha en 30 kDa MWCO, prøvetaking ytelsen også avhengig av andre faktorer som interaksjon av spytt proteiner til negative heftelser på memebranoverflaten 30. Endringene i pH verdier og temperatur, samt protein kompleksiteten i munnhulen påvirker også prøvetaking ytelse. Våre data viser at 18 peptider var utelukkende tilstede i LLUF probe-samplet spytt (tabell 1). Peptider endte med-PQ,-SR,-SP eller-PP C-Termini er i hovedsak hentet fra prolin-rike proteins. Det har blitt rapportert at netto negativt ladet prolin-rike proteiner vist en sterk adsorpsjon til en negativt ladet overflate 31.
I sammendraget, kan i et forsøk på å oppdage spesifikke grupper av proteiner i fremtiden, semi-permeable membraner foran LLUF prober endres ved hjelp av ulike porestørrelser og materialer som har forskjellige overflate kostnader. For eksempel, membrananlegg membraner med porestørrelser varierer fra 0,05 micron til en nanometer kan skille virus fra spytt prøvene 32. LLUF prober også kan anvendes for å overvåke konsentrasjonen av ulike substanser som glukose og laktat i spytt prøvene. Selv ultrafiltrasjon membraner har gjort bruk av protein atskillelse via sentrifugal ultrafiltrasjon 33, har de sjelden blitt brukt til å samle proteiner via anvendelsen av undertrykk over en semipermeabel membran. Knytte de LLUF sondene med avansert massespektrometer som Fourier transform ion syklotronen resonans (FT-ICR) kan tillate identifikasjon av den intakte spytt proteiner 34-35. Spesielt, kan on-line analyse av dynamiske mønstre av spytt proteomet og peptidome være avgjørende for den kliniske anvendelsen av LLUF sonder. Etter samlingen med LLUF sonder, ble mange peptidfragmenter avledet fra prolin-rike proteiner identifisert fra ufordøyd hele spytt. Proline-rike proteiner kan interagere med orale bakterier til å påvirke utviklingen av tannråte 36 og kan være betydelig i å beskytte slimhinnene overflater fra virusinfeksjon 37. Videre har det blitt dokumentert at uttrykket av prolin-rike proteiner ble endret i de pasienter med revmatoid artritt 38. Disse studiene sterkt støtte at prolin-rike proteiner innhentet av LLUF prober kan tjene som biomarkører for overvåking ulike menneskelige sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants (R01-AI067395-01, R21-R022754-01, og R21-I58002-01). Vi takker C. Niemeyer for kritisk lesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
